南極大型海藻表面可培養(yǎng)瓊膠降解菌多樣性分析

桂媛媛 谷曉倩 李江 張培玉

研究論文

南極大型海藻表面可培養(yǎng)瓊膠降解菌多樣性分析

桂媛媛1谷曉倩2李江2張培玉1

(1青島大學(xué)環(huán)境工程學(xué)院, 山東 青島 266071;2自然資源部第一海洋研究所海洋生物資源與環(huán)境研究中心, 山東 青島 266061)

采用選擇性培養(yǎng)基、盧戈氏染色法對南極喬治王島附近海域6株大型海藻表面可培養(yǎng)的瓊膠降解菌進(jìn)行了篩選和分離純化, 并基于菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行了分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明, 篩選獲得的37株瓊膠降解菌分別屬于γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria), 黃桿菌綱(Flavobacteriia)和放線菌綱(Actinobacteria)。其中γ-變形菌綱包括、、、、、等7個屬及Thiotrichaceae科, 黃桿菌綱包括、2個屬, 放線菌綱只篩選出1個屬優(yōu)勢屬為假交替單胞菌屬(, 20株), 其次為嗜冷桿菌屬(, 4株)。、、和等5個屬及Thiotrichaceae科是首次從南極大型海藻表面分離的具有瓊膠降解活性的種屬。該結(jié)果拓展了我們對瓊膠降解菌多樣性的認(rèn)識, 為南極微生物資源調(diào)查和開發(fā)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

南極 瓊膠降解菌 多樣性 系統(tǒng)發(fā)育分析

0 引言

極地地區(qū)光照輻射變化極大、光照時間季節(jié)性極強(qiáng)、常年水溫極低且高鹽度等獨(dú)特的地理和氣候特征, 使其形成了酷寒、強(qiáng)輻射和高鹽度的自然環(huán)境。極地生態(tài)系統(tǒng)比普通的生態(tài)系統(tǒng)相對簡單脆弱, 在極地地區(qū)許多極端的低溫、高鹽度及干燥環(huán)境下只有微生物適合生存, 微生物生態(tài)可以更加敏銳地反映出極地生態(tài)系統(tǒng)的變化, 因此研究極地微生物群落及多樣性對認(rèn)識極地生態(tài)環(huán)境的變化具有重要作用[1-2]。隨著人們對南極地區(qū)生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)注度不斷提高, 關(guān)于微生物多樣性的研究也逐漸增多, 但對南極海域大型海藻表面附生菌多樣性的研究尚不多見。

海洋微生物在海洋生態(tài)系統(tǒng)中扮演著重要角色, 因此研究海洋微生物的種群和功能也越來越受到人們的關(guān)注[3]。南極海域分布著豐富的大型海藻資源, 特別是擁有高比例的特有物種。大型海藻在海洋生態(tài)系統(tǒng)中占據(jù)重要地位, 是海洋生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)的重要組成部分。這些大型藻類細(xì)胞壁中含有瓊脂、卡拉膠、褐藻膠等多種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多糖, 且不含有陸生植物難以降解轉(zhuǎn)化的木質(zhì)素, 因此藻類生物質(zhì)作為具有明顯優(yōu)勢的生物能源的原料, 極易被微生物降解。海洋異養(yǎng)微生物能夠消化高分子量的海藻多糖有機(jī)物, 將其分解為低分子量物質(zhì), 降解后的低分子量寡糖可被海洋生物作為碳源吸收利用[4]。南極海洋環(huán)境具有豐富的生物多樣性, 且存在大量特有的大型海藻物種, 有望獲得新穎的生物資源, 特別是功能微生物及其次級代謝產(chǎn)物。

