GNβ3 C825T和NET T182基因多態(tài)性與兒童注意缺陷多動(dòng)障礙相關(guān)性研究

梅 萍 張秋瑩

學(xué)齡期(6～12歲)兒童處在身心發(fā)展的重要階段，是心理以及行為發(fā)育趨于成熟的關(guān)鍵時(shí)期。注意缺陷多動(dòng)障礙(Attention Deficit Hyperactivity Disorder，ADHD)是一種多見(jiàn)于學(xué)齡期兒童的精神障礙，該類(lèi)型的兒童與其同齡正常兒童相比活動(dòng)過(guò)度、注意力不集中，且常伴有學(xué)習(xí)成績(jī)低下和沖動(dòng)等行為[1]。目前ADHD的病因及發(fā)病機(jī)制尚不十分明確。文獻(xiàn)報(bào)道稱(chēng)[2]兒童行為問(wèn)題會(huì)受到遺傳和環(huán)境因素共同影響，尤其是注意力分散、沖動(dòng)等行為問(wèn)題的發(fā)生可能更多地會(huì)受到遺傳因素的影響。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，有關(guān)兒童行為問(wèn)題候選基因的研究開(kāi)始受到重視。研究發(fā)現(xiàn)[3]，G蛋白β3亞單位(G protein beta3 subunit，GNβ3) C825T基因與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的增強(qiáng)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)的活性相關(guān)，且介導(dǎo)的多個(gè)門(mén)控通道在精神障礙的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[4]其通過(guò)調(diào)控G蛋白與重要的中樞性神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺耦聯(lián)，調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶或磷脂酶C，激活T細(xì)胞的蛋白激酶依賴(lài)的磷脂酶D途徑，從而產(chǎn)生第二信使來(lái)對(duì)細(xì)胞活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，和精神分裂、人格以及情感等有密切關(guān)系。也有報(bào)道[4，5]稱(chēng)去甲腎上腺素轉(zhuǎn)運(yùn)體(Norepinephrine Transporter，NET)作為單胺類(lèi)遞質(zhì)，也和人格分裂、攻擊行為、精神障礙有關(guān)。研究表明[6]大部分NET需要通過(guò)細(xì)胞膜上的G蛋白耦聯(lián)受體而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。因此本研究選擇和人類(lèi)情感、行為、認(rèn)知等功能相關(guān)的GNβ3 C825T和NET T182作為候選基因，探討基因多態(tài)性和ADHD的相關(guān)性。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2014年10月～2017年7月在湖北省隨州市某小學(xué)募集的286例6～12歲ADHD患兒進(jìn)行問(wèn)卷調(diào)查，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)第4版(DSM-IV)[7]中ADHD的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)3代內(nèi)屬本民族血緣；(3)取得患兒及家屬或法定監(jiān)護(hù)人的同意，并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：患有兒童精神分裂癥、情感障礙、孤獨(dú)癥、精神發(fā)育遲滯及其他器質(zhì)性疾病者；家族中有精神疾病患者。所有兒童清水漱口后，采用一次性藥匙對(duì)其口腔上皮進(jìn)行采集，然后置于無(wú)水乙醇離心管中保存。其中男童132例，女童154例，平均年齡為(9.2±2.3)歲。

1.2 方法

1.2.1 兒童行為問(wèn)題測(cè)評(píng) 采用Achenbach兒童行為量表(Child Behavior Checklist,CBCL)[8]對(duì)兒童行為問(wèn)題進(jìn)行檢查，行為問(wèn)題共120項(xiàng)(包括2個(gè)由教師自行填寫(xiě)內(nèi)容的項(xiàng)目)，按0～2三級(jí)評(píng)分，包含品行問(wèn)題、學(xué)習(xí)問(wèn)題、心身障礙、多動(dòng)指數(shù)、焦慮抑郁、注意力問(wèn)題、社會(huì)化問(wèn)題7個(gè)方面，將所有單項(xiàng)相加即為行為問(wèn)題總分。參考蘇林雁等[9]對(duì)湖南CBCL常模的研究結(jié)果，以常?？偡值?5百分位作為劃界分，判斷ADHD行為問(wèn)題發(fā)生與否。

