基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接法揭示透解祛瘟顆粒防治新冠肺炎的活性成分及作用機制

饒鴻宇，諶攀，吳灝，王永剛，李沛波，蘇薇薇

(中山大學(xué)廣東省中藥上市后質(zhì)量與藥效再評價工程技術(shù)研究中心/中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

2019年底，一種由新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引發(fā)的急性呼吸道傳染病肆虐全球，對全球人民健康、經(jīng)濟發(fā)展和社會穩(wěn)定帶來了巨大負面影響。國家衛(wèi)生健康委員會將SARS-CoV-2導(dǎo)致的肺炎命名為“新型冠狀病毒肺炎”，世界衛(wèi)生組織(WHO)將其命名為coronavirus disease 2019(COVID-19)。目前，針對COVID-19尚無特異性治療藥物，臨床治療以對癥、支持療法為主。國家衛(wèi)生健康委先后印發(fā)了7版《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案》，推薦采用中西醫(yī)聯(lián)合療法進行COVID-19的治療及預(yù)防，效果顯著[1]。中醫(yī)認為，本病屬于中醫(yī)“溫疫”范疇，為外感溫邪熱毒，傷津耗氣而發(fā)。結(jié)合廣東省濕熱膠結(jié)，阻滯氣機，病程難以痊愈的特點[1]，廣東省藥品監(jiān)督管理局將具有清熱解毒、透表疏風(fēng)、益氣養(yǎng)陰等多種功效的透解祛瘟顆粒(曾用名“肺炎1號方”)推廣至全省新冠肺炎定點救治醫(yī)院應(yīng)用，顯著改善了輕型新冠肺炎患者的臨床癥狀，減少了重癥的發(fā)生趨勢[2-3]。然而，透解祛瘟顆粒防治COVID-19的活性成分和作用機制尚不清楚。

中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以從整體角度系統(tǒng)探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，構(gòu)建“藥物-靶點-疾病” 網(wǎng)絡(luò)，為中藥復(fù)方的多成分、多途徑和多靶點的復(fù)雜整體作用機制提供新的視角[4]。分子對接技術(shù)是基于分子的幾何結(jié)構(gòu)，運用計算機技術(shù)模擬分子間相互作用力，研究藥物分子與蛋白靶點間的相互作用，常應(yīng)用于藥物發(fā)現(xiàn)階段的早期虛擬篩選、藥物潛在作用機制研究以及藥物作用靶點的預(yù)測。本研究首次采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法及分子對接技術(shù)研究經(jīng)方透解祛瘟顆粒防治COVID-19的活性成分和機制，為透解祛瘟顆粒在新冠肺炎防治中的臨床應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 方法

1.1 透解祛瘟顆?；瘜W(xué)成分收集 口服生物利用度(OB)表示口服藥物的活性成分或有效成分經(jīng)吸收達到體循環(huán)的速度與程度，是重要的藥代動力學(xué)參數(shù)之一。分子類藥性(DL)是指化合物與已知藥物的相似性，常用于篩選出有潛在失敗傾向的化合物，節(jié)約研究資源。本研究借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP)(http://tcmspw.com/)，分別以連翹、山慈菇、金銀花、黃芩、大青葉、柴胡、青蒿、蟬蛻、前胡、川貝母、浙貝母、茯苓、烏梅、玄參和太子參為關(guān)鍵詞檢索透解祛瘟顆粒中的化學(xué)組成，并以O(shè)B≥30%和DL≥0.18作為篩選條件，結(jié)合已報道的現(xiàn)代藥理學(xué)研究文獻，進行補肺活血膠囊主要化學(xué)成分的篩選。

1.2 核心靶蛋白和靶基因的確定及藥材-活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 采用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)平臺(TCMSP,http://tcmspw.com/)和毒性與基因比較數(shù)據(jù)庫(CTD,https://ctdbase.org/)分析并檢索活性化合物的靶蛋白或靶標基因，借助Uniprot (https://www.uniprot.org/)、Drugbank (https://www.drugbank.ca/)等數(shù)據(jù)庫查閱靶蛋白對應(yīng)的基因名。使用String (https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫對上述所有靶點進行蛋白間相互作用(PPI)分析，并將分析結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件進行網(wǎng)絡(luò)拓撲分析，將節(jié)點的度(degree)大于2倍中位值、緊密中心度(closeness centrality)和間距中心度(betweenness centrality)均大于其中位值的節(jié)點基因作為核心靶基因[5-6]。篩選到核心靶點后，運用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建可視化的藥材-活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)，并分析網(wǎng)絡(luò)的拓撲特征。