大型海藻的表面是一個營養(yǎng)豐富、安全舒適的棲息地, 孕育了數(shù)量龐大、組成復(fù)雜并且充滿活力的微生物群落, 每1 cm2大藻表面約包含1.1× 108的微生物[5], 這些微生物在海藻的進(jìn)化、生理代謝以及海洋生態(tài)環(huán)境方面都發(fā)揮著重要的作用。對于海藻表面大量的附生菌而言, 最具吸引力的無疑是多糖降解菌。多糖降解菌產(chǎn)生的多糖降解酶在海洋生物資源的開發(fā)和利用中發(fā)揮著重要作用, 此外多糖降解菌在全球的碳代謝以及海藻生物質(zhì)循環(huán)的過程中都扮演著重要的角色, 在海水和海洋沉積物中發(fā)現(xiàn)了很多能降解瓊膠作為碳源的微生物[6], 海洋環(huán)境中不計其數(shù)的與海藻多糖降解相關(guān)的微生物, 利用自身基因所編碼表達(dá)的糖苷水解酶(GH)和糖苷裂解酶(PL)參與了重要的碳代謝途徑[4], 然而目前有關(guān)南極特別是南極大型海藻表面來源的多糖降解菌的研究卻鮮見報道。

Tropeano等[7]從喬治王島波特灣的海洋沉積物中分離到以革蘭氏陰性菌為主的南極細(xì)菌, 并檢測到了瓊膠酶活性。Alvarado和Leiva[8]從南極喬治王島采集的大型海藻表面分離獲得30株產(chǎn)色素的瓊膠降解菌, 并對其進(jìn)行多樣性分析。但我們對南大洋近岸大量分布的大型海藻表面多糖降解菌的認(rèn)識還很有限, 因此, 本文通過對南極大型海藻表面具有瓊膠降解活性的可培養(yǎng)菌株進(jìn)行篩選、分離純化和分子鑒定, 以進(jìn)一步拓展我們對南極大型海藻表面可培養(yǎng)瓊膠降解菌多樣性和群落結(jié)構(gòu)的了解和認(rèn)識。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

大型海藻樣品為2017年12月—2018年2月, 中國第34次南極科學(xué)考察期間采集于南極長城站生物灣(SHENGWU COVE, 58°W, 62°S), 具體站位信息如圖1所示, 圖中紅色圓點(diǎn)為大型海藻的采集地點(diǎn)。

此次在南極長城站共采集到6種大型海藻, 按順序依次編號為DZ-01至DZ-06, 經(jīng)鑒定分別為[9][10][11][12]、[13]和[14]。其中(DZ-01)(DZ-02)(DZ-03)和(DZ-04)為紅藻,(DZ-05)和(DZ-06)為褐藻, 海藻樣品圖片見圖2。

圖1 樣品采集站位圖

Fig.1. Sample collection stations

1.2 樣品處理及瓊膠降解菌的分離純化

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

采用Zobell 2216E固體培養(yǎng)基對菌株進(jìn)行分離和純化; 制備以瓊膠作為唯一碳源的固體選擇培養(yǎng)基對大藻表面可培養(yǎng)的瓊膠降解菌進(jìn)行富集和篩選; 以海水Zobell 2216E液體培養(yǎng)基對純化后的細(xì)菌進(jìn)行培養(yǎng), 各種培養(yǎng)基的配方如下:

(1)固體選擇培養(yǎng)基:

胰蛋白胨1 g, 瓊脂15 g, 過濾陳海水1 000 mL;

(2)Zobell 2216E液體培養(yǎng)基:

胰蛋白胨5 g, 酵母粉1 g, 陳海水1 000 mL;

(3)Zobell 2216E固體培養(yǎng)基

胰蛋白胨5 g, 酵母粉1 g, 瓊脂15 g, 陳海水1 000 mL。

圖2 南極大型海藻樣品

Fig.2. Sample of macroalgae from Antarctica

各培養(yǎng)基均于1.21×105Pa高壓蒸汽滅菌鍋滅菌20 min。

1.2.2 盧戈氏染液的配制

盧戈氏染液配方: 碘(I2)5 g, 碘化鉀(KI)20 g, 蒸餾水100 mL。

1.2.3 大藻樣品處理

將采集的大型海藻樣本分別放入無菌封口袋中, 運(yùn)送到南極長城站實(shí)驗(yàn)室4℃冰箱保存。然后將樣品帶回“向陽紅01”綜合科考船后立即進(jìn)行處理, 進(jìn)行瓊膠降解活性菌株的富集和篩選。

