多靶標受體酪氨酸激酶抑制劑的合成與初步活性篩選

單媛媛，劉婷婷，馬瑛，王茂義

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院藥學部，陜西 西安 710061)

查爾酮是一種重要的活性天然產(chǎn)物，其結構為1,3-二苯基-2-丙烯基-1-酮，廣泛存在于甘草、紅花等藥用植物[1]，具有抗真菌、抗炎、抗腫瘤等生物活性[2]，其抗腫瘤活性主要是對受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTKs)的抑制[3]。RTK在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮關鍵的作用，其中，表皮生長因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮細胞生長因子受體2(VEGFR-2)、成纖維細胞生長因子受體-1(FGFR1)3種RTKs的表達異常與多種腫瘤密切相關，已成為抗腫瘤藥物研究的有效靶標[4]。尤為重要的是，這3種RTKs具有高度保守的一級序列和三維結構，其配體結合位點和酪氨酸激酶催化區(qū)域高度相似，使得設計同時針對這3種RTKs的多靶標抑制劑成為可能，也有利于解決單靶標抑制劑的耐藥性的缺陷[5]。

基于查爾酮為先導化合物，設計并合成新型查爾酮衍生物類多靶標RTKs抑制劑，通過體外活性篩選有望發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的新型查爾酮衍生物[6]?；谝褕蟮缹TKs有抑制活性且結構對稱的聯(lián)苯化合物為先導物，首先采用分子剖裂原理將對稱的聯(lián)苯化合物破裂為兩分子苯氧基乙酰苯胺結構[7]，分析其結構發(fā)現(xiàn)：苯氧基乙酰苯胺結構與查爾酮的結構母核類似，而且其結構中不存在α，β-不飽和羰基共軛結構片段，因此不會與體內(nèi)谷胱甘肽的硫醇發(fā)生親電反應[8]，被谷胱甘肽還原，所以保留了查爾酮本身的藥效結構特征與生物活性[9]。在此基礎上，引入含有氫鍵供受體網(wǎng)絡的苯甲酰胺、溴代苯甲酰胺結構作為RTKs抑制劑的鉸鏈區(qū)結合基團[10]，并重點考察末端苯胺上不同取代基對活性的影響[11]，設計了查爾酮苯甲酰胺系列衍生物(查爾酮-BAA)(見圖1)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑 化合物合成所需的試劑按照標準操作流程處理，常用有機溶劑主要購自天津科密歐試劑公司、青島海洋化工有限公司、國藥集團試劑公司等。所用試劑除了有特殊說明之外均為分析純，合成操作中除水相反應外，其他實驗操作按照標準操作程序除水，無氧反應操作均在氮氣等惰性氣體保護下進行?；衔锖铣芍兴蟹磻ㄟ^薄層色譜(TLC)監(jiān)測反應進程。目標化合物及關鍵中間體的熔點采用予華儀器有限責任公司的X-4型數(shù)顯熔點測定儀測定(溫度未經(jīng)校正)。目標化合物的1H-NMR(400 MHz)由西安交通大學理學院核磁共振儀(Bruker Advance AC 400)測定，測試所用氘代溶劑為DMSO-d6和CDCl3，采用四甲基硅烷(TMS)為內(nèi)標，化學位移值δ單位為ppm。目標化合物的EI-MS由西安交通大學藥學院HPLC-MS-QP2010測定。

1.2 方法與結果

1.2.1 化合物的制備[12]基于以上結構優(yōu)化策略，完成了共35個查爾酮衍生物(查爾酮BAA1～35)的合成(合成路線1與合成路線2)。該系列化合物以異香草醛(1)為起始原料，首先以NaOH/KOH為氧化劑將異香草醛氧化為異香草酸(2)，然后將其羥基以芐基保護得到中間體(3)，再與氯化亞砜反應生成酰氯，將得到的酰氯分別與甲胺、異丙胺、二乙胺反應得到相應的苯甲酰胺關鍵中間體(4)。此外，將各種取代苯胺與氯乙酰氯反應得到相應的氯乙酰苯胺(6)。最后將前面制備的苯甲酰胺關鍵中間體(5)與取代氯乙酰苯胺(6)反應制得相應的查爾酮苯甲酰胺系列衍生物(查爾酮BAA1～21)，見圖2。

化合物2的合成：稱取1.0 g氫氧化鈉，1.5 g氫氧化鉀加入三頸瓶中，加入0.3 mL蒸餾水，混合物加熱至160 ℃使其熔融。分5批緩慢加入3.0 g異香草醛，熔融狀態(tài)下繼續(xù)反應10 min，停止加熱待反應混合物溫度降至室溫后，加水100 mL使混合物全部溶解，冰浴條件下用2 mol·L-1鹽酸將混合物調(diào)pH至1～2。混合物溶液直接抽濾，用水洗滌濾餅2～3次既得產(chǎn)物，將產(chǎn)物放入真空干燥箱干燥。

