CRISPR/Cas9介導(dǎo)人HBB基因突變體在豬成纖維細(xì)胞的靶向敲入

張婷婷，楊漫漫，魏強(qiáng)，李燕莉，李林，王然，胡莉花，姜芳芳，劉瑜，趙衛(wèi)華，李勇1，?

(1.深圳華大三生園科技有限公司，廣東深圳 518000；2.深圳動(dòng)物基因組輔助育種工程實(shí)驗(yàn)室，廣東深圳 518000；3.深圳市華大農(nóng)業(yè)應(yīng)用研究院，廣東 深圳 518000；4.重慶市醫(yī)藥衛(wèi)生學(xué)校，重慶 408000；5.深圳市第二人民醫(yī)院，深圳大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東深圳 518028)

地中海貧血癥主要是調(diào)控珠蛋白合成的基因發(fā)生缺失或突變，導(dǎo)致構(gòu)成血紅蛋白的α鏈和β鏈珠蛋白鏈表達(dá)不平衡、紅細(xì)胞壽命縮短的一種溶血性血液疾病。全球160多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有近2.8億地中海貧血病患者。β地貧是廣東省發(fā)病率最高、危害最大的遺傳病之一。其致病原因是第11號(hào)染色體的β-珠蛋白(β-globin)基因發(fā)生缺失或點(diǎn)突變，造成β-珠蛋白合成完全或部分受抑，導(dǎo)致α/β鏈比例失衡，進(jìn)而發(fā)生溶血性貧血。在多種β基因突變或缺失中，Codons41/42(-CTTT)突變約占β-地貧突變的36%以上[1]。一直以來，造血干細(xì)胞移植是唯一治愈β地貧的手段，但配型合格的供體少之又少。近年來，基于特定突變修復(fù)的基因治療將成為β地貧永久性“治愈”最有效的手段之一。

為便于開展對(duì)Codons41/42(-CTTT)突變型β地貧的基因治療研究，國(guó)內(nèi)外已通過多種途徑建立了攜帶該突變體的載體、細(xì)胞甚至基因工程小鼠[2]。Niu等[3]利用來自β地貧病人細(xì)胞構(gòu)建的純合HBBCodons41/42(-CTTT)突變的iPS細(xì)胞，結(jié)合CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行突變矯正，并評(píng)價(jià)矯正細(xì)胞的功能特性。然而，iPS細(xì)胞實(shí)驗(yàn)只能體外檢測(cè)編輯效率和功能特性，無法完成體內(nèi)的功能和安全性評(píng)價(jià)。Jamsai等[4]利用基因打靶技術(shù)制備了人HBB41/42(-CTTT)小鼠，發(fā)現(xiàn)純合子小鼠存活到妊娠后期，表現(xiàn)出嚴(yán)重的貧血癥狀。盡管β地貧小鼠模型可以比較好的模擬其病理過程，但像地貧患者輸血后出現(xiàn)的鐵過載現(xiàn)象在實(shí)驗(yàn)鼠的身上卻不能完全擬合，不能很好反映出病程。因此，其作為臨床前的藥物使用劑量、安全評(píng)價(jià)并不合適[5]。因此，開發(fā)攜帶人β地貧大動(dòng)物模型十分必要。

我們發(fā)現(xiàn)，較小鼠而言，豬與人β-珠蛋白氨基酸一致性較更高，達(dá)到85%。此外，天然豬血紅蛋白與人血紅蛋白的分子構(gòu)象幾乎一致，二者有高度相似的抗原性[6]。這提示我們：豬β-珠蛋白在其生物學(xué)功能上或許與人β-珠蛋白更為相似，暗示以豬HBB蛋白突變體而構(gòu)建地貧模型，更能模擬出人地貧癥的機(jī)制。因此，開發(fā)攜帶人β地貧大動(dòng)物模型十分必要。同時(shí)，豬在器官發(fā)育、生理生化、疾病進(jìn)程以及基因組序列方面和人類具有高度的相似性，是人類疾病的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，被廣泛應(yīng)用到生物醫(yī)學(xué)研究[7]。在血液生理生化方面，小型豬19項(xiàng)生理指標(biāo)、9項(xiàng)生化指標(biāo)和人類的參考值接近[8]。以豬替代小鼠研究人地貧等相關(guān)疾病模型具有無法比擬的優(yōu)勢(shì)。