1.2.2 基因型分析 采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和限制性片段內(nèi)切酶法進(jìn)行基因分析，其中引物設(shè)計(jì)采用的軟件是primer 5.0，設(shè)施后輸入美國(guó)國(guó)立圖書(shū)館數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行引物同源性比較，選出同源性最小且Tm最為合適的作為本研究PCR引物：(1)GNβ3 C825T基因型分析：引物序列：F:5’-TGACCCAACTTGCCACCCGTGC-3’，R:5’-GCAGCAGCCAGGGCTGGC-3’。反應(yīng)體系為20 μl，加入基因組DNA 50 ng，引物10 pmol，1 U TapDNA聚合酶，2 μl 10×Buffer,2.5 mmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTPs。反應(yīng)條件為：94 ℃下預(yù)變性5 min，然后再在94 ℃下繼續(xù)變性45 s，在60 ℃下退火30 s，在72 ℃下延伸45 s，共計(jì)30個(gè)循環(huán)，然后72 ℃下延伸10 min。最后將PCR產(chǎn)物中加入5 U的限制性?xún)?nèi)切酶BseD Ⅰ，然后在55 ℃溫箱中進(jìn)行消化，時(shí)間為3 h，最后在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳分離，時(shí)間為3 h，通過(guò)硝酸銀染色觀(guān)察各區(qū)帶。讀取基因型：野生型(T/T)為342 bp的1條目的帶；純合突變(C/C)為126 bp和216 bp的2條目的帶；雜合突變(T/C)為342 bp、126 bp和216 bp的3條目的帶。(2)NET T182基因型分析：引物序列：F:5’-CTGTTGTGGCTGAAGTGTCGC-3’，R:5’-GGCTCTGCAGGATAAGCATTGAA-3’。反應(yīng)體系為25 μl，加入基因組60 ng，上下游引物各0.2 μm，2.5 μl的10×Buffer, 2 U TapDNA聚合酶。反應(yīng)條件：首先在94 ℃下預(yù)變性5 min，然后在94 ℃下變性30 s。接著在63 ℃下退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)35個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃下繼續(xù)延伸10 min，12%聚丙烯酰胺電泳，時(shí)間為3 h，通過(guò)硝酸銀染色觀(guān)察各區(qū)帶。讀取基因型：20 bp和28 bp的2條目的帶為野生型(C/C)；20 bp、28 bp和123 bp的3條目的帶為雜合突變(C/T)；123 bp的l條目的帶為純合突變(T/T)。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)錄入采用雙核查方式，分析采用軟件SPSS 16.0，對(duì)群體數(shù)據(jù)進(jìn)行Hardy-Weinberg定律的遺傳平衡吻合度檢驗(yàn)，通過(guò)t檢驗(yàn)分析基因多態(tài)性對(duì)ADHD的影響，連續(xù)標(biāo)量的計(jì)數(shù)資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，采用廣義估計(jì)方程模型(Generalized Estimating Equation,GEE)進(jìn)行多因素分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Hardy-Weinberg平衡的吻合度檢驗(yàn) ADHD兒童進(jìn)行GNβ3 C825T基因型和NET T182基因型Hardy-Weinberg平衡的吻合度檢驗(yàn)，結(jié)果顯示各觀(guān)測(cè)值和期望值吻合度良好，均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 GNβ3 C825T和NET T182基因基因型Hardy-Weinberg平衡的吻合度檢驗(yàn)

2.2 GNβ3 C825T和NET T182基因多態(tài)性ADHD患兒CBCL評(píng)分比較 GNβ3 C825T基因CT/CC基因型CBCL焦慮抑郁、多動(dòng)指數(shù)評(píng)分均高于TT基因型(P<0.05)。NET T182基因CT/CC基因型CBCL焦慮抑郁、社會(huì)化問(wèn)題評(píng)分均高于TT基因型(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 GNβ3 C825T和NET T182基因多態(tài)性ADHD患兒CBCL評(píng)分比較

