用DNA 條形碼鑒定常見(jiàn)魚翅的種類與真?zhèn)?/h1>
2021-01-15 02:07:04熊娟黃啟紅陳敏兒方軍
水產(chǎn)學(xué)雜志 2020年6期
熊娟，黃啟紅，陳敏兒，方軍
（廣東省科學(xué)院，廣東省測(cè)試分析研究所（中國(guó)廣州分析測(cè)試中心），廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省保健食品功效成分檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070）
廣東省素被譽(yù)為養(yǎng)生大省，而魚翅作為廣東著名的養(yǎng)生保健佳品，一直深受人民的喜愛(ài)，價(jià)格一度水漲船高。市場(chǎng)流通多為加工后的干魚翅制品，但鯊魚種類繁多，相似物種之間外觀形態(tài)差異小，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定難以保證干魚翅制品標(biāo)識(shí)的準(zhǔn)確性[1-3]，不良商家以次充好，更有不法生產(chǎn)者從瀕危鯊魚上采集魚翅。本文建立的魚翅DNA 條形碼技術(shù)能更好地規(guī)范廣東省魚翅市場(chǎng)標(biāo)識(shí)亂象，進(jìn)一步保護(hù)瀕危鯊魚[4]。
DNA 條形碼技術(shù)是利用生物體線粒體DNA 中一段保守片段對(duì)物種進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的分子生物學(xué)鑒定[5,6]。2005 年，國(guó)際已開始合作實(shí)施魚類生命條形碼計(jì)劃（FISH-BOL），該計(jì)劃以電子數(shù)據(jù)庫(kù)形式構(gòu)建含有DNA 條形碼圖像和地理坐標(biāo)的全球魚類參考標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)[7,8]。Ward 等[7]利用條形碼方法分析了澳大利亞超過(guò)200 種海洋魚類和印度洋沿岸35 種魚類，表明南非與澳洲海域的魚類之間存在較大差異，地域群系之間種內(nèi)差異性顯著。N-J 進(jìn)化樹分析結(jié)論表明，能夠使用線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I（Cytochrome Oxidase subunit I，COI）作為海洋魚類的DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列[9]。
本研究中，魚翅制品屬致密結(jié)締組織，含有豐富的硫酸多糖，去除多糖一直是DNA 提取面臨的主要難題。傳統(tǒng)提取方法獲得的DNA 純度低，往往造成后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)失敗，所以高效的提取魚翅DNA 是整個(gè)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的前提。本研究比較了傳統(tǒng)DNA 提取法和不同DNA 試劑盒提取法，以獲取適合干魚翅制品的方法，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。提取后的干魚翅制品DNA 經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、測(cè)序、進(jìn)化分析，以證明該DNA 條形碼方法對(duì)廣東省干魚翅制品鑒定的適用性。
1 材料與方法
1.1 材料
本研究所用魚翅均由廣州市海味干果行業(yè)商會(huì)提供，其中用于DNA 提取效果研究的6 種魚翅為市面上常見(jiàn)的正品魚翅，并從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行物種鑒定，確保品質(zhì)正宗，物種明確，包括：20 沙青片（低鰭真鯊Carcharhinus leucas）、蝶勾（尖齒檸檬鯊Negaprion acutidens）、牙勾（大青鯊Prionace glauca）、8寸五羊勾（絲鯊Carcharhinus falciformis）、10 上勿骨勾（淺海長(zhǎng)尾鯊Alopias pelagicus）和白蟬片（尖吻斜鋸牙鯊Rhizoprionodon acutus）。鑒定后的魚翅作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。用于魚翅DNA 條形碼研究的35 種魚翅來(lái)源于廣東省市場(chǎng)流通魚翅，其中2 種是以明膠為主要原料制作的假魚翅，為陰性對(duì)照。
利用經(jīng)典CTAB 法、廣州雙螺旋生物科技有限公司生產(chǎn)的動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒和QIAGEN 公司生產(chǎn)的DNeasy mericon Food Kit 試劑盒提取正品魚翅DNA，采用廣州維伯鑫生物科技有限公司生產(chǎn)的魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光-PCR 法）檢測(cè)DNA 提取效果。