本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)制備了攜帶人源化HBB基因Codons41/42(-CTTT)突變體的巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞株，經(jīng)PCR方法和DNA測(cè)序法驗(yàn)證了插入的hHBB突變體基因序列正確。最后，通過PCR方法檢測(cè)到表達(dá)外源hHBBCodons41/42(-CTTT)基因的細(xì)胞株6株。該細(xì)胞株為進(jìn)一步獲得人地貧的小型豬模型，為研究地貧的發(fā)生、發(fā)展及新藥創(chuàng)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及載體

CRR質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并合成，hCas9為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)種豬測(cè)定中心韓曉松博士提供，豬PK細(xì)胞和巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧研究所楊述林研究組提供。

1.1.2 主要試劑與儀器

限制性內(nèi)切酶、T7核酸內(nèi)切酶、T4連接酶均購(gòu)于NEB公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)于Omega公司；Lipofectamine2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)于Invitrogen公司；電轉(zhuǎn)染試劑盒 AmaxaBasic Nucleofector Kit Primary Fibroblasts購(gòu)于Lonza公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 TransScriptFirst-StrandcDNA Synthesis SuperMix購(gòu)于北京全式金生物公司。

高速離心機(jī)(Eppendrof，德國(guó))，倒置光學(xué)顯微鏡(萊卡，德國(guó))，核轉(zhuǎn)儀(Lonza，瑞士)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Eppendrof，德國(guó))，水浴鍋(北京六一儀器廠)電泳槽(北京六一儀器廠)，PCR擴(kuò)增儀(Bio-Rad，美國(guó))，凝膠成像儀(Bio-Rad，美國(guó))。

1.2 方法

1.2.1 sgRNA設(shè)計(jì)及表達(dá)載體構(gòu)建

根據(jù)豬HBB基因序列(Gene ID：407066)，利用張鋒實(shí)驗(yàn)室在線網(wǎng)站http：//crispr.mit.edu/設(shè)計(jì)了11條靶向 sgRNA(small guide RNA)序列(表1)，sgRNA序列由華大基因合成，上、下游序列按體積比 1∶1混合，95℃，10 min；25℃，30 min；變性；退火后，以T4 DNA連接酶介導(dǎo)，連接入BsaI內(nèi)切酶酶切回收后的骨架載體CRR，最終構(gòu)建出CRR-sgRNA表達(dá)載體。將該載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)涂板、挑選單克隆菌落和菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆。

1.2.2 sgRNA活性鑒定

轉(zhuǎn)染前24 h將豬PK15細(xì)胞鋪于24孔板(1×104細(xì)胞/孔)，次日，將構(gòu)建好的 sgRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞(參照Lipo2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書)，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒總量500 ng，hCas9：CRR-sgRNA＝3∶1。 細(xì)胞于培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。收集細(xì)胞并提取基因組DNA(gDNA)，按表 2 引物做 PCR，體系為：gDNA 0.1 μg，Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物(10 μmol/L) 各 0.4 μL，ddH2O補(bǔ)足體積至20 μL。PCR反應(yīng)程序：98℃，1 min；98℃ 10 s，58℃ 30 s，72℃ 10 s，循環(huán) 32 次；72℃，5 min。

T7 變性程序：95℃，10 min；95～85℃(-2.0℃ /s)；85～25℃(-0.3℃ /s)；25℃，1 min。

T7酶切反應(yīng)體系：PCR 產(chǎn)物 17 μL，NEB Buffer 2 2 μL，T7 酶 0.2 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積至20 μL。 反應(yīng)條件：37℃，45 min。將酶切產(chǎn)物電泳后利用DNA凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。

