兩種黃芪劑量補(bǔ)陽還五湯對(duì)海綿體神經(jīng)損傷性大鼠勃起功能障礙的治療效果

周康，葉妙勇，趙凡，馬軻，呂伯東，許增寶

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，杭州 310053；2.溫嶺市第一人民醫(yī)院泌尿外科，浙江溫嶺 317500；3.南通大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科/男科，江蘇南通 226001；4.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院泌尿男科，杭州 310005；5.浙江省中醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/男科實(shí)驗(yàn)室，杭州 310053；6.浙江中醫(yī)藥大學(xué)泌尿男科研究所，杭州 310005；7.湖州市中醫(yī)院，浙江湖州 313000)

勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)是前列腺癌根治術(shù)(radical prostatectomy，RP)后最為常見的長(zhǎng)期并發(fā)癥[1]。盡管目前RP在不斷改進(jìn)，但即使采用保留雙側(cè)神經(jīng)和微創(chuàng)RP仍不可避免地出現(xiàn)一定程度的海綿體神經(jīng)(cavernous nerves，CN)損傷或神經(jīng)失用，進(jìn)而導(dǎo)致ED[2]。5型磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesterase type 5 inhibitors，PDE5i)通常作為RP后ED的一線治療，然而據(jù)調(diào)查顯示，RP后ED患者于術(shù)后服用3～36個(gè)月PDE5i，其國(guó)際勃起功能指數(shù)-5(IIEF-5)評(píng)分沒有顯著變化(P＝0.87)[3]，可見PDE5i對(duì)RP后ED治療效果較為局限。從中醫(yī)角度來看，筆者所在團(tuán)隊(duì)前期研究得出“氣血失和”可能是勃起功能障礙的基本病因這一結(jié)論[4-5]，故治以益氣活血。

補(bǔ)陽還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，由清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)，功主益氣活血，且近來大量研究表明補(bǔ)陽還五湯具有神經(jīng)保護(hù)功能[6-7]。胡衛(wèi)東等[8]運(yùn)用加味補(bǔ)陽還五湯治療糖尿病性ED，取得較好的療效，但細(xì)觀文獻(xiàn)中所用黃芪量?jī)H為30 g，而原方中所記載的120 g相差甚遠(yuǎn)。那么，補(bǔ)陽還五湯中黃芪劑量的高低與其神經(jīng)保護(hù)功能從而改善勃起功能障礙是否密切相關(guān)，值得深入研究。本文就這一問題，探討不同黃芪劑量補(bǔ)陽還五湯對(duì)海綿體神經(jīng)損傷性大鼠勃起功能障礙的治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

32只8周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體重(200±15)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，【SCXK(滬)2017-0005】，并由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，【SYXK(浙)2019-0022】。飼養(yǎng)期間給予嚙齒類動(dòng)物標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及自由飲水，控制溫度(23±2)℃、濕度60%，12 h循環(huán)燈光。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處理符合2006年科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》，所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào)：IACUC-20190909-26)。32只大鼠隨機(jī)分為4組，即假手術(shù)組、模型組、30 g組(模型 +30 g黃芪補(bǔ)陽還五湯)、120 g組(模型 +120 g黃芪補(bǔ)陽還五湯)，每組8只。

1.1.2 藥物

補(bǔ)陽還五湯中：赤芍：15 g、桃仁：15 g、當(dāng)歸：15 g、川芎：15 g、地龍：15 g、紅花：6 g，30 g組黃芪為30 g，120 g組黃芪為120 g(所有藥材由浙江中醫(yī)藥大學(xué)名中醫(yī)館提供)。將所有中藥浸于10倍體積純水中30 min，然后煮沸2次，每次約1 h，合并水煎液后，濃縮至水煎液濃度為1 g/mL，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.3 主要試劑與儀器

戊巴比妥鈉(上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，批號(hào)：abs47047376)，Masson三色染色試劑盒購于南京建成科技有限公司(批號(hào)：D026-1-3)，神經(jīng)型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase，nNOS)抗體(Abcam，批號(hào)：ab15280)，神經(jīng)絲蛋白輕鏈多肽(neurofilament light polypeptide，NF-L)抗體(Abcam，批號(hào)：ab134460)，生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(growth associated protein 43，GAP-43)抗體(CST，批號(hào)：5307S)。

MP160型16通道生理記錄分析系統(tǒng)購于美國(guó)BIOPAC公司；Master-8可編程刺激器購于以色列AMPI；SDS-PAGE 垂直電泳槽(MP-8001，北京凱元伯樂生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 造模及干預(yù)方法