魚翅COI 通用引物參考Ward 等[9]篩選出的DNA 條形碼通用引物，對(duì)提取的樣品魚翅DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，目的片段為COI 基因靠近5’末端，長(zhǎng)度為680 bp 左右的序列，引物序列為：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’，5’-TAGACTTC TGGGTGGCCAAAGAATCA-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定后序列在BOLD（http://www.Boldsys tems.org）以及NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定以及相似度分析，并采用Mega 6.06 構(gòu)建相應(yīng)COI 序列的N-J 進(jìn)化樹、DNAMan 構(gòu)建相應(yīng)COI 序列的聚類同源樹。
1.2 儀器與設(shè)備
高速臺(tái)式離心機(jī)，5418R，德國(guó)Eppendorf；基因擴(kuò)增儀，L96G，杭州朗基；熒光定量PCR 儀，7500，Applied Biosystems；微量移液器，1 000 μL、200 μL、100 μL、10 μL，德國(guó)Eppendorf；生物安全柜，BSC-100011B2，蘇凈安泰；凝膠成像系統(tǒng)，WD-9413B，北京六一。
1.3 方法
1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理
用滅菌二次水充分清潔干魚翅樣品表面，并用95%的酒精輕柔擦拭魚翅表面，清除魚翅表面的雜質(zhì)與灰塵，在烘箱內(nèi)烘干；用滅菌手術(shù)剪刀剪下約50 g 魚翅樣品，盡量剪碎放入研磨機(jī)中，20 000 r/min 研磨20 min，觀察樣品粉碎情況。
1.3.2 DNA 提取
經(jīng)典CTAB 法參照《參考分子克隆》[10]動(dòng)物DNA 提取方法，動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒和DNeasy mericon Food Kit 均參照商品說(shuō)明書。
用魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒分析提取DNA的純度。25 μL 的反應(yīng)體系，其成分包括：20 μL 的fish 反應(yīng)液，酶液1 μL，樣品DNA，陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控各4 μL。設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋篐olding Stage 95 ℃10 min，1 個(gè)循環(huán)；Cycling Stage 為95℃15 s，55 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)，并收集熒光信號(hào)。
1.3.3 DNA 條形碼PCR 反應(yīng)體系
以提取的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25.0 μL PCR 反應(yīng)體系如下：10x PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL、模板用量根據(jù)PCR 擴(kuò)增情況而變化，加水補(bǔ)至25 μL。
PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。
1.3.4 DNA 條形碼PCR 產(chǎn)物分析
用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得的樣品DNA 條形碼PCR 產(chǎn)物，將在680 bp 位置有條帶的PCR 產(chǎn)物送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序和序列拼接，獲取680 bp 左右的COI 序列。
搜索BOLD 以及NCBI 網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù),鑒定樣品的COI 序列，比對(duì)分析相似度，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，自NCBI 中下載相關(guān)鯊類物種COI 序列。將整理后的樣品DNA 序列和GenBank 下載的相關(guān)序列應(yīng)用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，基于鄰接法（N-J）構(gòu)建進(jìn)化樹，選用K2P 替代模型，Bootstrap 自展檢測(cè)1000 次。同時(shí)應(yīng)用DNAMan 構(gòu)建相應(yīng)COI 序列的聚類同源樹。