表1 sgRNA靶點(diǎn)序列Table 1 Sequences of the sgRNAs

表2 sgRNA活性鑒定引物Table 2 Primers used for PCR of sgRNA targeted sites

1.2.3 人源化HBB基因打靶載體構(gòu)建

靶位點(diǎn)上、下游1000 bp左右的序列作為同源臂序列，設(shè)計(jì)含有NotI酶切位點(diǎn)的上游同源臂引物、含有XhoI酶切位點(diǎn)的下游同源臂引物及融合擴(kuò)增引物(表3)。以豬基因組DNA為模板，擴(kuò)增上、下游同源臂，反應(yīng)體系為：gDNA 0.1 μg，KOD Buffer 5 μL，2 mmol dNTPs 5 μL，25 mmol MgSO42 μL，上、下游引物(10 μmol/L) 各 1.5 μL， DNA 聚合酶1 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積至 50 μL。 PCR 反應(yīng)程序：94℃，3 min；94℃，15 s；55℃，30 s；72℃，2 min，循環(huán)35次；72℃，5 min。PCR產(chǎn)物回收作模板，進(jìn)行融合PCR。把融合PCR產(chǎn)物與pGH-T載體(NotI和XhoI切過)進(jìn)行融合，融合反應(yīng)體系為：pGH-T載體5 μL，融合 PCR 產(chǎn)物 3 μL，infusion 酶 2 μL。 反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃，15 min，構(gòu)建重組載體 pGH-LA-RA，測(cè)序序列完全正確后，大量提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒備用。

以hHBB(CD41/42，-CTTT)-T質(zhì)粒為模板，分別擴(kuò)增兩個(gè)片段，反應(yīng)的引物序列見表4。hHBB(CD41/42，-CTTT)片段擴(kuò)增反應(yīng)體系：DNA 0.05 μg，KOD Buffer 5 μL，2 mmol dNTPs 5 μL，25 mmol MgSO42 μL，上下游引物(10 μmol/L)各 1.5 μL，DNA 聚合酶 1 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積至 50 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃，3 min；94℃ 15 s，55℃ 30 s，72℃2min，循環(huán) 35 次；72℃，5 min。 PCR 產(chǎn)物回收后，進(jìn)行融合PCR。融合PCR產(chǎn)物經(jīng)BsaI酶介導(dǎo)構(gòu)建于重組骨架載體pGH-LA-RA。

1.2.4 CRISPR/Cas9載體及同源重組載體轉(zhuǎn)染巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞

將 CRISPR/Cas9 3 μg、sgRNA 環(huán)狀質(zhì)粒1 μg 和hHBB同源重組載體3 μg通過電穿孔轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞。轉(zhuǎn)染60 h后，采用有限稀釋法將細(xì)胞懸液稀釋至每個(gè)培養(yǎng)皿5000個(gè)細(xì)胞，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)條件：37℃，5%CO2。

表3 左右同源臂擴(kuò)增引物序列及融合擴(kuò)增引物序列Table 3 Primers used for PCR or infusion PCR of the homologous arms

表4 人源hHBB片段擴(kuò)增及融合引物序列Table 4 Primers used for PCR or infusion PCR of the human HBB gene

1.2.5 單克隆細(xì)胞系篩選及鑒定

轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，用含 400 μg/mL G418、20%FBS的DMEM藥篩培養(yǎng)基藥篩5 d，而后用含20%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)7 d，至第12天形成單克隆細(xì)胞團(tuán)，用單克隆環(huán)挑選生長(zhǎng)狀態(tài)好、大小合適的單克隆細(xì)胞團(tuán)到48孔細(xì)胞培養(yǎng)板。待細(xì)胞匯合度達(dá)90%對(duì)單克隆細(xì)胞消化，進(jìn)行PCR鑒定。

對(duì)收集到的單克隆細(xì)胞進(jìn)行裂解，裂解程序60℃，60 min；95℃，10 min，以細(xì)胞裂解產(chǎn)物(gDNA)為模板，分別用3對(duì)定點(diǎn)敲入鑒定引物進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表5。

第1對(duì)鑒定引物為轉(zhuǎn)基因陰陽(yáng)性鑒定引物，第2對(duì)鑒定引物為跨左同源臂鑒定引物、第3對(duì)為跨右同源臂鑒定引物，三對(duì)引物反應(yīng)體系為：DNA 2 μL，Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積至 20 μL。 反應(yīng)程序均為：98℃，1 min；98℃ 10 s，65℃ 30 s，72℃ 1 kb/s，循環(huán) 35 次；72℃，5 min。