化合物3的合成：化合物2(3.47 g,15 mmol)溶于70 mL無水乙醇中，加入無水碳酸鉀(6.22 g,45 mmol)和氯化芐(2.30 mL,20 mmol)，回流反應6 h，除去碳酸鉀，減壓蒸除乙醇，乙酸乙酯(30 mL×3)提取，分別用H2O (3×30 mL),2 mol·L-1NaOH 水溶液(3×30 mL),2 mol·L-1HCl 水溶液(3×30 mL)，飽和氯化鈉水溶液 (2×30 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，柱層析分離得到產(chǎn)物(4.56 g,95%) 。

化合物4的合成：將化合物3(6.72 g,26 mmol)溶于10 mL無水二氯甲烷中，冰浴條件下緩慢滴加5.82 mL氯化亞砜的二氯甲烷溶液和5滴催化量的二甲基甲酰胺(DMF)，室溫條件下3 h。待反應完全后減壓蒸除溶劑，將產(chǎn)物溶于無水二氯甲烷中備用。冰浴條件下，將上述酰氯的無水二氯甲烷溶液(25 mL)緩慢逐滴加入22.91 mL 30%的甲胺水溶液中，冰浴反應2 h后升溫至室溫反應。反應完全后，加入10 mL水，分液，水相用二氯甲烷(3×30 mL)提取，合并有機相，有機相分別用2 mol·L-1的鹽酸(3×25 mL)，水(2×25 mL)，飽和碳酸氫鈉(2×25 mL)，飽和氯化鈉(2×20 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥，柱層析分析得到產(chǎn)物(3.16 g,84%)。

化合物5的合成：化合物4(3.49 g,10 mmol)溶于100 mL無水甲醇中，加入10%的Pd/C(0.10 g)。通入氫氣還原反應，室溫條件下攪拌反應。反應完全后，過濾，回收Pd/C,減壓蒸除甲醇，得到產(chǎn)物(2.58 g,97%)。

目標化合物(BAA1)的合成：將化合物5(1.58 g,5.90 mmol)溶于70 mL無水乙醇中，加入無水碳酸鉀(2.45 g,17.70 mmol)。反應混合物室溫條件下攪拌反應30 min，加入化合物6 (1.54 g,6.49 mmol)?；旌衔锘亓鞣磻?0 h，TLC監(jiān)測反應進程，待反應完全后，過濾除去碳酸鉀，減壓蒸除乙醇，乙酸乙酯(3×20 mL)提取，有機相依次用H2O (3×10 mL)、2 mol·L-1NaOH(3×10 mL)、2 mol·L-1HCl (3 ×10 mL) 和飽和氯化鈉水溶液 (2×10 mL)洗滌，無水硫酸鈉干燥。柱層析分離得到目標化合物BAA1(2.13 g,78%)。mp:197～198 ℃。EI-MS(m/z):366.1 (M+)。1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ 8.88 (s,1H),7.80 (d,J=4.7 Hz,1H),7.51(s,1H),7.46(d,J=8.4 Hz,2H),7.17-7.12 (m,1H),6.97 (d,J=8.4 Hz,1H),6.27 (s,1H),4.69 (s,2H),4.00(s,3H)。3.03 (s,3H)?；衔顱AA2～21的制備方法與BAA1相同。

查爾酮衍生物(查爾酮BAA22～35)的合成見合成路線2，該系列化合物同樣以異香草醛為起始原料，首先以液溴為溴化試劑制備溴代異香草醛，將其羥基以芐基保護，然后以次氯酸鈉為氧化劑將醛基氧化為羧基制備溴代異香草酸。再與氯化亞砜反應生成酰氯，將得到的酰氯分別與甲胺、異丙胺、二乙胺反應得到相應的苯甲酰胺關鍵中間體。此外，將各種取代苯胺與氯乙酰氯反應得到相應的氯乙酰苯胺。最后將前面制備的苯甲酰胺關鍵中間體與取代氯乙酰苯胺反應制得相應的查爾酮苯甲酰胺系列衍生物(查爾酮BAA22～35)(見圖3)。

1.2.2 體外抗腫瘤活性篩選[13-14]體外篩選了目標化合物對EGFR(表皮生長因子受體)、VEGFR-2(血管內(nèi)皮細胞生長因子受體-2)和FGFR1(成纖維細胞生長因子受體-1)3種受體酪氨酸激酶的抑制活性；細胞水平篩選了目標化合物對乳腺癌細胞(MCF-7)、非小細胞肺癌細胞(A549)、白血病細胞(K562)3種腫瘤細胞的增殖抑制活性[14]；尋找基于EGFR/VEGFR-2/FGFR1多靶標的抗腫瘤候選化合物。目標化合物對受體酪氨酸激酶抑制活性篩選所用的試劑盒為ADP-Glo Kinase Assay檢測試劑盒(Promega)，實驗對照藥物選用吉非替尼(Gefitinib)；腫瘤細胞增殖抑制活性篩選采用經(jīng)典的噻唑藍(MTT)方法，對照藥物選用吉非替尼(Gefitinib)。