參考課題組前期研究的造模方法[9]，將SD大鼠腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉。剃除腹腔部絨毛，并用碘酒進(jìn)行術(shù)前消毒。于大鼠下腹部中線處作一縱行切口，暴露前列腺組織。在外科顯微鏡下于背側(cè)前列腺外側(cè)葉表面找到盆腔神經(jīng)節(jié)及其發(fā)出的海綿體神經(jīng)，利用止血鉗鉗夾海綿體神經(jīng)2 min，繼而還原周圍組織正常解剖結(jié)構(gòu)并逐層縫合關(guān)服。術(shù)后抗生素喂養(yǎng)5 d。假手術(shù)組分離出海綿體神經(jīng)后，不作鉗夾處理，余同上。術(shù)后5 d起開始給藥，給藥劑量根據(jù)常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人的體表面積比例進(jìn)行劑量換算，給以12.8 g/kg對(duì)應(yīng)黃芪劑量的補(bǔ)陽還五湯灌胃，假手術(shù)組與模型組均予以等量生理鹽水灌胃。每天1次，連續(xù)30 d。

1.2.2 ICP檢測(cè)

灌胃30 d后，腹腔內(nèi)注射3%戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉后仰臥固定，如造模方法中所操作暴露海綿體神經(jīng)；陰莖包皮縱行切口，分離皮膚與白膜，暴露陰莖海綿體，插入25G金屬針頭后連接PE50管，置管連接于壓力換能器，以測(cè)定陰莖海綿體內(nèi)壓。雙極電鉤刺激海綿體神經(jīng)，記錄ICP，電刺激參數(shù)：5 V，15 Hz，5 ms，刺激持續(xù)時(shí)間 1 min，每次刺激間隔5 min[10]。

1.2.3 樣本收集

ICP測(cè)定后，使用眼科剪離斷陰莖根部，分離陰莖龜頭部分，取陰莖，于PBS中沖洗，去除海綿體內(nèi)血液。沖洗完的陰莖組織分為三段，一段在預(yù)冷PBS中分離去除尿道、筋膜后放入-80℃冰箱保存，用于后續(xù)Western Blot檢測(cè)；剩余陰莖組織放入4%多聚甲醛中固定。

1.2.4 Masson染色

經(jīng)聚甲醛溶液固定的陰莖組織，常規(guī)石蠟包埋切片，蒸餾水潤(rùn)濕玻片30 s，核染液染色60 s，丟棄，沖洗液沖洗30 s。漿染液染色30 s，丟棄，沖洗液沖洗30 s。黃色分色液分色8 min左右棄去分色液，直接用藍(lán)色復(fù)染液染色5 min左右，丟棄，使用無水乙醇沖洗干凈，載玻片吹干后使用封片劑封片，顯微鏡下觀察。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)

經(jīng)聚甲醛溶液固定的陰莖組織，常規(guī)石蠟包埋切片，石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，PBS沖洗3次，每次3 min；3%H2O2室溫孵育 10 min，PBS 沖洗；微波溫和修復(fù)15 min；PBS沖洗3次；5%山羊血清室溫封閉30 min；按1∶200稀釋比例分別加入抗nNOS、NFL、GAP43一抗，DAPI行細(xì)胞核染色，4℃過夜后分別加入1∶1000稀釋的熒光二抗，避光孵育1 h，滴加抗熒光衰減封片劑封片后置于4℃條件下保存，熒光顯微鏡下觀察拍片，并用Image J軟件測(cè)定陽性區(qū)域的面積。

1.2.6 Western Blot檢測(cè)

取剩余陰莖組織研磨成勻漿，加入RIPA裂解液置于冰上裂解30 min后，12 000 r/min 4℃離心15 min。離心獲得蛋白用BCA法測(cè)定濃度，加入5×蛋白上樣緩沖液95℃變性10 min；10%SDSPAGE凝膠電泳分離蛋白，電泳后的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，TBST洗膜3次后加入相應(yīng)一抗4℃孵育過夜；次日TBST洗去一抗，加入對(duì)應(yīng)種屬的二抗，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，去離子水洗膜 1次之后，用ODYSSEY雙色紅外激光成像系統(tǒng)掃膜，并使用Image Studio Ver 2.0軟件處理實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 海綿體神經(jīng)解剖位置、夾損及陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定

盆神經(jīng)節(jié)于兩側(cè)前列腺背外側(cè)方，呈“人”字形，其傳出神經(jīng)即為海綿體神經(jīng)(圖1a)；海綿體神經(jīng)夾損(圖1b)；ICP測(cè)定方法(圖1c)。

圖1 海綿體神經(jīng)解剖位置、夾損及陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定Note.a.anatomic location of cavernous nerve.b.ED caused by cavernous nerve clipped.c.ICP determination.Figure 1 Anatomical location of cavernous nerve，clip injury and ICP measurement