3對(duì)鑒定引物擴(kuò)增均為陽(yáng)性的細(xì)胞株，將其傳代到12孔板繼續(xù)培養(yǎng)，代細(xì)胞匯合度達(dá)到90%及以上時(shí)，進(jìn)行凍存。

1.2.6 人源化HBB基因定點(diǎn)敲入細(xì)胞株純合子、雜合子鑒定

針對(duì)豬HBB基因序列設(shè)計(jì)了一對(duì)鑒定定點(diǎn)敲入細(xì)胞株為純合子或雜合子的鑒定引物，

采用1.2.5中細(xì)胞裂解產(chǎn)物(gDNA)為模板，用純/雜合子鑒定引物進(jìn)行擴(kuò)增，上游引物sp-pHBB-iden-F1(AGGCAGGATGCCGTTTAGAA)；下游引物sp-pHBB-iden-R1(CACTATCACGTTGCCCAGGA)。反應(yīng)體系為：DNA 2 μL，Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物濃度為10 μmol/L各取 0.4 μL，ddH2O 補(bǔ)足體積至20 μL。反應(yīng)程序同步驟1.2.5。

表5 單克隆細(xì)胞定點(diǎn)敲入鑒定引物Table 5 Primers used for hHBB knock-in examination

1.2.7 人源化HBB基因在豬成纖維細(xì)胞中表達(dá)情況鑒定

根據(jù)人和豬HBB基因CDS區(qū)的差異，設(shè)計(jì)一對(duì)針對(duì)人源化HBB基因表達(dá)的鑒定引物，上游引物hHBB-iden-qF1(CTGAGGAGAAGTCTGCCGTTAC)，下游引物hHBB-iden-qR1(CAGGCCATCACTAAA GGCAC)。提取人源化HBB基因發(fā)生定點(diǎn)整合細(xì)胞株的總RNA，隨后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用鑒定引物hHBB-iden-qF1/R1進(jìn)行檢測(cè)。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系為：RNA 500 ng，Anchored Oligo(dT)18 1 μL，2X TS Reaction Mix 10 μL，TransScript RT/RI Enzyme Mix 1 μL，RNase-free Water補(bǔ)足體積至 20 μL。 反應(yīng)程序?yàn)椋?2℃，30 min 孵育。

PCR 反應(yīng)體系為：cDNA 1 μL，Premix Ex Taq 10 μL，上下游引物濃度為 10 μmol/L 各取 0.4 μL，ddH2O 補(bǔ)足至 20 μL。 反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃，1 min；98℃ 10 s，62℃ 30 s，72℃， 13 s，循環(huán) 35 次；72℃5min。同時(shí)，用內(nèi)參引物作為對(duì)照，按照前面的體系及反應(yīng)程序進(jìn)行擴(kuò)增。

2 結(jié)果

2.1 人、豬和鼠HBB基因比較分析

通過MegAlign7軟件Construct-Test Neighbor joining Tree算法對(duì)包括小鼠、豬、猴等8種哺乳類動(dòng)物與人HBB基因做系統(tǒng)發(fā)育樹分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：人HBB遺傳距離與靈長(zhǎng)類動(dòng)物最近，其次為豬，再其次為小鼠。即相比于小鼠而言，豬與人類HBB基因遺傳距離更近(圖1A)。我們進(jìn)一步利用UniProt網(wǎng)站在線軟件Clustal Omega對(duì)人、豬和小鼠β-珠蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明：小鼠與人β-珠蛋白氨基酸一致性為80%，而豬與人β-珠蛋白氨基酸一致性則更高，達(dá)到85%(圖1B)?？傊?，以上結(jié)果提示：豬β-珠蛋白在其生物學(xué)功能上或許與人β-珠蛋白更為相似，暗示以豬HBB蛋白突變體而構(gòu)建地貧模型，更能模擬出人地貧癥的機(jī)制。

