小麥苗期浸種和根灌淺黃隱球酵母菌的定殖特征及對莖基腐病的防治效果

劉忠偉 孫振才 楊佑明 王志敏

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，北京 100193)

小麥?zhǔn)亲钪匾募Z食作物之一，栽培歷史悠久，種植面積最大。我國是最大的小麥生產(chǎn)國與消費國，小麥年產(chǎn)量約占世界總產(chǎn)量的17%[1]。小麥莖基腐病自20世紀(jì)50年代被發(fā)現(xiàn)以來，在澳大利亞、美國、加拿大等地愈發(fā)嚴(yán)重，統(tǒng)計表明由于莖基腐病的發(fā)生，美國小麥產(chǎn)量平均每年損失9.5%～35.0%[2]。2012年我國小麥莖基腐病在年首次被報道[3]。小麥如果在播種時感染莖基腐病病原菌，分蘗期莖基部葉鞘會出現(xiàn)褐色或深褐色的癥狀，嚴(yán)重時會向莖基部和根部擴展，根部腐爛且呈現(xiàn)深褐色或黑色，導(dǎo)致植株死亡；在返青期至起身期感染病原菌，此時地上部受侵染癥狀不明顯，拔節(jié)期至孕穗期病原菌侵染加快，植株出現(xiàn)黃葉，分蘗死亡，至開花期莖基部葉鞘和莖稈呈褐色或深褐色，灌漿中期植株干枯，成株大量死亡，出現(xiàn)大量白穗，至成熟期，穗部籽?？诊趸驘o籽粒[4-6]。在我國，莖基腐病作為一種新發(fā)生的土傳病害，對其防治研究目前還不深入[7]。已有研究發(fā)現(xiàn)莖基腐病是由多種病原菌共同作用，主要是鐮刀菌屬病原菌侵染，其中禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌是黃淮海麥區(qū)莖基腐病的優(yōu)勢病原菌，目前還未獲得高抗的小麥品種[8-11]。由于近年來秸稈還田比例增加，導(dǎo)致大田中秸稈殘體數(shù)量增加，給病原菌提供了良好的生存環(huán)境，因此黃淮海麥區(qū)莖基腐病的發(fā)生頻率呈現(xiàn)上升趨勢[12-13]。研究表明病原菌變異加速，對化學(xué)藥劑的抗性增加等[14]。且大部分小麥種植區(qū)抗病品種較少，因此探索其他的有效防治途徑及方法很有必要。

已有研究表明生物防治可以避免化學(xué)藥劑造成的環(huán)境污染，并在短期內(nèi)就能達(dá)到良好的抑菌效果[15-16]。淺黃隱球酵母菌(Papiliotremaflavescens)是鐮刀菌屬病害防治效果較好的酵母菌之一，其生物防治上的應(yīng)用主要針對對小麥赤霉病防控的大田噴施上[17-18]。淺黃隱球酵母菌(P.flavescensOH 182.9)對赤霉病防效可達(dá)到80%以上[19-20]。目前，有關(guān)淺黃隱球酵母菌對莖基腐病優(yōu)勢病原菌的防治研究較少；其對小麥莖基腐病防治效果也還未得到進(jìn)一步的驗證；此外，其定殖、對病害防治機制也有待進(jìn)一步研究。因此，為了解淺黃隱球酵母菌的定殖特征和對莖基腐病的防治效果，本研究擬通過平板混合培養(yǎng)試驗和浸種、根灌淺黃隱球酵母菌溫室盆栽試驗，開展定殖和莖基腐病防治研究，以期為小麥莖基腐病生物防治提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum)、假禾谷鐮刀菌(F.pseudograminearum)和淺黃隱球酵母菌(P.flavescens)均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院提供。試驗用小麥種子為濟(jì)麥22，由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供。培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。