首先用孔徑大小為0.45 μm濾膜過濾海水并進(jìn)行滅菌處理, 然后用滅菌的海水沖洗海藻樣品表面2~3次, 去除藻體表面吸附的細(xì)小雜質(zhì)、碎屑及雜菌; 將沖洗后的藻體剪成小塊(2 cm×2 cm)放入無菌試管, 加入滅菌海水并用渦旋震蕩儀震蕩1 min, 使藻體表面的附生菌懸于滅菌海水中, 收集細(xì)菌懸液備用。

1.2.4 瓊膠降解活性菌株的篩選及分離純化

用滅菌海水將收集的附生菌懸液進(jìn)行梯度稀釋(10?1、10?2、10?3、10?4), 取100 μL不同稀釋梯度的菌液, 分別涂布于固體選擇培養(yǎng)基, 于10℃倒置恒溫培養(yǎng), 每個樣品做3個平行處理。

定期檢查菌株生長狀況, 直至肉眼可清晰地觀察到菌落。對形態(tài)上有明顯差異的菌落進(jìn)行編號并進(jìn)行劃線純化直至獲得一種形態(tài)的單菌落[15]。同時對純化菌株的培養(yǎng)基進(jìn)行盧戈氏碘液染色, 菌落周圍形成邊緣清晰的水解透明圈即為疑似瓊膠降解活性菌株, 純化后的菌株置于–80℃甘油管中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 瓊膠降解菌16S rRNA序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

將純化的菌株分別接種到Zobell 2216E液體培養(yǎng)基(5 mL試管), 于10℃振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h, 取1 mL菌液離心、收集菌體提取DNA。采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(天根)提取細(xì)菌總DNA用于16S rRNA擴(kuò)增, PCR(Polymerase Chain Reaction)擴(kuò)增[16-17]采用50 μL體系, 每50 μL PCR反應(yīng)體系中包括1 μL正向引物27F(5′－AGAGTTTGA-TCCTGGCTCAG－3′)、1 μL反向引物1492R(5′－GGTTACCTTGTTACGACTT－3′)、25 μL Master Mix、2 μLDNA和21 μL超純滅菌水。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件: 95℃預(yù)變性5 min, 95℃變性1 min, 55℃復(fù)性30 s, 72℃延伸90 s, 30個循環(huán), 最后72℃延展10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠核酸電泳檢測后, 送到上海派森諾生物科技股份有限公司進(jìn)行測序和拼接。

根據(jù)測序結(jié)果, 在NCBI運(yùn)用BLAST與GenBank數(shù)據(jù)庫已知的細(xì)菌16S rRNA基因序列進(jìn)行相似性比對, 進(jìn)行同源性分析[18]完成菌種鑒定, 菌株的16S rDNA序列已存儲在GenBank數(shù)據(jù)庫中。根據(jù)菌落形態(tài)差別從中選取具有代表性的21株菌(由于屬于的菌株數(shù)量較多, 且相似度高達(dá)99%以上, 所以我們只選擇了其中4株酶解透明圈較大的進(jìn)行建樹), 采用MEGA7.0進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的繪制。應(yīng)用MEGA 7.0中的Clustal W對測得的序列以及基因庫中的相似序列一起進(jìn)行比對, 然后再用Neighbor-joining模式建樹, 選擇Bootstrap method, Bootstrap Replications設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化

根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小等特征不同[19], 共從南極大型海藻樣品表面分離純化獲得37株瓊膠降解活性菌株, 部分具有代表性的菌株水解透明圈染色結(jié)果如圖3所示。

2.2 基因序列測定及系統(tǒng)發(fā)育分析

2.2.1 基因序列分析

將菌株的16S rRNA測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST對比, 結(jié)果表明, 篩選獲得的37株瓊膠降解菌分別屬于γ-變形菌綱, 黃桿菌綱和放線菌綱。γ-變形菌綱包括:、、、、、等7個屬及Thiotrichaceae科; 黃桿菌綱包括:、2個屬; 放線菌綱僅有1個屬。其中優(yōu)勢屬為假交替單胞菌屬(, 20株), 其次為嗜冷桿菌屬(, 4株), 詳細(xì)信息如表1所示。