2.2 CRR-sgRNA表達(dá)載體活性驗(yàn)證結(jié)果

本研究中合成了11條靶向sgRNA，分別連接CRR質(zhì)粒，構(gòu)建成11個(gè)CRR-sgRNA表達(dá)載體，并分別與CRISPR/Cas9表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染至PK15細(xì)胞中。48 h后，提取細(xì)胞基因組DNA作為PCR模板，用鑒定引物做PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行T7酶切和凝膠成像作鑒定。結(jié)果表明鑒定引物對(duì)#2sgRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物片段大小為913 bp，T7酶切后片段大小為364 bp和549 bp；鑒定引物對(duì)#11sgRNA擴(kuò)增后產(chǎn)物片段大小為877 bp，T7酶切后片段大小為393 bp和484 bp，#2sgRNA和#11sgRNA這兩條剪切活性高于其他9份(圖2)。

2.3 人源化打靶載體構(gòu)建結(jié)果

首先，以豬基因組DNA為模板，構(gòu)建同源臂載體pGH-LA-RA，其中左臂1.062×103，右臂1.024×103。其次，利用融合PCR方法將人HBB突變體插入pGH-LA-RA的兩個(gè)同源臂之間，構(gòu)建成帶有人源化HBB基因突變體(-CTTT)的同源重組終載體pGH-LA-hHBB-RA。進(jìn)行sanger測(cè)序驗(yàn)證，測(cè)序結(jié)果表明：攜帶有人源化HBB基因突變體的同源重組載體構(gòu)建成功，圖3所示包含“-CTTT”四堿基缺失的測(cè)序結(jié)果的峰圖，可用于下一步的轉(zhuǎn)染。

2.4 單克隆細(xì)胞株鑒定結(jié)果

利用電穿孔轉(zhuǎn)染法 CRISPR/Cas9質(zhì)粒、#2sgRNA和#11sgRNA及pGH-LA-hHBB-RA同源重組載體共同轉(zhuǎn)入巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后共獲得了99株單克隆細(xì)胞。再利用轉(zhuǎn)基因鑒定引物對(duì)敲入的人源化HBB基因突變體做PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后片段大小為1105 bp，凝膠成像結(jié)果如圖4A所示，結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖4B所示：一共鑒定了99株細(xì)胞，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞克隆為69份，轉(zhuǎn)基因陰性細(xì)胞克隆為30份。

圖1 比較分析人、豬和小鼠HBB基因序列Note.A.Building the phylogenetic trees for HBB genes of 8 different mammals.B.Identities of β-globin amino acid among human， pig and mouse.Figure 1 Identities of the HBB gene sequence among human，pig and mouse

圖2 豬HBB基因sgRNA T7酶切活性驗(yàn)證結(jié)果Note.gR1～11.Cell samples transfected with sgRNA1～11 plasmids respectively.EGFP.Control cell sample transfected with EGFP plasmid.M1.100 bp DNA ladder marker.M2.200 bp DNA ladder marker.Figure 2 T7 Enzyme digestion for Pig HBB gene sgRNA activity examination

圖3 同源重組打靶載體測(cè)序結(jié)果Figure 3 Homologous recombination targeting vector sequencing results

左端同源臂鑒定，上游引物位于左端同源臂外側(cè)，下游引物位于人源化HBB基因特異性區(qū)域內(nèi)，可完全擴(kuò)增出左同源臂全長(zhǎng)及部分hHBB基因，PCR產(chǎn)物大小為1550 bp，擴(kuò)增結(jié)果如圖5A所示。結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖5B：一共鑒定了99株細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞克隆為25株，陰性細(xì)胞克隆為74份。

右端同源臂鑒定，上游引物位于hHBB基因特異性區(qū)域，下游引物位于右端同源臂外側(cè)，PCR產(chǎn)物大小為1507 bp，擴(kuò)增結(jié)果如圖6A所示。結(jié)果統(tǒng)計(jì)如圖6B所示，一共鑒定了32株細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞克隆為15份，陰性細(xì)胞克隆為17份?？傊ㄟ^對(duì)99個(gè)細(xì)胞克隆的篩選與基因型鑒定，我們一共獲得69株整合人HBB基因的豬成纖維細(xì)胞，其中定點(diǎn)整合15株，隨機(jī)定點(diǎn)整合54株。

