兩種呼吸道感染方式建立小鼠流感病毒感染模型的比較

楊玉琴，徐春華，周文江，周曉輝?

(1.上海市第一人民醫(yī)院，上海 200080；2.上海市公共衛(wèi)生臨床中心，上海 201508；3.復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203)

流感是由流感病毒引起的一種急性呼吸道傳染病，容易引起爆發(fā)流行，對(duì)人類公共健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年約有25～50萬人死于季節(jié)性流感，占每年所有死亡人數(shù)的0.5%～1%[1-2]。近些年來新型的跨物種呼吸道流感病毒不斷出現(xiàn)，如1997 年H5N1、2009 年H1N1、2013年 H7N9，這些新型呼吸道流感病毒不可預(yù)知、傳播速度快、防控困難、死亡率高，對(duì)人類的威脅更為嚴(yán)重[3]。因此，對(duì)于流感發(fā)病機(jī)制及新型疫苗和藥物的開發(fā)研究是十分必要的，而選擇合適的流感動(dòng)物模型是進(jìn)行此類研究的基礎(chǔ)與保證。

目前已知人類流感的傳播方式主要有三種，一是氣溶膠，二是飛沫，三是接觸[4]。因此，選擇與人類傳播方式類似的感染方式對(duì)構(gòu)建流感動(dòng)物模型至關(guān)重要。滴鼻和氣溶膠感染是目前被認(rèn)為較為合理的感染方式[5-6]，本研究通過對(duì)這兩種感染方式建立模型的比較，分析不同建模方式對(duì)流感模型的影響，從而為流感病毒不同層面的研究選擇合適感染方式建立模型提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

120只4～6周齡SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠，體重18～20 g。由上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2018-0004】提供。實(shí)驗(yàn)在 ABSL-2(動(dòng)物生物安全Ⅱ級(jí))實(shí)驗(yàn)室(注冊(cè)備案號(hào)：金字第022006005號(hào))中開展，溫度22～26℃、濕度40%～60%，12 h日夜周期交替。所有操作均符合上海市公共衛(wèi)生臨床中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理要求(IACUC號(hào)：公衛(wèi)倫審2018-A60-02)。

1.1.2 病毒株

流感病毒株為 H1N1 PR8，經(jīng)無特定病原體(specific pathogen free，SPF)雞胚增殖后收集病毒尿囊液，病毒濃度為每毫升1×106TCID50，-80℃儲(chǔ)存?zhèn)溆茫瑢?shí)驗(yàn)均在BSL-2(生物安全I(xiàn)I級(jí))實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行。

1.1.3 主要試劑與儀器

DMEM 培養(yǎng)液(Gibco，1868707)，異氟烷(上海雅培制藥有限公司，B506)，RNA抽提試劑盒(QIAGEN GmbH，52906)，RT-PCR kit(Perfect Real Time，RR096A)，CBA KIT(BD，552364)。

生物安全柜(HR40-II A2，Haier，中國)，流式細(xì)胞儀(LSR Fortessa，BD 公司，美國)，PCR 儀(ViiA7，ABI，美國)，勻漿機(jī)(607EUR，Biospec，美國)，微量分光光度計(jì)(Nanodrop 1000，Thermo，美國)。

1.2 方法

1.2.1 LD50的測(cè)定和小鼠感染

H1N1 PR8 分別稀釋 1、10、100、1000、10000，80只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分成滴鼻和氣溶膠各5組，每組8只，氣溶膠各組分別將小鼠放入氣霧攻擊裝置，將不同濃度5 mL病毒放入吸入的玻璃管中，按照一定程序進(jìn)行氣溶膠感染，具體程序參考文獻(xiàn)[7]。滴鼻各組分別給每只小鼠鼻腔滴入不同濃度50 μL病毒，逐日觀察小鼠死亡情況，按 Reed-Muench法計(jì)算兩種感染方式的半數(shù)致死量(LD50)。

40只C57BL/6小鼠，隨機(jī)分成滴鼻組和氣溶膠組，用0.5 LD50的病毒濃度進(jìn)行感染，感染當(dāng)日記為0 d，感染后小鼠分籠飼養(yǎng)在獨(dú)立送風(fēng)隔離籠具中，觀察14 d。逐日觀察小鼠發(fā)病情況，并記錄每日體重變化及死亡情況。

1.2.2 觀察指標(biāo)

每日觀察感染小鼠的臨床表現(xiàn)，稱體重，每組感染小鼠分別于感染后第3、7、14天處死，各處死4只，剩余小鼠繼續(xù)觀察。小鼠處死前稱量體重和采血，小鼠處死后打開胸腔，迅速取出肺稱量肺濕重，肉眼觀察肺大體病變后進(jìn)行取材。取左肺上葉同一部位約1 cm×1 cm×1 cm組織做HE染色，鏡下觀察其病理變化；取部分肺組織做病毒和細(xì)胞因子檢測(cè)。并統(tǒng)計(jì)感染小鼠體重改變率和肺指數(shù)變化，具體計(jì)算方法參考文獻(xiàn)[7]。