2 結(jié)果與分析
2.1 DNA 提取及效果分析
根據(jù)魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光-PCR法）說(shuō)明書，擴(kuò)增閾值（CT）≤40 判定為檢出魚源性，表示提取魚翅DNA 成功；CT＞40 判定為未檢出魚源性，表示提取魚魚翅DNA 失敗。同一擴(kuò)增條件下，CT 值越小，表示初始擴(kuò)增模板濃度越高；CT 值越大，表示初始擴(kuò)增模板濃度越低。結(jié)果顯示，經(jīng)典CTAB 法提取成功3 個(gè)樣品，動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取成功5 個(gè)樣品，DNeasy mericon Food Kit 試劑盒提取成功6 個(gè)樣品（表1）。樣品3 采用經(jīng)典CTAB 法提取DNA 的CT 值小于動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒提取DNA 的CT 值；而采用DNeasy mericon Food Kit 提取DNA 的所有樣品CT 值均小于采用經(jīng)典CTAB 法和動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒提取的DNACT 值，說(shuō)明DNeasy mericon Food Kit 提取的DNA 濃度明顯高于另外兩種方法提取的DNA 濃度。
2.2 DNA 條形碼獲取序列比對(duì)結(jié)果
根據(jù)研究結(jié)果，采用DNeasy mericon Food Kit的方法提取DNA。通過(guò)PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，有5 個(gè)干魚翅樣品（sample11、sample28、sample31、sample34和sample35）無(wú)法擴(kuò)增成功，其中sample34 和sample 35 為明膠制品，所以無(wú)法擴(kuò)增出目的片段。而sample11、sample28 和sample31 用魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)閾值均＞40，可能原因是在干魚翅的加工過(guò)程中DNA 嚴(yán)重降解，無(wú)法提取足量的DNA 進(jìn)行后續(xù)研究。
本研究獲得了30 個(gè)魚翅個(gè)體的線粒體COI 基因序列。該序列是位于COI 基因5’端一段約為680 bp 的片段。將獲得的COI 序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)及聚類分析鑒定，鑒定結(jié)果如表2 所示。30 個(gè)魚翅分別來(lái)源于13 種鯊魚物種：低鰭真鯊Carcharhinus leucas、大青鯊Prionace glauca、尖吻鯖鯊Isurus oxyrinchus、尖吻斜鋸牙鯊Rhizoprionodon acutus、路氏雙髻鯊Sphyrna lewini、Glaucostegus cemiculus（犁頭鰩科）、絲鯊Carcharhinus falciformis、無(wú)溝雙髻鯊Sphyrna mokarran、尖齒檸檬鯊Negaprion acutidens、舒氏星鯊Mustelus schmitti、高鰭真鯊Carcharhinus amboinensis、淺海長(zhǎng)尾鯊Alopias pelagicus、沙拉真鯊Carcharhinus sorrah。從樣品來(lái)源分析得出：6 個(gè)樣品來(lái)源于大青鯊，5 個(gè)樣品來(lái)源于絲鯊，4 個(gè)樣品來(lái)源于尖吻斜鋸牙鯊，4 個(gè)樣品來(lái)源于路氏雙髻鯊，其他樣品的來(lái)源比較零星分散，說(shuō)明市面上的魚翅多采用大青鯊、絲鯊、尖吻斜鋸牙鯊和路氏雙髻鯊加工而成，偶有其他種類的加工制品；從分類階元分析得出：4 種來(lái)源于真鯊屬，7 種來(lái)源于真鯊科，10 種來(lái)源于真鯊目，說(shuō)明真鯊目的魚類適合于加工魚翅制品，其中又以真鯊科真鯊屬的魚類采用的最多。這13 種鯊魚物種基本涵蓋市面上常見(jiàn)的魚翅物種，從NCBI 中下載這13 種鯊魚物種相似度達(dá)97%的基因序列共32 條，另外下載市面常見(jiàn)魚翅物種Isurus paucus（長(zhǎng)鰭鯖鯊，鯖鯊屬、鯖鯊科、鯖鯊目）基因序列2 條，共計(jì)64 尾鯊魚基因作為日常實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的基因庫(kù)。
表1 不同方法獲得的DNA 濃度比較結(jié)果Tab.1 The comparison of DNA concentration obtained by different methods
2.3 構(gòu)建進(jìn)化樹和同源樹