1.3 核心靶點通路分析 為進一步解析上述篩選出的靶基因的功能以及在信號通路中的作用，將篩選得到的核心靶點導(dǎo)入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/)并限定物種為人(homo sapiens)，進行京都基因與基因組百科全書(KEGG)信號通路分析。

1.4 化學(xué)成分-靶點分子對接 研究表明，SARS-CoV-2表達的S-蛋白可與細胞表面的人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE2)結(jié)合，促進病毒進入細胞內(nèi)，增強其致病性，因此ACE2常作為治療COVID-19的重要潛在靶點之一[7-8]。此外，作為RNA病毒，SARS-CoV-2需要通過3CL水解酶(3CL protease，Mpro)水解前體蛋白，產(chǎn)生功能蛋白，才能完成復(fù)制的全過程，因此，Mpro也是治療新冠肺炎的潛在靶點之一[9]。值得一提的是冠狀病毒木瓜樣蛋白酶(papain-like protease，PLP) 也是冠狀病毒在復(fù)制過程中的重要蛋白酶之一[10]。本研究為進一步明確透解祛瘟顆粒中的化學(xué)成分在防治COVID-19的作用及機制，將透解祛瘟顆粒的化學(xué)成分與靶點ACE2、Mpro和PLP進行虛擬對接。從RCSD 蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(https://www.rcsb.org/)下載ACE2 (PDB ID:1R4L)、Mpro (PDB ID:6LU7)和PLP (PDB ID:4OVZ)晶體結(jié)構(gòu)，采用AutoDock Tools 1.5.6軟件刪除靶蛋白的水分子，分離配體和受體，添加非極性氫，計算Gasteiger電荷，分別導(dǎo)出為pdbqt格式的文件，作為對接受體。從PubChem (https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)數(shù)據(jù)庫中下載化合物的結(jié)構(gòu)，存為SDF格式，再通過Openbabel軟件將化合物轉(zhuǎn)為pdbqt格式，導(dǎo)入AutoDock Tools 1.5.6，添加原子電荷，分配原子類型，所有柔性鍵均默認可旋轉(zhuǎn)，導(dǎo)出為pdbqt格式，作為對接配體。運行AutoDock Vina 1.1.2軟件進行對接，采用VMD 1.9.2軟件對接結(jié)果可視化。

2 結(jié)果

2.1 化學(xué)成分的收集及核心靶點的篩選 通過TCMSP檢索和文獻研讀篩選到透解祛瘟顆粒的主要化學(xué)成分共197個，其中23個來自連翹，3個來自山慈菇，23個來自金銀花，36個來自黃芩，10個來自大青葉，17個來自柴胡， 22個來自青蒿，5個來自蟬蛻，24個來自前胡，13個來自川貝母，7個來自浙貝母，15個來自茯苓，8個來自烏梅，9個來自玄參，20個來自黃芪，8個來自太子參。透解祛瘟顆粒中的化學(xué)成分信息見表1。從TCMSP和CTD數(shù)據(jù)庫搜集到成分靶點共667個，通過PPI分析后，得到核心靶點132個，與核心靶標相關(guān)的活性成分共109個，用于后續(xù)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建。

表1 透解祛瘟顆?；瘜W(xué)成分

表1(續(xù))

表1(續(xù))

表1(續(xù))

表1(續(xù))