2.2 大鼠陰莖海綿體組織Masson三色染色

各組大鼠陰莖海綿體組織Masson三色染色中，大鼠海綿竇內(nèi)平滑肌如圖2a，紅色箭頭所示。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠陰莖海綿體平滑肌面積/膠原面積顯著下降(P＜0.01)；與模型組比較，30 g組及120 g組大鼠陰莖海綿體平滑肌面積/膠原面積明顯提高(P＜0.01)；與30 g組比較，120 g組大鼠陰莖海綿體平滑肌面積/膠原面積提高有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(見圖2b)。

2.3 大鼠陰莖海綿體內(nèi)壓測(cè)定

與假手術(shù)相比，模型組大鼠勃起時(shí)ICP具有顯著性差異(P＜0.01)，即造模成功，與模型組相比，30 g組與120 g組ICP均有顯著提高(P＜0.01)，與30 g相比，120 g組大鼠 ICP明顯升高(P＜0.05)(見圖3)。

2.4 大鼠海綿體神經(jīng)免疫熒光檢測(cè)

相對(duì)于假手術(shù)組，模型組大鼠海綿體神經(jīng)中nNOS、NF-L、GAP43含量在海綿體神經(jīng)損傷后顯著降低(P＜0.01)，經(jīng)補(bǔ)陽還五湯治療后，30 g組和120 g組大鼠陰莖海綿體神經(jīng)中nNOS、NF-L、GAP43表達(dá)量顯著增高(P＜0.01)，且120 g組表達(dá)量顯著高于30 g組(P＜0.01)(見圖4)。

2.5 各組大鼠海綿體組織nNOS、NF-L、GAP43含量變化

與假手術(shù)組相比，模型組大鼠海綿體組織中nNOS、NF-L顯著下降(P＜ 0.01)，GAP43顯著提高(P＜0.01)；與模型組相比，30 g組和 120 g組nNOS、NF-L、GAP43含量顯著升高(P＜ 0.01)；與30 g組相比，120 g組 nNOS、NF-L、GAP43含量明顯增加(P＜0.01)(見圖5)。

圖2 Masson三色染色顯示大鼠陰莖海綿體組織中平滑肌和膠原纖維含量(n＝3)Note.The red arrows indicate smooth muscles.Compared with sham operation group， ＆＆P＜ 0.01.Compared with model group， ??P＜ 0.01.Compared with group 30 g，#P＜ 0.05， ##P＜ 0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Masson trichrome stain shows the content of smooth muscle and collagen fibers in the spongy tissues of rat penises(n＝3)

圖3 各組大鼠海綿體內(nèi)壓測(cè)定結(jié)果(n＝3)Figure 3 ICP measurement results in each group(n＝3)

圖5 各組大鼠海綿體nNOS、NF-L、GAP43表達(dá)變化(n＝3)Figure 5 Expression changes of nNOS、NF-L and GAP43 in cavernous of rats in each group(n＝3)

3 討論

海綿體神經(jīng)損傷屬于周圍神經(jīng)損傷，祖國(guó)醫(yī)學(xué)中無此病名，但據(jù)其臨床表現(xiàn)癥狀，與中醫(yī)所謂“痹癥”和“痿證”頗為相似，當(dāng)屬經(jīng)絡(luò)傷之范疇?！稄V嗣紀(jì)要·協(xié)期》曰：“氣至則血至，陰莖則勃起剛”，可見男性的勃起需要健全的血?dú)膺\(yùn)行[11]，反而言之，當(dāng)氣血運(yùn)行受阻則“血少不充，陰莖不怒”。RP后ED病機(jī)多為經(jīng)絡(luò)不通，經(jīng)氣不續(xù)，氣虛血滯，以致陰莖痿而不用。針對(duì)此病機(jī)，可考慮將益氣活血法運(yùn)用于臨床治療RP術(shù)后ED。且中藥藥理學(xué)研究表明，益氣活血方劑具有改善微循環(huán)、血液流變學(xué)、抗氧化等藥理作用，可見，益氣活血法或可于多方面調(diào)節(jié)、糾正RP后ED。