化學(xué)試劑主要有：瓊脂粉，化學(xué)純；次氯酸鈉，化學(xué)純；葡萄糖，化學(xué)純；甘油，化學(xué)純。

盆栽試驗花盆：上徑、下徑、高分別為23、19、27 cm。

盆栽用土為草炭土，肥料施用量為：每1 kg土壤施入含46%氮的尿素0.3 g，含20% P2O5的過磷酸鈣0.75 g，含50% K2O的硫酸鉀0.3 g。

1.2 試驗方法

1.2.1淺黃隱球酵母菌的抑菌率測定

禾谷鐮刀菌孢子懸浮液制備：將禾谷鐮刀菌活化，挑取菌絲至PDA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)4～5 d，再挑取菌絲接入綠豆液體培養(yǎng)基，28 ℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)4～5 d，吸取10 μL菌液于顯微鏡下鏡檢，計算孢子數(shù)目，調(diào)整孢子濃度為1×106個/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

淺黃隱球酵母菌菌懸液制備:先將淺黃隱球酵母菌在PDA培養(yǎng)基上活化，25 ℃培養(yǎng)5 d，挑取菌落用無菌水稀釋至1×106個/mL，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

研究表明淺黃隱球酵母菌的抑菌作用主要以營養(yǎng)競爭作用為主，先接種淺黃隱球酵母菌再接種病原菌的抑菌效果較好[20]，故本試驗先將淺黃隱球酵母菌與培養(yǎng)基混合，再接種禾谷鐮刀菌，按“稀釋平板測數(shù)法”中的“平板混合培養(yǎng)法”進(jìn)行[21]：吸取100 μL 1×106個/mL淺黃隱球酵母菌菌懸液至培養(yǎng)皿(直徑90 mm)中，待PDA冷卻至45 ℃左右，向已加入淺黃隱球酵母菌菌懸液的培養(yǎng)皿加入10 mL PDA，震蕩混勻，然后向含有PDA的培養(yǎng)皿中央接種100 μL 1×106個/mL禾谷鐮刀菌孢子懸浮液，同時設(shè)置等量無菌水替代淺黃隱球酵母菌菌懸液的對照組，以上每個處理 設(shè)4 個重復(fù)，25 ℃ 培養(yǎng)5 d，用十字交叉法測量抑菌直徑。抑菌率計算公式如下：

(1)

1.2.2淺黃隱球酵母菌的定殖

通過小麥苗期盆栽試驗對淺黃隱球酵母菌定殖特征進(jìn)行研究。盆栽于溫室25 ℃培養(yǎng)，光照12 h/d，每盆澆灌150 mL/d蒸餾水保濕，光照強度為3 000 lx，每個處理 3 個重復(fù)。

種子處理：選取大小一致籽粒飽滿的濟(jì)麥22種子，2% 次氯酸鈉浸泡15 min進(jìn)行表面消毒，再用無菌水沖洗3 次并進(jìn)行浸種，24 h后選取露白狀況一致的種子備用。

采用浸種法和根灌法接種淺黃隱球酵母菌。浸種法：露白的種子于淺黃隱球酵母菌菌懸液中浸泡12 h，對照組使用0.9%生理鹽水浸種，每個花盆播種30粒，麥粒上面覆蓋約 2 cm 厚的土，出苗后每盆留苗20株。根灌法：除用生理鹽水代替菌懸液進(jìn)行浸種外，采取與上述方法完全相同的處理方式將小麥種入土中，待小麥苗長至二葉期時，向每盆中的小麥根部灌200 mL濃度為 1×106個/mL的淺黃隱球酵母菌菌懸液，對照組使用等量0.9%生理鹽水灌根，出苗后每盆留苗20株。

各處理均在淺黃隱球酵母菌菌懸液灌根后的7、14、21 d取樣，每盆隨機取3 株，去根，將葉鞘、葉片分別稱鮮重，表面清洗消毒后加入10 mL 0.9%生理鹽水研磨。待溶化后的PDA降至45 ℃左右，倒入已加入100 μL研磨液的培養(yǎng)皿中，旋轉(zhuǎn)搖勻，冷卻凝固。培養(yǎng)皿于25 ℃恒溫培養(yǎng)，待目標(biāo)菌落長出后，統(tǒng)計菌落個數(shù)，并按照下式計算出菌株的內(nèi)生定殖數(shù)目n(cfu/g)[22]：