2.2 核心靶點篩選和藥材-成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)分析 從TCMSP和CTD數(shù)據(jù)庫搜集到成分靶點共667個，通過PPI分析后，得到核心靶點132個，與核心靶標相關(guān)的核心化合物共109個，其中12個來自連翹，3個來自山慈菇，13個來自金銀花，24個來自黃芩，6個來自大青葉，13個來自柴胡，16個來自青蒿，1個來自蟬蛻，17個來自前胡，6個來自川貝母，4個來自浙貝母，1個來自茯苓，8個來自烏梅，4個來自玄參，14個來自黃芪，5個來自太子參。運用Cytoscape 建立的藥材-成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)見圖1。由圖1可知，該網(wǎng)絡(luò)共有257個節(jié)點(16味藥材，109個成分，132個核心靶點)，5922條邊。在118個核心靶點中，Degree值前15的靶點為PTGS2、CASP3、IL6、TNF、TP53、AKT1、MAPK3、血管內(nèi)皮生長因子A (VEGFA)、MAPK1、信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、JUN、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、INS、ALB和AR。Degree值前5的成分是槲皮素(quercetin)、木犀草素(luteolin)、漢黃芩素(wogonin)、山柰酚(kaempferol)和黃芩苷(baicalein)。

2.3 核心靶點通路分析 通過對透解祛瘟顆粒的132核心靶點進行KEGG 通路分析，共篩選得到 119條通路(篩選了P<0.05的通路，P值越小，富集程度越高)。圖2為列舉的前 30條相關(guān)通路，主要包括與病毒性疾病相關(guān)的乙肝、甲型流感、Epstein-Barr 病毒感染通路；與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的小細胞肺癌、百日咳、軍團菌病通路；與炎癥免疫調(diào)控相關(guān)的TNF、Toll樣受體、T細胞受體信號通路；此外，還包括在肺纖維化形成和缺氧應(yīng)答中發(fā)揮重要作用的PI3K-AKT、FoxO、HIF-1信號通路。

2.4 分子對接結(jié)果分析 通常認為配體與受體結(jié)合的構(gòu)象穩(wěn)定時能量越低，二者發(fā)生作用的可能性越大。本研究對透解祛瘟顆粒中的109個核心化合物與ACE2、MPro和PLP靶點進行分子對接，以結(jié)合能超過平均值作為篩選標準，結(jié)果發(fā)現(xiàn)109個核心化合物中，與ACE2、MPro和PLP對接結(jié)合能超過平均值的化合物分別為58、64和56個[11-12]。此外，本研究發(fā)現(xiàn)部分化合物與ACE2、MPro和PLP均具有較好的結(jié)合活性，如青黛酮(qingdainone)、黃芩苷(baicalin)和蒙花苷(linarin)等，部分代表性活性成分與靶蛋白的相互作用見圖3。由此可見，透解祛瘟顆粒中含有與 ACE2、MPro和PLP存在較好的結(jié)合活性的成分群，可以抑制SARS-CoV-2病毒感染宿主細胞和自我復(fù)制的作用。

表2 透解祛瘟顆?；瘜W(xué)成分與ACE2、MPro和PLP靶點結(jié)合的篩選

表2(續(xù))

表2(續(xù))

表2(續(xù))

3 討論

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選出透解祛瘟顆粒中主要化學(xué)成分197個，作用靶點667個，進一步通過PPI分析篩選得到132個核心靶點和109個核心化合物，用于構(gòu)建藥材-活性成分-核心靶點網(wǎng)絡(luò)，之后再對核心靶點進行 KEGG 通路分析，并運用分子對接法對核心化合物與ACE2、MPro和PLP靶點進行對接，探討透解祛瘟顆粒防治COVID-19的作用機制。

ACE2、MPro和PLP是SARS-CoV-2病毒感染宿主細胞或自我復(fù)制的關(guān)鍵蛋白，被認為是抗SARS-CoV-2病毒藥物篩選的重要靶點。本研究表明，透解祛瘟顆粒中含有與 ACE2、MPro和PLP有較好的結(jié)合活性的成分群，在抑制SARS-CoV-2病毒感染宿主細胞或自我復(fù)制方面具有一定的作用。一些代表性活性成分已經(jīng)有相關(guān)抗病毒活性研究文獻報道，如，黃芩苷(baicalin)對多種呼吸道病毒均有良好的抑制作用，既可通過影響細胞脂質(zhì)合成，降低體外柯薩奇病毒(Coxsakhievirus B3)的滴度，又能促進Ⅰ型干擾素的上調(diào)，發(fā)揮抗A型流感病毒(influenza A virus)的功效[13-14]。