構(gòu)建64 尾鯊魚基因的分子系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖1），同一個(gè)物種的不同個(gè)體基本都能形成單系，節(jié)點(diǎn)支持率大都為99%～100%，但同科聚類效果不是很明顯。如真鯊目中，真鯊科的7 種物種和雙髻鯊科的2 種物種節(jié)點(diǎn)支持率僅為78%。而不同目間的遺傳距離明顯更大，這與傳統(tǒng)的鯊魚分類學(xué)結(jié)果一致，證明了鯊魚線粒體COI 基因種內(nèi)具有高度的保守性，種間具有明顯的差異性。
同時(shí)進(jìn)行的64 尾鯊魚基因聚類分析顯示（圖2），同一物種都位于同一分支，且不同個(gè)體的魚類的COI 序列相似度均大于95%，說(shuō)明DNA 條形碼技術(shù)鑒別魚類較為準(zhǔn)確，不隨個(gè)體有較大的變化；不同魚類物種相似度各不相同，其中真鯊科和雙髻鯊科的屬間相似度均為89%，而真鯊目三個(gè)屬間的相似度為87%，分類階元越高，相似度逐漸下降，最低相似度為76%。構(gòu)建的同源樹不僅能反應(yīng)不同魚類的親緣關(guān)系，還能直接看出不同魚類COI 序列的相似度，表明親緣關(guān)系較近的物種，特別是聚類到一個(gè)種類的物種可以通過(guò)DNA 條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒別。
3 討論
本文采用經(jīng)典CTAB 法和試劑盒提取不同魚翅制品的DNA。一般采用微量核酸蛋白測(cè)定儀定量分析DNA 來(lái)檢測(cè)DNA 的純度，但并不能完全反映DNA 中的雜質(zhì)，需要采用凝膠電泳進(jìn)一步確認(rèn)，過(guò)程相對(duì)繁瑣，準(zhǔn)確度較低。本文通過(guò)魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定提取DNA 的閾值，分析出提取DNA 的濃度，直接分析目的基因的濃度，排除其他因素的干擾[11,12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DNeasymericon Food Kit 提取的DNA 含量明顯高于另外兩種方法提取的DNA 含量，更適合作為本實(shí)驗(yàn)中魚翅的提取方法。
近年DNA 條形碼技術(shù)在海洋魚類的鑒定上也取得了較好的鑒定效果，但鑒定對(duì)象多為新鮮或是冰凍魚類。這些魚類大多細(xì)胞組織保存完好，而針對(duì)市售魚翅的DNA 條形碼鑒定鮮有報(bào)道[13-18]。廣東省做為魚翅制品銷售流通的大省，對(duì)魚翅標(biāo)識(shí)需要更完善和更精確的鑒別技術(shù)。本研究在35 種市場(chǎng)流通魚翅中，獲得了30 個(gè)魚翅個(gè)體的線粒體COI基因序列，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不可避免出現(xiàn)擴(kuò)增失敗的情況，原因可能是DNA 在魚翅制品加工過(guò)程中發(fā)生了降解[19]。通過(guò)NCBI 比對(duì)，選取基因序列相似度達(dá)到90%以上的物種作為同源物種。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，30 個(gè)魚翅分別來(lái)源于13 種鯊魚物種。
表2 不同魚翅在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定結(jié)果Tab.2 Identification results of different sharks in the NCBI database
圖1 64 尾魚翅的COI 序列N-J 進(jìn)化樹Fig.1 Neighbor Joining tree based on COI sequences of sixty-four sharks
圖2 64 尾魚翅的COI 序列的聚類同源樹Fig.2 Homology tree based on COI sequences of sixtyfour sharks
對(duì)于物種序列同源性較高的COI 序列，DNA 條形碼技術(shù)推薦采用基于遺傳距離的Neighbor Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹[20,21]。這種方法處理較多的COI 序列時(shí)，速度較快并能反映出物種間的親緣關(guān)系。本研究獲取的序列同源性比較高，大多為真鯊目和鯖鯊目物種，僅有一例為犁頭鰩科鰩形目。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用的聚類同源樹分析顯示：同種魚翅樣品的序列因分類親和性而與相關(guān)參考序列聚在一起，形成一個(gè)聚類關(guān)系，以此可根據(jù)NCBI 中參考序列的物種信息確定樣品所屬分類。由此可以得出結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的DNA 條形碼方法適用于魚翅制品的鑒定研究，且大多可以鑒定到種的水平。