(2)

1.2.3淺黃隱球酵母菌對小麥苗期莖基腐病的防治

通過小麥苗期盆栽試驗研究淺黃隱球酵母菌對小麥苗期莖基腐病的防治作用。試驗病原菌為禾谷鐮刀菌和假禾谷鐮刀菌，采用病麥粒接種方式，每個處理 3 個重復(fù)。種子預(yù)處理方式和光溫條件同1.2.2，淺黃隱球酵母菌菌懸液制備方法同1.2.1。

禾谷鐮刀菌接種物的制備：將小麥種子浸泡過夜，然后放至150 mL錐形瓶中121 ℃濕熱滅菌20 min。將6 mm禾谷鐮刀菌菌塊接種到滅菌的麥粒中，每瓶接6個菌塊。25 ℃培養(yǎng)7～10 d，并在培養(yǎng)過程中每天震蕩，保證麥粒上病原菌的量一致，將制備的病麥粒在室內(nèi)晾干后放于4 ℃保存?zhèn)溆?。假禾谷鐮刀菌接種物制備方法同上。

淺黃隱球酵母菌接種方法同1.2.2。

病原菌接種:在根灌淺黃隱球酵母菌3 d后接種病原菌，采用病麥粒接種方法，每棵小麥苗的基部放置兩個病麥粒，并在上面覆蓋約2 cm土壤，以防止過快失水干掉，接種后噴水保濕3～5 d。

在接種病原菌后21 d統(tǒng)計小麥植株的發(fā)病情況：將小麥苗輕輕拔起，用無菌水將土壤沖洗干凈，按照莖基腐病病情程度共分為0～5級[23]，統(tǒng)計莖基部的發(fā)病情況:

0級：無明顯癥狀

1級：葉鞘褐枯小于葉鞘長度10%

2級：第一葉鞘褐枯占葉鞘長度11%～25%

3級：第一葉鞘褐枯占葉鞘長度26%～50%

4級：第二葉鞘有明顯褐枯

5級：第三葉鞘有明顯褐枯或植株死亡

病害嚴(yán)重度=

(3)

相對防效=

(4)

1.3 統(tǒng)計分析

原始數(shù)據(jù)用 Excel 2019進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，運用 SPSS 22.0(SPSS Inc，Chicago，IL，USA)對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，利用t-test比較對根灌及浸種淺黃隱球酵母菌的定殖數(shù)量及其抑制鐮刀菌的效果進(jìn)行顯著性分析，P<0.05表示有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 淺黃隱球酵母菌對禾谷鐮刀菌的的抑菌效果

平板混合培養(yǎng)試驗中，淺黃隱球酵母菌對禾谷鐮刀菌的抑菌效果明顯，抑菌率達(dá)84.1%，淺黃隱球酵母菌均勻分布在平板表面和內(nèi)部，呈現(xiàn)粘稠透明且凸起的菌落形態(tài)，禾谷鐮刀菌菌絲呈現(xiàn)淺黃色和白色，菌絲長度明顯縮短，并且在禾谷鐮刀菌菌絲邊緣呈現(xiàn)淺黃色(表1，圖1)。

(a)禾谷鐮刀菌；(b)禾谷鐮刀菌+淺黃隱球酵母菌。

表1 基于平板混合試驗淺黃隱球酵母菌對禾谷鐮刀菌的抑制效應(yīng)(n=4)

2.2 淺黃隱球酵母菌的定殖特征

葉片的淺黃隱球酵母菌定殖結(jié)果顯示，淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量從7～21 d呈下降趨勢，7～14 d均可檢測到淺黃隱球酵母菌，21 d未檢測到，其中，淺黃隱球酵母菌浸種處理在7 d時淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量為365.0 cfu/g，14、21 d淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量為0；與淺黃隱球酵母菌浸種處理相比，根灌淺黃隱球酵母菌處理在7、14 d的定殖數(shù)量顯著增加，7 d 的定殖數(shù)量增加了350.6%，14 d的定殖數(shù)量增加了380.6%，21 d淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量為0(表2)。