細胞因子風(fēng)暴(cytokine release syndrome，CRS)是一種由感染和藥物等因素引發(fā)的全身性炎癥反應(yīng)，可表現(xiàn)為患者體內(nèi)多種細胞因子水平迅速升高，常見于病毒感染和免疫系統(tǒng)相關(guān)性疾病，具有致死的風(fēng)險[15]。盡管目前CRS的病理生理機制尚不明確，但有研究發(fā)現(xiàn)，其發(fā)病過程與細胞間多種細胞因子的相互作用與調(diào)節(jié)功能出現(xiàn)紊亂、促炎反應(yīng)與抗炎反應(yīng)平衡失調(diào)有著十分密切的聯(lián)系。已有研究表明，COVID-19重癥患者體內(nèi)存在不同程度的細胞因子風(fēng)暴，尤其是重癥監(jiān)護(ICU)患者的血漿中均檢測出較高水平的TNF-α、IL-2、IL-6、IL-7、IL-10、MCP-1和MIP-1A等[16-19]。TNF-α和IL-6是引發(fā)CRS的關(guān)鍵炎癥因子，IL-6的進行性上升已作為新型冠狀病毒肺炎重型、危重型病例病情惡化的臨床警示指標[20]。目前，臨床用于治療COVID-19的抗病毒藥物氯喹可抑制TNF-α和IL-6的產(chǎn)生和釋放，減輕炎癥反應(yīng)[21]。環(huán)氧化酶(PTGS2)可以催化花生四烯酸產(chǎn)生前列腺素E2 (PGE2)，廣泛參與多個組織和器官的炎癥反應(yīng)，在機體炎癥反應(yīng)過程中起著十分重要的作用。本研究結(jié)果表明，透解祛瘟顆粒可能通過作用于PTGS2、IL6、TNF和MAPK1等與炎癥調(diào)控密切相關(guān)的多個靶點以及作用于TNF、Toll樣受體和T細胞受體等多個信號通路，協(xié)同干預(yù)病毒入侵后機體免疫功能失調(diào)的狀態(tài)，預(yù)防和緩解COVID-19引起的CRS癥狀。

肺纖維化是以肺泡持續(xù)性損傷，成纖維細胞大量增殖和胞外基質(zhì)沉積為主要表現(xiàn)的一類肺部疾病，具有起病隱匿、早期癥狀不明顯的特點。已有研究發(fā)現(xiàn)，新冠肺炎患者胸部CT出現(xiàn)了多發(fā)小斑片影及間質(zhì)改變，存在形成肺纖維化的風(fēng)險[22]。因此預(yù)防肺纖維化的形成也是治療COVID-19過程中需要引起重視的問題之一。PI3K-Akt和FoxO信號通路在細胞的增殖分化、氧化應(yīng)激和凋亡中發(fā)揮著重要的作用，兩者可協(xié)同抑制肺成纖維細胞的自噬，減少肺纖維化的形成[23-26]。通路富集研究結(jié)果表明透解祛瘟顆粒可能作用于PI3K-Akt和FoxO信號通路，降低COVID-19出現(xiàn)肺纖維化的風(fēng)險。此外，COVID-19重癥患者在發(fā)病一周后出現(xiàn)多呼吸困難和/或低氧血癥，而HIF-1信號通路的激活可使機體細胞更好地適應(yīng)缺氧狀態(tài)，提示透解祛瘟顆?？赡芡ㄟ^作用于HIF-1信號通路改善COVID-19患者的低氧血癥[27]。

綜上所述，透解祛瘟顆粒中的活性成分群通過作用于ACE2、MPro和PLP靶點抑制病毒感染宿主細胞及自我復(fù)制的進程，同時通過多靶點多通路抑制細胞因子風(fēng)暴、減少肺纖維化的形成、改善患者的低氧血癥，有效的防治COVID-19。本研究闡明了透解祛瘟顆粒防治COVID-19的活性成分及作用機制，為透解祛瘟顆粒的臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。