圖3 代表性瓊膠降解活性菌株的水解透明圈

Fig.3. The hydrolytic transparent circle of representative agar-degrading active strains

表1 可培育的瓊膠降解菌分離鑒定情況一覽表

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

對篩選出的具有代表性的21株菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4), 菌株的16S rDNA序列已提交至GenBank數(shù)據(jù)庫, 系統(tǒng)發(fā)育分析表明這些菌株的確分別屬于γ-變形菌綱、黃桿菌綱和放線菌綱, 該結(jié)果與16S rRNA的比對分析結(jié)果一致。

圖4 系統(tǒng)進(jìn)化樹. 系統(tǒng)進(jìn)化樹中粗體表示實(shí)驗(yàn)菌株, 括號內(nèi)為菌株16S rDNA序列的GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號

Fig.4. Phylogenetic tree. In the phylogenetic tree, the bolded text is the experimental strain, and the content in brackets is the GenBank number of the 16S rDNA sequence of the strain

3 討論

本研究從南極喬治王島附近海域大型海藻表面篩選獲得了37株可培養(yǎng)的瓊膠降解菌, 對其進(jìn)行分子鑒定并對其中具有代表性的21株菌株進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建, 結(jié)果表明這些可培養(yǎng)的瓊膠降解菌分屬于γ-變形菌綱、黃桿菌綱和放線菌綱3個綱。Tropeano等[7]從喬治王島波特灣的海洋沉積物中分離到的189株可培養(yǎng)細(xì)菌分別屬于α-變形菌綱、γ-變形菌綱、黃桿菌綱、放線菌綱及桿菌綱。從綱水平上, 本研究結(jié)果表明我們采集的大型海藻表面附生菌與其周邊環(huán)境中微生物種屬的多樣性組成基本一致。

在屬水平上, 我們的研究結(jié)果與南極地區(qū)已有的相關(guān)報道存在明顯的差異, Alvarado和Leiva[8]在南極喬治王島采集的4種南極大型海藻(、、、)表面分離出30株具有瓊膠降解活性的菌株, 分別屬于、、、、、、、、、和等11個屬, 與本研究相比, 除了鹽水桿菌屬()和卓貝爾氏菌屬()外, 其他種屬均不相同。Hinojosa等[20]在3種南極大型海藻(、和)表面分離出21株具有瓊膠降解活性的菌株, 通過16S rRNA鑒定表明, 這些瓊膠降解菌株分別屬于、、、、、和等7個屬, 與本研究相比, 只有科爾韋爾氏菌屬()和假交替單胞菌屬()是相同的種屬。Lavín等[21]在南極喬治王島采集的紅藻中分離出具有瓊膠降解活性的黃桿菌屬()。綜上可見, 本研究從南極大型海藻篩選獲得的、、和等5個屬及Thiotrichaceae科是之前未報道的具有瓊膠降解活性的南極大型海藻表面附生菌。我們的研究結(jié)果與南極地區(qū)已有的相關(guān)報道存在明顯差異的原因可能有2個: 一是用于菌株分離的大型海藻樣品種屬不同; 二是我們對采集的大型海藻立刻開展了瓊膠降解菌的富集和篩選培養(yǎng), 有利于獲得更加豐富的活性菌株。這兩個原因都會對菌株的多樣性產(chǎn)生可能的影響。