補(bǔ)陽還五湯出自《醫(yī)林改錯(cuò)》，是經(jīng)典的益氣活血方，大量研究結(jié)果表明，補(bǔ)陽還五湯可通過SIRT1/VEGF通路、減少自然殺傷細(xì)胞浸潤(rùn)、改善微循環(huán)等多個(gè)方面修復(fù)大鼠神經(jīng)損傷[12-14]；Pan等[15]通過手術(shù)造成大腦中動(dòng)脈閉塞性神經(jīng)損傷大鼠模型，隨后予以補(bǔ)陽還五湯灌胃干預(yù)，灌胃后第7天與第14天大鼠神經(jīng)損傷明顯改善；劉青龍[16]以補(bǔ)陽還五湯口服加藥浴的方式干預(yù)坐骨神經(jīng)損傷大鼠模型，干預(yù)后第2、4、6周，模型組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度較對(duì)照組顯著增快；且臨床數(shù)據(jù)顯示，補(bǔ)陽還五湯能夠明顯改善缺血性卒中患者神經(jīng)功能，經(jīng)治療后NIHSS評(píng)分、ADL評(píng)分顯著提高[17]。也有學(xué)者通過研究證實(shí)，補(bǔ)陽還五湯能夠改善博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化[18]。而臨床上使用補(bǔ)陽還五湯治療勃起功能障礙也有報(bào)道，胡衛(wèi)東等[8]運(yùn)用加味補(bǔ)陽還五湯治療糖尿病性ED，亦取得較好的療效，但細(xì)觀文獻(xiàn)中所用黃芪量?jī)H為30 g；且中華人民共和國(guó)藥典中生黃芪最大用量也僅為30 g[19]，而原方中重用黃芪120 g；仝小林認(rèn)為“重劑起沉疴”，治療ED時(shí)一般重用生黃芪120 g[20]大補(bǔ)元?dú)?，令氣旺血行。那么黃芪用量是否與其神經(jīng)保護(hù)效果、改善勃起效果具有密切相關(guān)性，值得研究。

本實(shí)驗(yàn)通過鉗夾SD大鼠海綿體神經(jīng)造成ED模型后予以不同黃芪劑量的補(bǔ)陽還五湯灌胃干預(yù)，使用ICP測(cè)定評(píng)估大鼠勃起功能；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：模型組大鼠ICP水平顯著降低，而相對(duì)于模型組而言，30 g組與120 g組大鼠ICP明顯升高，且120 g組高于30 g組，這表明了補(bǔ)陽還五湯確實(shí)能改善大鼠勃起功能障礙，且120 g組治療效果優(yōu)于30 g組。從分子水平來看，模型組大鼠陰莖海綿體組織NF-L、nNOS、GAP43表達(dá)量顯著降低，陰莖海綿體組織膠原纖維面積增大，補(bǔ)陽還五湯灌胃干預(yù)后，30 g組與120 g組大鼠nNOS、NF-L、GAP43表達(dá)量基于模型組有所提高，且120 g組與30 g組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。nNOS可以通過催化左旋精氨酸來產(chǎn)生NO，而NO則為體內(nèi)主要的舒張血管的物質(zhì)，通過舒張神經(jīng)滋養(yǎng)血管進(jìn)而發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)的作用[21-22]，GAP43在神經(jīng)元支撐、營(yíng)養(yǎng)、保護(hù)、軸突再生等方面起到重要的作用[23-24]，在神經(jīng)修復(fù)過程中表達(dá)上調(diào)，被認(rèn)為是神經(jīng)損傷后再生的重要指標(biāo)[25]；NF-L作為細(xì)胞骨架組成主要組成成分，對(duì)于維持神經(jīng)形態(tài)具有十分重要的作用[26]，神經(jīng)損傷后失去營(yíng)養(yǎng)作用，不能維持正常形態(tài)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，最終導(dǎo)致NF-L表達(dá)量下降。本研究中各組大鼠nNOS、NF-L、GAP43表達(dá)量的變化為補(bǔ)陽還五湯在神經(jīng)保護(hù)再生方面作用提供了確切依據(jù)，也說明了補(bǔ)陽還五湯可通過保護(hù)、修復(fù)海綿體神經(jīng)從而改善勃起功能障礙。然而從Masson染色中可看到，模型組大鼠海綿體平滑肌含量下降，膠原含量增加，而30 g組與120 g組大鼠陰莖海綿體膠平滑肌含量增加，原纖維含量降低，海綿體平滑肌在海綿體組織中占45%，其作為陰莖的重要組成部分，在陰莖勃起的啟動(dòng)和維持中發(fā)揮關(guān)鍵作用[27]，Cho等[28]提出海綿體損傷是引起陰莖纖維化的重要因素，與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符；同時(shí)也意味著補(bǔ)陽還五湯在保護(hù)修復(fù)神經(jīng)的同時(shí)還能在一定程度上改善陰莖組織纖維化從而改善勃起功能，但其確切機(jī)制有待深入研究。

綜上所述，補(bǔ)陽還五湯可以通過神經(jīng)修復(fù)有效改善大鼠勃起功能障礙并能在一定程度上改善陰莖海綿體組織纖維化，且《醫(yī)林改錯(cuò)》原方所用高劑量黃芪用量的補(bǔ)陽還五湯治療效果更為顯著。