2.3 GNβ3 C825T、NET T182與兒童ADHD影響因素的交互作用 文獻(xiàn)報(bào)道[8]稱(chēng)ADHD兒童年齡、性別可能對(duì)心理行為存在影響，因此本研究以ADHD兒童行為發(fā)生與否作為因變量，將全部樣本的GNβ3 C825T和NET T182基因多態(tài)性、性別以及年齡作為自變量進(jìn)行Logisitic回歸分析，結(jié)果顯示GNβ3 C825T和NET T182基因多態(tài)性是焦慮抑郁的影響因素(P<0.05)，含C等位基因的個(gè)體更容易發(fā)生焦慮抑郁行為(P<0.05)。同時(shí)GNβ3 C825T基因多態(tài)性、性別是多動(dòng)指數(shù)的影響因素(P<0.05)，且在含C基因個(gè)體中更容易發(fā)生多動(dòng)行為(P<0.05)，男童比女童更容易發(fā)生多動(dòng)行為(P<0.05)；NET T182基因多態(tài)性是社會(huì)化問(wèn)題的影響因素(P<0.05)，且在含C基因個(gè)體中更容易發(fā)生社會(huì)化問(wèn)題(P<0.05)。見(jiàn)表3、表4。

表3 GNβ3 C825T、性別、年齡與兒童ADHD影響因素的交互作用

表4 NET T182、性別、年齡與兒童ADHD影響因素的交互作用

3 討論

研究表明[10]，編碼G蛋白β3亞基的第10外顯子上存在著C825T基因多態(tài)性，這種基因片段異性導(dǎo)致G蛋白β3亞基缺失41個(gè)氨基酸，從而產(chǎn)生變異，因G蛋白能夠和80%已知的膜受體和效應(yīng)器耦聯(lián)，因此在擴(kuò)膜運(yùn)輸過(guò)程中起著極其重要的作用。報(bào)道稱(chēng)[11]，GNβ3 C825T系統(tǒng)功能降低與心理、行為的變化有關(guān)。Jiang D等[12]發(fā)現(xiàn)，GNβ3 C825T基因與認(rèn)知功能相關(guān)，啟動(dòng)子區(qū)-1438 A/G多態(tài)性與抑郁及沖動(dòng)行為有關(guān)。Oakley M等[13]研究發(fā)現(xiàn)兒童多動(dòng)行為的發(fā)生與C825T基因多態(tài)性存在明顯相關(guān)。

本研究結(jié)果也顯示ADHD兒童多動(dòng)指數(shù)與C825T基因多態(tài)性存在相關(guān)性，且GNβ3 C825T基因多態(tài)性與性別存在交互作用，男童比女童更容易發(fā)生多動(dòng)行為。兒童階段為了適應(yīng)現(xiàn)在以及未來(lái)社會(huì)生活，通過(guò)個(gè)人與社會(huì)的關(guān)系在家庭、學(xué)校等社會(huì)環(huán)境中獲得思維、情感以及語(yǔ)言等能力的過(guò)程中所出現(xiàn)的問(wèn)題是社會(huì)化問(wèn)題，社會(huì)化問(wèn)題可以在一定程度上反映兒童和外界溝通能力的強(qiáng)弱，也是兒童樹(shù)立價(jià)值觀(guān)和行為的準(zhǔn)繩[14]。研究發(fā)現(xiàn)[15]，NET T182在調(diào)控人類(lèi)情感及精神活動(dòng)中發(fā)揮重要作用。另有報(bào)道稱(chēng)[16]，NET T182基因多態(tài)性和抑郁癥、自殺觀(guān)念、人格存在相關(guān)性，而這些也會(huì)影響機(jī)體與外界的交流。本研究結(jié)果顯示NET T182基因中的C基因和社會(huì)化問(wèn)題發(fā)生相關(guān)，但未發(fā)現(xiàn)與多動(dòng)指數(shù)相關(guān)。國(guó)內(nèi)學(xué)者王含彥等[17]通過(guò)Meta分析發(fā)現(xiàn)NET T182C基因多態(tài)性與抑郁癥的發(fā)生之間存在關(guān)聯(lián)，這可能也是引起兒童溝通能力變?nèi)醯壬鐣?huì)化行為問(wèn)題發(fā)生的原因。