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熊娟，黃啟紅，陳敏兒，方軍
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廣東省素被譽(yù)為養(yǎng)生大省，而魚翅作為廣東著名的養(yǎng)生保健佳品，一直深受人民的喜愛(ài)，價(jià)格一度水漲船高。市場(chǎng)流通多為加工后的干魚翅制品，但鯊魚種類繁多，相似物種之間外觀形態(tài)差異小，傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定難以保證干魚翅制品標(biāo)識(shí)的準(zhǔn)確性[1-3]，不良商家以次充好，更有不法生產(chǎn)者從瀕危鯊魚上采集魚翅。本文建立的魚翅DNA 條形碼技術(shù)能更好地規(guī)范廣東省魚翅市場(chǎng)標(biāo)識(shí)亂象，進(jìn)一步保護(hù)瀕危鯊魚[4]。
DNA 條形碼技術(shù)是利用生物體線粒體DNA 中一段保守片段對(duì)物種進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的分子生物學(xué)鑒定[5,6]。2005 年，國(guó)際已開始合作實(shí)施魚類生命條形碼計(jì)劃（FISH-BOL），該計(jì)劃以電子數(shù)據(jù)庫(kù)形式構(gòu)建含有DNA 條形碼圖像和地理坐標(biāo)的全球魚類參考標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)[7,8]。Ward 等[7]利用條形碼方法分析了澳大利亞超過(guò)200 種海洋魚類和印度洋沿岸35 種魚類，表明南非與澳洲海域的魚類之間存在較大差異，地域群系之間種內(nèi)差異性顯著。N-J 進(jìn)化樹分析結(jié)論表明，能夠使用線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I（Cytochrome Oxidase subunit I，COI）作為海洋魚類的DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列[9]。
本研究中，魚翅制品屬致密結(jié)締組織，含有豐富的硫酸多糖，去除多糖一直是DNA 提取面臨的主要難題。傳統(tǒng)提取方法獲得的DNA 純度低，往往造成后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)失敗，所以高效的提取魚翅DNA 是整個(gè)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的前提。本研究比較了傳統(tǒng)DNA 提取法和不同DNA 試劑盒提取法，以獲取適合干魚翅制品的方法，保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。提取后的干魚翅制品DNA 經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、測(cè)序、進(jìn)化分析，以證明該DNA 條形碼方法對(duì)廣東省干魚翅制品鑒定的適用性。
1 材料與方法
1.1 材料
本研究所用魚翅均由廣州市海味干果行業(yè)商會(huì)提供，其中用于DNA 提取效果研究的6 種魚翅為市面上常見(jiàn)的正品魚翅，并從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行物種鑒定，確保品質(zhì)正宗，物種明確，包括：20 沙青片（低鰭真鯊Carcharhinus leucas）、蝶勾（尖齒檸檬鯊Negaprion acutidens）、牙勾（大青鯊Prionace glauca）、8寸五羊勾（絲鯊Carcharhinus falciformis）、10 上勿骨勾（淺海長(zhǎng)尾鯊Alopias pelagicus）和白蟬片（尖吻斜鋸牙鯊Rhizoprionodon acutus）。鑒定后的魚翅作為標(biāo)準(zhǔn)樣品，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。用于魚翅DNA 條形碼研究的35 種魚翅來(lái)源于廣東省市場(chǎng)流通魚翅，其中2 種是以明膠為主要原料制作的假魚翅，為陰性對(duì)照。
利用經(jīng)典CTAB 法、廣州雙螺旋生物科技有限公司生產(chǎn)的動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒和QIAGEN 公司生產(chǎn)的DNeasy mericon Food Kit 試劑盒提取正品魚翅DNA，采用廣州維伯鑫生物科技有限公司生產(chǎn)的魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光-PCR 法）檢測(cè)DNA 提取效果。