通過上述3重PCR鑒定，篩選出3對(duì)引物都鑒定為陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞，并做hHBB突變體位點(diǎn)的sanger測(cè)序。如圖7所示，豬HBB基因靶序列為CTTC，正常人源HBB基因靶序列為CTTT，而人源HBB基因突變體對(duì)應(yīng)的位置缺少4個(gè)堿基(-CTTT)，測(cè)序結(jié)果(圖7A)證明：我們?cè)诎婉R胎豬胚胎成纖維細(xì)胞中成功地插入了人源化HBB基因的突變體。隨后，我們通過對(duì)豬內(nèi)源HBB(pHBB)基因檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)全部樣品均能擴(kuò)增到pHBB條帶，并未鑒定到純合子細(xì)胞，即本實(shí)驗(yàn)所得15株細(xì)胞均為雜合子(圖7B)。最后，通過提取細(xì)胞總RNA和進(jìn)一步的PCR驗(yàn)證，我們共獲得6株陽(yáng)性表達(dá)外源HBB基因的突變體(圖7C)。

3 討論

圖4 轉(zhuǎn)基因陰陽(yáng)性鑒定引物擴(kuò)增結(jié)果Note.A.Amplification result of transgene identification primer.M.100 bp plus DNA Ladder Marker.P.Positive control.WT.Wild type control.1～5.The number of cell clones identified.B.Number of positive and negative cell clones.Figure 4 Amplification result of transgenic negative and positive identification primers

圖5 跨左端同源臂鑒定引物擴(kuò)增結(jié)果Note.A.Identify primer amplification results across the left homology arm.M.1 kb DNA ladder marker.1～6.The number of cell clones identified.B.Number of positive and negative cell clones.Figure 5 Identify primer amplication results across the left homology arm

圖6 跨右端同源臂鑒定引物擴(kuò)增結(jié)果Note.A.Identify primer amplification results across the right homology arm.M.1 kb DNA Ladder Marker.1～5.The number of cell clones identified.B.Number of positive and negative cell clones.Figure 6 Identify primer amplication results across the right homology arm

圖7 豬胎兒成纖維細(xì)胞hHBB基因型及基因表達(dá)檢測(cè)Note.A.Sequence comparison of swine wild-type HBB gene，human wild-type HBB gene and human mutant HBB gene.B.Identification of 15 homozygous and heterozygous site-specific knock-in cell lines.C.Identification results of humanized HBB gene expression in targeted knock-in cell lines.Figure 7 hHBB genotype and mRNA expression examination in the pig fibroblasts

我國(guó)的地貧患者主要分布于廣東、廣西、湖南、四川、云南和貴州等南部省份[9]，β地中海貧血是廣東省發(fā)病較高的地貧類型[10]。β地貧涉及到200多種 β珠蛋白突變，熱點(diǎn)的突變類型包括Codons41/42(-CTTT)、IVS-II-654(C→T)、-28(A→G)、IVS1.6(T→C)、-87(C→G)等，其中 Codons41/42(-CTTT)作為主要的突變體約占發(fā)病人群的36%以上。β珠蛋白基因在哺乳動(dòng)物中保守性較好。由于純合敲除的小鼠致死性較高，加上缺乏特定的突變體，應(yīng)用性較差。相比而言，攜帶人源化突變體的雜合小鼠能較好模擬β-地貧的相關(guān)癥狀，同時(shí)包含特定的人類突變位點(diǎn)，為基因治療提供了理想的靶點(diǎn)材料[4]。然而，我們對(duì)小鼠、豬與人的HBB基因和蛋白氨基酸比對(duì)發(fā)現(xiàn)，小鼠、豬與人的HBB蛋白同源性分別為80%和85%，較小鼠而言豬與人HBB遺傳距離更近。根據(jù)這些數(shù)據(jù)我們推測(cè)，無論是研究HBB基因功能，或是研究HBB突變體致地貧發(fā)病機(jī)制，利用豬為研究對(duì)象更能模擬其在人體內(nèi)的生物學(xué)本質(zhì)。且小鼠由于體型大小和生理生化數(shù)據(jù)一致性的限制，并不是基因治療最為理想的疾病模型。本研究采用同樣的思路構(gòu)建了攜帶人源化HBB基因突變體同源打靶載體，并利用兩條靶向切割豬內(nèi)源HBB基因的sgRNA對(duì)其進(jìn)行了敲除，同時(shí)結(jié)合同源重組修復(fù)，使得攜帶了目的突變體的人源HBB基因準(zhǔn)確地敲入到巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞基因組之中。該方法制備的突變體敲入陽(yáng)性細(xì)胞可作為核供體，借助體細(xì)胞克隆技術(shù)，為下一步創(chuàng)制攜帶缺陷型人源化HBB基因的地貧模型豬奠定基礎(chǔ)。