焦慮抑郁主要是指面對(duì)內(nèi)在想法感受或者外部事件的一種不愉快體驗(yàn)，嚴(yán)重者會(huì)發(fā)生恐怖、極端等行為[18]。文獻(xiàn)報(bào)道[19]稱(chēng)焦慮和抑郁的產(chǎn)生會(huì)受到環(huán)境和基因兩方面因素影響，兒童出現(xiàn)焦慮抑郁作為一種情緒表現(xiàn)，是環(huán)境和基因共同作用的結(jié)果。有學(xué)者[20]研究發(fā)現(xiàn)人格與人的神經(jīng)和感知等密切相關(guān)，而GNβ3 C825T以及NET T182均和人格存在一定的關(guān)聯(lián)性，本研究顯示GNβ3 C825T和NET T182的基因多態(tài)性與ADHD兒童的焦慮抑郁存在相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)[21]，在細(xì)胞水平上，GNβ3 C825T多態(tài)性與Gi介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)改變有關(guān)，C-T轉(zhuǎn)換導(dǎo)致跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和離子轉(zhuǎn)運(yùn)活性增強(qiáng)，從而在多種人類(lèi)疾病中起重要作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)[22]，在針對(duì)健康人的情緒及生活質(zhì)量的研究中發(fā)現(xiàn)攜帶825T等位基因的抑郁癥患者漢密爾頓抑郁量表評(píng)分增高，說(shuō)明825T等位基因是抑郁的易感因素。NET位于神經(jīng)末梢突觸前膜，能夠通過(guò)促進(jìn)突觸間隙的去甲腎上腺素(NE)進(jìn)入突觸前膜，從而阻礙NE與位于突觸后膜的NE受體之間的相互作用，T182C位點(diǎn)的多態(tài)性可能影響到NET基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性[23]，已有的研究表明[24]，NET T182C的等位基因C和基因型CC可能會(huì)增加抑郁癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，與本研究結(jié)果相符。

本研究對(duì)GNβ3 C825T和NET T182基因多態(tài)性與兒童ADHD相關(guān)性進(jìn)行了分析，但本研究為單中心研究，且樣本量較小，所以研究結(jié)果存在一定的局限性。研究發(fā)現(xiàn)[25]，GNβ3 C825T和NET T182基因多態(tài)性可能與民族、地域有關(guān)，且ADHD有多種分型，而GNβ3 C825T和NET T182基因多態(tài)性是否與這些因素有關(guān)仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，GNβ3 C825T和NET T182基因可能是影響兒童行為問(wèn)題的重要基因，GNβ3 C825T和NET T182與學(xué)齡兒童焦慮抑郁問(wèn)題發(fā)生有一定關(guān)聯(lián)，且NET T182與學(xué)齡兒童社會(huì)化問(wèn)題也存在一定關(guān)聯(lián)。目前，兒童行為問(wèn)題的生物學(xué)證據(jù)是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，環(huán)境和基因相互作用在兒童精神疾病中的作用越來(lái)越得到研究的證實(shí)。在過(guò)去幾年，候選基因DRD4、DRD2、MAOA在兒童行為和人格、抑郁等問(wèn)題中被廣泛研究，基因和環(huán)境的相互作用越來(lái)越受到科學(xué)家的重視。因此以后研究需要結(jié)合更多候選基因，探討基因和基因、基因和環(huán)境之間的相互作用。