魚翅COI 通用引物參考Ward 等[9]篩選出的DNA 條形碼通用引物，對(duì)提取的樣品魚翅DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，目的片段為COI 基因靠近5’末端，長(zhǎng)度為680 bp 左右的序列，引物序列為：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’，5’-TAGACTTC TGGGTGGCCAAAGAATCA-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定后序列在BOLD（http://www.Boldsys tems.org）以及NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov）網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定以及相似度分析，并采用Mega 6.06 構(gòu)建相應(yīng)COI 序列的N-J 進(jìn)化樹、DNAMan 構(gòu)建相應(yīng)COI 序列的聚類同源樹。
1.2 儀器與設(shè)備
高速臺(tái)式離心機(jī)，5418R，德國(guó)Eppendorf；基因擴(kuò)增儀，L96G，杭州朗基；熒光定量PCR 儀，7500，Applied Biosystems；微量移液器，1 000 μL、200 μL、100 μL、10 μL，德國(guó)Eppendorf；生物安全柜，BSC-100011B2，蘇凈安泰；凝膠成像系統(tǒng)，WD-9413B，北京六一。
1.3 方法
1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理
用滅菌二次水充分清潔干魚翅樣品表面，并用95%的酒精輕柔擦拭魚翅表面，清除魚翅表面的雜質(zhì)與灰塵，在烘箱內(nèi)烘干；用滅菌手術(shù)剪刀剪下約50 g 魚翅樣品，盡量剪碎放入研磨機(jī)中，20 000 r/min 研磨20 min，觀察樣品粉碎情況。
1.3.2 DNA 提取
經(jīng)典CTAB 法參照《參考分子克隆》[10]動(dòng)物DNA 提取方法，動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒和DNeasy mericon Food Kit 均參照商品說(shuō)明書。
用魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒分析提取DNA的純度。25 μL 的反應(yīng)體系，其成分包括：20 μL 的fish 反應(yīng)液，酶液1 μL，樣品DNA，陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控各4 μL。設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋篐olding Stage 95 ℃10 min，1 個(gè)循環(huán)；Cycling Stage 為95℃15 s，55 ℃1 min，40 個(gè)循環(huán)，并收集熒光信號(hào)。
1.3.3 DNA 條形碼PCR 反應(yīng)體系
以提取的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25.0 μL PCR 反應(yīng)體系如下：10x PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL、模板用量根據(jù)PCR 擴(kuò)增情況而變化，加水補(bǔ)至25 μL。
PCR 反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。
1.3.4 DNA 條形碼PCR 產(chǎn)物分析
用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得的樣品DNA 條形碼PCR 產(chǎn)物，將在680 bp 位置有條帶的PCR 產(chǎn)物送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序和序列拼接，獲取680 bp 左右的COI 序列。
搜索BOLD 以及NCBI 網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù),鑒定樣品的COI 序列，比對(duì)分析相似度，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，自NCBI 中下載相關(guān)鯊類物種COI 序列。將整理后的樣品DNA 序列和GenBank 下載的相關(guān)序列應(yīng)用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，基于鄰接法（N-J）構(gòu)建進(jìn)化樹，選用K2P 替代模型，Bootstrap 自展檢測(cè)1000 次。同時(shí)應(yīng)用DNAMan 構(gòu)建相應(yīng)COI 序列的聚類同源樹。