查爾酮衍生物對EGFR、VEGFR-2和FGFR1 3種RTI抑制活性結果(見表1)可以看出，與陽性藥吉非替尼相比，大部分化合物對EGFR、VEGFR-2和FGFR1具有一定程度的抑制活性。對EGFR抑制活性中，化合物BAA22、BAA23、BAA30和BAA31的活性結果接近(IC50小于20 nmol·L-1)吉非替尼(IC50=4.07 nmol·L-1)，這4個化合物的結構特征是結構母核為溴代苯甲酰胺結構，末端苯胺為3-氯-4-氟苯胺或者3-三氟甲基苯胺；化合物BAA25對EGFR無抑制活性，說明溴代苯甲酰胺是EGFR的有效結構片段，而3-氯-4-氟苯胺或者3-三氟甲基苯胺對EGFR的抑制活性是必需的；有11個化合物的IC50值在1～30 nmol·L-1，其中有4個化合物的活性在20 nmol·L-1以下，值得深入研究。對于VEGFR-2，4個化合物的活性結果較好，分別是BAA10(IC50=17.09 nmol·L-1)，BAA16(IC50=14.65 nmol·L-1)，BAA19(IC50=15.50 nmol·L-1)和BAA30(IC50=12.44 nmol·L-1)；對于FGFR1，目標化合物的抑制活性普遍低于對EGFR和VEGFR-2的抑制活性，說明該系列化合物對FGFR1的選擇性不如EGFR和VEGFR-2，其次，化合物BAA1(IC50=19.54 nmol·L-1)，BAA3(IC50=13.69 nmol·L-1)和BAA29(IC50=19.23 nmol·L-1)的活性較好。從整體活性結果顯示，化合物BAA30對EGFR、VEGFR-2和FGFR1的抑制活性均較好，特別是對EGFR和VEGFR-2的抑制活性明顯高于其他化合物，說明BAA30結構中的溴代苯甲酰胺是較為理想的多靶標酪氨酸激酶抑制劑鉸鏈區(qū)結合基團，其末端的3-三氟甲基取代基對于保持化合物的多靶標抑制活性是必需的。

表1 查爾酮衍生物對受體酪氨酸激酶的抑制活性結果(IC50,nmol·L-1)

表1(續(xù))

查爾酮衍生物對乳腺癌細胞(MCF-7)、非小細胞肺癌細胞(A549)、白血病細胞(K562)的增殖抑制活性見表2。大部分衍生物對3種腫瘤細胞均具有一定的增殖抑制活性，其中活性最高的化合物是BAA23，其結構特征為苯甲酰胺母核上2-位為溴取代基，末端苯胺為3-三氟甲基苯胺，對MCF-7、A549、K562的抑制活性IC50值分別為5.42、8.27、9.82 μmol·L-1。對于不含溴的苯甲酰甲胺類衍生物，活性最高的是BAA5(末端為4-溴苯胺)，對3種腫瘤細胞增殖抑制活性IC50值分別為12.7、15.2、13.3 μmol·L-1。對于不含溴的苯甲酰異丙胺類衍生物，活性最高的是BAA8(末端為3-三氟甲基苯胺)，對3種腫瘤細胞增殖抑制活性IC50值分別為21.7、10.4、8.93 μmol·L-1；該系列中對MCF-7抑制活性最高的是BAA14(末端為3-氟苯胺)。對于不含溴的苯甲酰二乙胺類衍生物，活性最高的是BAA16(末端為3-三氟甲基苯胺)，對3種腫瘤細胞增殖抑制活性IC50值分別為24.1、20.4、12.4 μmol·L-1。對于苯甲酰胺母核上含溴取代基的化合物(BAA22～BAA35)，其抗腫瘤活性普遍優(yōu)于不含溴的衍生物，包括活性最高的化合物BAA23。苯甲酰甲胺類衍生物中BAA26和BAA27對3株腫瘤細胞的增殖抑制活性值在20～30 μmol·L-1之間，活性較好。苯甲酰異丙胺系列化合物中，BAA33和BAA36的活性較好，與BAA26接近?？偨Y苯甲酰胺系列衍生物構效關系發(fā)現(xiàn)：苯甲酰胺母核上溴取代基有利于提高活性，末端苯胺上的三氟甲基與氟取代基有利于抗腫瘤活性。

表2 查爾酮衍生物對不同腫瘤細胞株的抗增殖活性(IC50,μmol·L-1)

表2(續(xù))

2 討論

以查爾酮為先導化合物，針對查爾酮母核結構中α,β-不飽和雙鍵的缺陷，共設計、合成了35個新型查爾酮衍生物。合成路線合理，反應條件比較溫和，均由廉價易得的異香草醛為原料制備。體外活性實驗表明，大部分化合物具有較好的RTK抑制與抗腫瘤活性，部分化合物的活性接近陽性對照的水平。為新型查爾酮先導化合物的結構優(yōu)化提供了依據(jù)。