葉鞘的淺黃隱球酵母菌定殖結(jié)果顯示，在不同時間段均可以檢測到淺黃隱球酵母菌，其中，淺黃隱球酵母菌浸種處理的淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量從7～21 d呈下降趨勢，7 d時淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量為2 050.6 cfu/g，14、21 d淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量急劇減少，分別為427.9、351.5 cfu/g，顯著低于根灌淺黃隱球酵母菌處理；根灌淺黃隱球酵母菌處理的淺黃隱球酵母菌處理的定殖數(shù)量先增加后減少，14 d淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量達(dá)到最高峰，為7 265.7 cfu/g，之后逐漸下降，21 d存在3 064.5 cfu/g的淺黃隱球酵母菌。與淺黃隱球酵母菌浸種處理相比，根灌淺黃隱球酵母菌處理的定殖數(shù)量顯著增加，7 d的定殖數(shù)量增加了223.5%，14 d的定殖數(shù)量增加了1 597.8%，21 d的定殖數(shù)量增加了771.9%(表2)。

在2 個生理鹽水對照組中均未檢測到淺黃隱球酵母菌的存在，通過浸種和根灌淺黃隱球酵母菌，均可以在小麥植株內(nèi)定殖淺黃隱球酵母菌，并且根灌淺黃隱球酵母菌處理比淺黃隱球酵母菌浸種處理的淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量高一個數(shù)量級(表2)。與生理鹽水對照相比，2種方式接種淺黃隱球酵母菌后，小麥株高未發(fā)生顯著變化，說明淺黃隱球酵母菌定殖未對小麥株高產(chǎn)生明顯影響(表3)。隨著接種后時間的推移，淺黃隱球酵母菌的定殖數(shù)量逐漸減少，可能是由于菌株生活力下降、定殖特性等原因，有待進(jìn)一步研究。

表2 小麥浸種和根灌淺黃隱球酵母菌后的定殖動態(tài)

表3 浸種和根灌淺黃隱球酵母菌對小麥株高的影響(n=3)

2.3 淺黃隱球酵母菌對小麥苗期莖基腐病的防治效果

在禾谷鐮刀菌莖基腐病防治試驗中，根灌生理鹽水或生理鹽水浸種處理的病害嚴(yán)重度皆為100%，相對防效為0%，淺黃隱球酵母菌浸種處理對病害防治無效果；根灌淺黃隱球酵母菌處理的防治效果與淺黃隱球酵母菌浸種處理相比呈顯著差異，病害嚴(yán)重度顯著降低，為77.3%，相對防效顯著增加，為22.7%(圖2(a))。

與根灌生理鹽水或生理鹽水浸種處理相比，接種淺黃隱球酵母菌后，小麥株高未發(fā)生顯著變化，說明在禾谷鐮刀菌莖基腐病防治試驗中，淺黃隱球酵母菌浸種和根灌淺黃隱球酵母菌不會對小麥株高產(chǎn)生明顯影響(表4)。

在假禾谷鐮刀菌莖基腐病防治試驗中，淺黃隱球酵母菌浸種處理無防治效果，根灌淺黃隱球酵母菌處理的防治效果與淺黃隱球酵母菌浸種處理相比呈顯著差異，病害嚴(yán)重度顯著降低，為74.7%，相對防效顯著增加，為25.3%(圖2(b))。

柱子上不同字母表示在0.05水平上處理間有顯著性差異；數(shù)值以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(n=3)”表示。下同。

與根灌生理鹽水或生理鹽水浸種處理相比，接種淺黃隱球酵母菌后，小麥株高未發(fā)生顯著變化，說明在假禾谷鐮刀菌莖基腐病防治試驗中，淺黃隱球酵母菌浸種和根灌淺黃隱球酵母菌均未對小麥株高產(chǎn)生明顯影響(表4)。