本研究中，我們將CRISPR/Cas9體系及同源重組載體經(jīng)電轉(zhuǎn)染方式導(dǎo)入巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞，并結(jié)合G418藥物篩選獲得單克隆細(xì)胞。我們一共鑒定了99株單克隆，其中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性克隆69株，效率為69.7%，定點(diǎn)敲入人源化HBB基因突變體的陽(yáng)性細(xì)胞15株，陽(yáng)性率為15%。在這些成功定點(diǎn)敲入的細(xì)胞中1株純合，其余為雜合，單等位基因的同源重組效率遠(yuǎn)高于雙等位基因。

CRISPR/Cas9技術(shù)的介導(dǎo)可提高同源重組效率達(dá)千倍以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)基因打靶效率，相比而言，我們的結(jié)果稍低于同類定點(diǎn)整合效率。相關(guān)研究表明定點(diǎn)整合效率與多種因素有關(guān)，如細(xì)胞類型、同源臂的長(zhǎng)短、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)染效率等[11-15]。從細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制看，非同源末端連接修復(fù)和同源重組修復(fù)同時(shí)存在，但在非分裂期的細(xì)胞中，細(xì)胞會(huì)更偏向于非同源末端連接修復(fù)，如此一來，重組效率在一定程度上受到了影響，人們常用NHEJ的抑制劑Scr7或HDR相關(guān)RAD51激動(dòng)劑RS-1，從而使同源重組修復(fù)效率顯著提高[16]。在轉(zhuǎn)染效率方面，一方面，不同的轉(zhuǎn)染方式會(huì)影響效率，慢病毒或核轉(zhuǎn)染比電轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體等其他轉(zhuǎn)染方式效率更高；另一方面，轉(zhuǎn)染體系的構(gòu)成在一定程度上也會(huì)影響轉(zhuǎn)染的效率，多個(gè)載體共轉(zhuǎn)染較單個(gè)多基因表達(dá)載體效率低[17]。當(dāng)然，我們可以通過藥物篩選或流式細(xì)胞儀富集的方式來彌補(bǔ)轉(zhuǎn)染效率的不足，從而提高同源重組效率。

在同源臂長(zhǎng)度研究方面，傳統(tǒng)的基因打靶研究表明同源臂長(zhǎng)度與重組效率成正比[18]，但在CRISPR/Cas9介導(dǎo)的HDR中，同源臂的影響并不一定是正相關(guān)，不同的研究有不同的結(jié)果，如Li等[19]利用5’端1.2×103同源臂長(zhǎng)度，3’端5.6×103同源臂長(zhǎng)度的打靶載體結(jié)合TALEN技術(shù)在豬Rosa26位點(diǎn)獲得31.3%的整合效率；Ruan等[20]利用左右同源臂長(zhǎng)度均為0.8×103的載體結(jié)合CRISPR/Cas9技術(shù)在豬H11位點(diǎn)獲得23%的整合效率；此外，Xie等[21]的研究結(jié)果表示當(dāng)5’端、3’端同源臂長(zhǎng)度分別為0.5×103和1×103時(shí)整合效率較高，能達(dá)到29.6%；相比而言，我們打靶載體左臂1.062×103，右臂1.024×103?？梢?，同源臂的長(zhǎng)短能在一定程度上影響同源重組效率，但并沒有一致性的規(guī)律。

本研究以巴馬豬胎兒成纖維細(xì)胞作為研究材料，利用CRISPR/Cas9基因編輯手段，制備出攜帶人源化HBB基因突變體的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞株。未來，這些陽(yáng)性細(xì)胞可作為核供體，為下一步創(chuàng)制攜帶缺陷型人源化HBB基因的地貧模型豬奠定基礎(chǔ)，也為人們研究地貧的發(fā)生機(jī)制和臨床治療提供珍貴的材料。