2 結(jié)果與分析
2.1 DNA 提取及效果分析
根據(jù)魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒（熒光-PCR法）說(shuō)明書，擴(kuò)增閾值（CT）≤40 判定為檢出魚源性，表示提取魚翅DNA 成功；CT＞40 判定為未檢出魚源性，表示提取魚魚翅DNA 失敗。同一擴(kuò)增條件下，CT 值越小，表示初始擴(kuò)增模板濃度越高；CT 值越大，表示初始擴(kuò)增模板濃度越低。結(jié)果顯示，經(jīng)典CTAB 法提取成功3 個(gè)樣品，動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取成功5 個(gè)樣品，DNeasy mericon Food Kit 試劑盒提取成功6 個(gè)樣品（表1）。樣品3 采用經(jīng)典CTAB 法提取DNA 的CT 值小于動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒提取DNA 的CT 值；而采用DNeasy mericon Food Kit 提取DNA 的所有樣品CT 值均小于采用經(jīng)典CTAB 法和動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒提取的DNACT 值，說(shuō)明DNeasy mericon Food Kit 提取的DNA 濃度明顯高于另外兩種方法提取的DNA 濃度。
2.2 DNA 條形碼獲取序列比對(duì)結(jié)果
根據(jù)研究結(jié)果，采用DNeasy mericon Food Kit的方法提取DNA。通過(guò)PCR 擴(kuò)增和測(cè)序，有5 個(gè)干魚翅樣品（sample11、sample28、sample31、sample34和sample35）無(wú)法擴(kuò)增成功，其中sample34 和sample 35 為明膠制品，所以無(wú)法擴(kuò)增出目的片段。而sample11、sample28 和sample31 用魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)閾值均＞40，可能原因是在干魚翅的加工過(guò)程中DNA 嚴(yán)重降解，無(wú)法提取足量的DNA 進(jìn)行后續(xù)研究。
本研究獲得了30 個(gè)魚翅個(gè)體的線粒體COI 基因序列。該序列是位于COI 基因5’端一段約為680 bp 的片段。將獲得的COI 序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)及聚類分析鑒定，鑒定結(jié)果如表2 所示。30 個(gè)魚翅分別來(lái)源于13 種鯊魚物種：低鰭真鯊Carcharhinus leucas、大青鯊Prionace glauca、尖吻鯖鯊Isurus oxyrinchus、尖吻斜鋸牙鯊Rhizoprionodon acutus、路氏雙髻鯊Sphyrna lewini、Glaucostegus cemiculus（犁頭鰩科）、絲鯊Carcharhinus falciformis、無(wú)溝雙髻鯊Sphyrna mokarran、尖齒檸檬鯊Negaprion acutidens、舒氏星鯊Mustelus schmitti、高鰭真鯊Carcharhinus amboinensis、淺海長(zhǎng)尾鯊Alopias pelagicus、沙拉真鯊Carcharhinus sorrah。從樣品來(lái)源分析得出：6 個(gè)樣品來(lái)源于大青鯊，5 個(gè)樣品來(lái)源于絲鯊，4 個(gè)樣品來(lái)源于尖吻斜鋸牙鯊，4 個(gè)樣品來(lái)源于路氏雙髻鯊，其他樣品的來(lái)源比較零星分散，說(shuō)明市面上的魚翅多采用大青鯊、絲鯊、尖吻斜鋸牙鯊和路氏雙髻鯊加工而成，偶有其他種類的加工制品；從分類階元分析得出：4 種來(lái)源于真鯊屬，7 種來(lái)源于真鯊科，10 種來(lái)源于真鯊目，說(shuō)明真鯊目的魚類適合于加工魚翅制品，其中又以真鯊科真鯊屬的魚類采用的最多。這13 種鯊魚物種基本涵蓋市面上常見(jiàn)的魚翅物種，從NCBI 中下載這13 種鯊魚物種相似度達(dá)97%的基因序列共32 條，另外下載市面常見(jiàn)魚翅物種Isurus paucus（長(zhǎng)鰭鯖鯊，鯖鯊屬、鯖鯊科、鯖鯊目）基因序列2 條，共計(jì)64 尾鯊魚基因作為日常實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的基因庫(kù)。
表1 不同方法獲得的DNA 濃度比較結(jié)果Tab.1 The comparison of DNA concentration obtained by different methods
2.3 構(gòu)建進(jìn)化樹和同源樹