表4 浸種和根灌淺黃隱球酵母菌對不同鐮刀菌引起莖基腐病小麥株高的影響

本試驗結(jié)果說明莖基腐病防治效果受接種方式的影響，淺黃隱球酵母菌浸種對莖基腐病基本無抑制效果，根灌淺黃隱球酵母菌表現(xiàn)出較好的防治作用。結(jié)合淺黃隱球酵母菌的定殖特征分析，根灌方式使淺黃隱球酵母菌在小麥植株葉鞘大量存活和定殖，而且莖基腐病發(fā)病部位處在莖基部，所以，根灌淺黃隱球酵母菌可以對莖基腐病起到一定的抑制作用。

3 討論與結(jié)論

3.1 淺黃隱球酵母菌的小麥苗期定殖特征

已有研究表明，生防菌定殖受接種方式、植株生長時期、根際微生物種類等多方面的影響[24]。植物內(nèi)生菌主要來源于土壤，越往植株上部，定殖數(shù)量越低[25]；并且，隨著接種后時間的推移，內(nèi)生菌定殖數(shù)量逐漸減少[26]。本研究中，在小麥苗期淺黃隱球酵母菌定殖試驗中，根灌淺黃隱球酵母菌處理的葉鞘定殖數(shù)量與淺黃隱球酵母菌浸種處理相比顯著增加，接種淺黃隱球酵母菌21 d后，各處理葉片部位淺黃隱球酵母菌定殖數(shù)量減少為0，定殖特征與已有研究結(jié)果一致。另外，在本研究中浸種方式定殖的生防菌數(shù)量較少，而根灌方式定殖的生防菌數(shù)量較多，可能是因為相對于浸種方式，根灌方式下根系與生防菌的接觸面較大，更有利于生防菌的吸附和侵入[22]，也有研究表明不同植株生防菌的定殖數(shù)量不同，同一植株的不同生長時期、根際分泌物的差異也會影響生防菌的定殖，而且定殖數(shù)量與生防菌自身生物特性也有關(guān)系[27]。上述因素在淺黃隱球酵母菌定殖中的作用還需要進(jìn)一步研究證實。

3.2 淺黃隱球酵母菌對小麥苗期莖基腐病的防治作用

在禾谷鐮刀菌引起的赤霉病病害防治試驗中，淺黃隱球酵母菌可以達(dá)到80%的相對防效[19-20]。本研究中，在小麥苗期莖基腐病的防治試驗中，接種淺黃隱球酵母菌21 d后，與淺黃隱球酵母菌浸種處理相比，根灌淺黃隱球酵母菌處理的莖基腐病病害嚴(yán)重度顯著降低，對禾谷鐮刀菌表現(xiàn)出良好的抑制作用。另有研究發(fā)現(xiàn)通過在莖基部定殖大量生防菌，可以占據(jù)病原菌侵入位點，從而降低病害嚴(yán)重度[28]。在本試驗中，與淺黃隱球酵母菌浸種處理相比，根灌方式顯著降低了莖基腐病的病害嚴(yán)重度，可能與莖基部存在大量淺黃隱球酵母菌有關(guān)，在淺黃隱球酵母菌的定殖試驗中得到了驗證。由于不同病害的發(fā)病原因和規(guī)律不同，淺黃隱球酵母菌對赤霉病和莖基腐病的防效也有差異。

本研究表明，淺黃隱球酵母菌對禾谷鐮刀菌的抑菌效果顯著，通過根灌淺黃隱球酵母菌可以在小麥苗期實現(xiàn)定殖，并且對小麥苗期莖基腐病表現(xiàn)出一定的防治效果。本研究為莖基腐病防治提供一定的理論依據(jù)，但小麥成株期淺黃隱球酵母菌的定殖特征和病害防治效果有待進(jìn)一步研究。