但與在中低緯度近海區(qū)域海水、大型海藻表面分離的瓊膠降解菌比較發(fā)現(xiàn),和屬的瓊膠降解菌均有發(fā)現(xiàn)。Marjolaine等[22]在褐藻表面分離瓊膠降解菌時分離到希瓦氏菌屬(); 假單胞菌屬()在自然界分布極其廣泛, 雖然該屬之前沒有在南極大型海藻表面分離到的相關(guān)報道, 但在近海海水、紅藻和褐藻中均分離到假單胞菌屬, 且具有較高的瓊膠降解活性[23-25]; Azhani等[26]在海藻樣品分離提取的菌株中發(fā)現(xiàn)鹽單胞菌屬()具有瓊膠降解活性。從目前已有報道看, 瓊膠降解細(xì)菌主要分布于弧菌屬()、假單胞菌屬()、假交替單胞菌屬()、交替單胞菌屬()以及噬瓊膠菌屬()等屬[23]。杜宗軍等[23]對青島近海海水中的瓊膠降解細(xì)菌進(jìn)行篩選分離, 得到87株能夠降解瓊膠的細(xì)菌, 其中14株細(xì)菌分布在、、、、、、和共8個屬中。但本研究獲得的可培養(yǎng)瓊膠降解菌種屬與青島近海的瓊膠降解菌株多樣性也存在較大差異, 其中僅有假交替單胞菌屬()和假單胞菌屬()在南極大藻表面及近海環(huán)境中均有分布, 由此可見, 假交替單胞菌屬和假單胞菌屬的菌株具有很強(qiáng)的適應(yīng)性, 在全球不同海洋環(huán)境中都有廣泛的分布, 與該結(jié)果一致的是, 假交替單胞菌屬()也是我們此次從南極大藻表面篩選獲得瓊膠降解菌的優(yōu)勢菌株。

本次研究從紅藻中分離到的瓊膠降解菌株數(shù)分別為12株、8株、7株、3株, 褐藻和中分離到的瓊膠降解菌株數(shù)分別為3株、4株。從4種紅藻中分離出的30株瓊膠降解菌分別屬于(15株)、(1株)、(1株)、(3株)、(3株)(1株)、Thiotrichaceae(1株)、(1株)(2株)、(1株)、(1株)從2種褐藻中分離出的7株瓊膠降解菌分別屬于(5株)、(1株)和(1株)。之所以紅藻表面分離出的瓊膠降解菌株比褐藻的數(shù)目多且豐富度高, 主要是由于紅藻富含瓊膠和卡拉膠等成分, 而褐藻中主要成分為褐藻膠。

南極海域分布著豐富的大型海藻及微生物資源, 對南極大型海藻表面瓊膠降解菌的篩選和鑒定有助于我們加深對南極海域海洋細(xì)菌多樣性的理解和認(rèn)識, 也為南極微生物資源調(diào)查和開發(fā)研究提供科學(xué)依據(jù)。

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BIODIVERSITY ANALYSIS OF CULTURED AGAR-DEGRADING BACTERIA FROM SURFACES OF ANTARCTIC MACROALGAE

Gui Yuanyuan1, Gu Xiaoqian2, Li Jiang2, Zhang Peiyu1

(1College of Environmental Science and Engineering, Qingdao University, Qingdao 266071, China;2Marine Bioresource and Environment Research Center, First Institute of Oceanography, Ministry of Natural Resources, Qingdao 266061, China)

To analyze the diversity of cultured agar-degrading bacteria from the surfaces of six Antarctic macroalgae samples collected from King George Island, a selective medium and Lugol’s iodine staining method were used to screen and purify the agar-degrading bacteria, and the phylogenetic relationships of these strains were then investigated according to their 16S rRNA sequences. Thirty-seven strains of agar-degrading bacteria were screened, purified, and identified as belonging to the Gammaproteobacteria, Flavobacteriia, and Actinobacteria, respectively. At the genus level, the strains were classified as,,,,,,,,, and, in addition to a strain that was classified as belonging to the family Thiotrichaceae. Among them,andbelong to the Flavobacteriia,belongs to the Actinobacteria, and the remaining genera belong to the Gammaproteobacteria. The most dominant genus of agar-degrading bacteria was(20/37), followed by(4/37).,,,,, and the member of the family Thiotrichaceaeare the first reported taxa with agar-degrading activity isolated from the surfaces of macroalgae in Antarctica. The results not only expand our knowledge of the diversity of agar-degrading bacteria, but also contribute to the investigation and exploitation of Antarctic microbial resources.

Antarctica, agar-degrading bacteria, diversity, phylogenetic analysis

2019年12月收到來稿, 2020年3月收到修改稿

南極重點(diǎn)海域?qū)夂蜃兓捻憫?yīng)和影響(RFSOCC2020—2022)及國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目(2018YFC1406704)資助

桂媛媛, 女, 1996年生。從事極地微生物研究。E-mail: 1037254782@qq.com

張培玉, E-mail: envbio@163.com

10. 13679/j.jdyj.20190076