構(gòu)建64 尾鯊魚基因的分子系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖1），同一個(gè)物種的不同個(gè)體基本都能形成單系，節(jié)點(diǎn)支持率大都為99%～100%，但同科聚類效果不是很明顯。如真鯊目中，真鯊科的7 種物種和雙髻鯊科的2 種物種節(jié)點(diǎn)支持率僅為78%。而不同目間的遺傳距離明顯更大，這與傳統(tǒng)的鯊魚分類學(xué)結(jié)果一致，證明了鯊魚線粒體COI 基因種內(nèi)具有高度的保守性，種間具有明顯的差異性。
同時(shí)進(jìn)行的64 尾鯊魚基因聚類分析顯示（圖2），同一物種都位于同一分支，且不同個(gè)體的魚類的COI 序列相似度均大于95%，說(shuō)明DNA 條形碼技術(shù)鑒別魚類較為準(zhǔn)確，不隨個(gè)體有較大的變化；不同魚類物種相似度各不相同，其中真鯊科和雙髻鯊科的屬間相似度均為89%，而真鯊目三個(gè)屬間的相似度為87%，分類階元越高，相似度逐漸下降，最低相似度為76%。構(gòu)建的同源樹不僅能反應(yīng)不同魚類的親緣關(guān)系，還能直接看出不同魚類COI 序列的相似度，表明親緣關(guān)系較近的物種，特別是聚類到一個(gè)種類的物種可以通過(guò)DNA 條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒別。
3 討論
本文采用經(jīng)典CTAB 法和試劑盒提取不同魚翅制品的DNA。一般采用微量核酸蛋白測(cè)定儀定量分析DNA 來(lái)檢測(cè)DNA 的純度，但并不能完全反映DNA 中的雜質(zhì)，需要采用凝膠電泳進(jìn)一步確認(rèn)，過(guò)程相對(duì)繁瑣，準(zhǔn)確度較低。本文通過(guò)魚源性（fish）核酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定提取DNA 的閾值，分析出提取DNA 的濃度，直接分析目的基因的濃度，排除其他因素的干擾[11,12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：DNeasymericon Food Kit 提取的DNA 含量明顯高于另外兩種方法提取的DNA 含量，更適合作為本實(shí)驗(yàn)中魚翅的提取方法。
近年DNA 條形碼技術(shù)在海洋魚類的鑒定上也取得了較好的鑒定效果，但鑒定對(duì)象多為新鮮或是冰凍魚類。這些魚類大多細(xì)胞組織保存完好，而針對(duì)市售魚翅的DNA 條形碼鑒定鮮有報(bào)道[13-18]。廣東省做為魚翅制品銷售流通的大省，對(duì)魚翅標(biāo)識(shí)需要更完善和更精確的鑒別技術(shù)。本研究在35 種市場(chǎng)流通魚翅中，獲得了30 個(gè)魚翅個(gè)體的線粒體COI基因序列，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不可避免出現(xiàn)擴(kuò)增失敗的情況，原因可能是DNA 在魚翅制品加工過(guò)程中發(fā)生了降解[19]。通過(guò)NCBI 比對(duì)，選取基因序列相似度達(dá)到90%以上的物種作為同源物種。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，30 個(gè)魚翅分別來(lái)源于13 種鯊魚物種。
表2 不同魚翅在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定結(jié)果Tab.2 Identification results of different sharks in the NCBI database
圖1 64 尾魚翅的COI 序列N-J 進(jìn)化樹Fig.1 Neighbor Joining tree based on COI sequences of sixty-four sharks
圖2 64 尾魚翅的COI 序列的聚類同源樹Fig.2 Homology tree based on COI sequences of sixtyfour sharks
對(duì)于物種序列同源性較高的COI 序列，DNA 條形碼技術(shù)推薦采用基于遺傳距離的Neighbor Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹[20,21]。這種方法處理較多的COI 序列時(shí)，速度較快并能反映出物種間的親緣關(guān)系。本研究獲取的序列同源性比較高，大多為真鯊目和鯖鯊目物種，僅有一例為犁頭鰩科鰩形目。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用的聚類同源樹分析顯示：同種魚翅樣品的序列因分類親和性而與相關(guān)參考序列聚在一起，形成一個(gè)聚類關(guān)系，以此可根據(jù)NCBI 中參考序列的物種信息確定樣品所屬分類。由此可以得出結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立的DNA 條形碼方法適用于魚翅制品的鑒定研究，且大多可以鑒定到種的水平。
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