1.2.3 肺組織總RNA提取及病毒載量檢測(cè)

抽提組織中的總 RNA，測(cè)定核酸濃度(OD 260/OD 280)后，加 RNAase-free DNAse I 37℃放置20 min，然后65℃放置10 min。純化后的樣本進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，擴(kuò)增體系為25 μL：12.5 μL TaqMan PCR基礎(chǔ)液，上下游引物各1.5 μL(10 μmol/L)，TaqMan 探針1.2 μL，2.5 μLRNA 模板，水(無 RNA 酶)5.8 μL。 擴(kuò)增程序：42℃ 10 min；95℃1 min；95℃ 15 s，60℃ 45 s，45 個(gè)循環(huán)(表 1)。

1.2.4 肺組織細(xì)胞因子的測(cè)定

肺組織勻漿后，取上清，采用CBA細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，嚴(yán)格參照流式微珠陣列術(shù)說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 LD50的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果按Reed-Muench法計(jì)算H1N1 PR8通過滴鼻和氣溶膠兩種方式感染C57BL/6小鼠的 LD50值，結(jié)果分別為每毫升 7.94×103TCID50和每毫升1.32×102TCID50，用不同濃度的病毒感染小鼠，滴鼻和氣溶膠感染小鼠死亡率比較見表2。

2.2 臨床癥狀觀察

兩組小鼠在感染后的第3天均開始出現(xiàn)反應(yīng)遲鈍、厭食、豎毛及體重減輕等癥狀，分別于第5、7天開始出現(xiàn)小鼠死亡，存活的小鼠在感染后第10天癥狀開始減輕。在體重方面，兩組小鼠都是體重先降低后逐漸恢復(fù)。在感染早期的體重降低期，兩組小鼠的體重降低率為氣溶膠組大于滴鼻組，在感染后期的體重恢復(fù)期，體重恢復(fù)率也是氣溶膠組大于滴鼻組(圖1A)。兩組小鼠的肺指數(shù)變化均為先增高后降低，在感染后第7天達(dá)到最高。第3天的肺指數(shù)，氣溶膠組與滴鼻組相比有顯著的差異(P＜0.05)；第7天和第14天的肺指數(shù)，兩組無差異(圖1B)。

2.3 感染小鼠肺組織病毒載量測(cè)定

各組小鼠于感染后第3、7、14天處死，肺組織勻漿后取上清進(jìn)行病毒載量的測(cè)定，檢測(cè)結(jié)果為各感染組均于感染后第3天的病毒載量最高，第7、14天逐漸降低。第3天氣溶膠組小鼠的病毒量載量顯著高于滴鼻組小鼠(P＜0.05)；第7、14天的氣溶膠組小鼠的病毒載量仍高于滴鼻組小鼠，但無顯著性差異(圖2)。

2.4 感染小鼠病理學(xué)觀察

滴鼻感染組小鼠肺的病理變化：感染后第3天小鼠肺部的病變范圍為10%～30%，主要集中在主支氣管肺部，鏡下可見一定量的炎細(xì)胞浸潤肺泡間隔；感染后第7天小鼠肺部的病變范圍為70%～90%，鏡下可見大量的炎細(xì)胞的浸潤到肺泡間隔及肺泡內(nèi)，部分區(qū)域出現(xiàn)間質(zhì)性肺炎或肺水腫。感染后第14天小鼠肺部的病變范圍為50%～70%，炎細(xì)胞浸潤較7 d減少，局部可見肺水腫(圖3)。氣溶膠組小鼠病理結(jié)果顯示：感染后第3天小鼠肺的病變范圍為20%～50%，從主支氣管肺部向末端細(xì)支氣管肺部擴(kuò)散，鏡下可見一定量的炎細(xì)胞浸潤肺泡間隔，炎細(xì)胞數(shù)目較滴鼻組小鼠多；肉眼觀察感染后第7天小鼠肺的病變范圍為70%～90%，鏡下可見大量的炎細(xì)胞的浸潤到肺泡間隔及肺泡內(nèi)，部分區(qū)域形成間質(zhì)性肺炎或肺水腫。肉眼觀察感染后第14天每只小鼠肺的病變范圍為60%～70%，鏡下觀察可炎細(xì)胞浸潤較7 d減少，但局部仍可見肺水腫(圖3)。氣溶膠感染小鼠的病變進(jìn)程與滴鼻感染小鼠相似，除第3天病變較滴鼻感染范圍大、炎細(xì)胞多外，兩種感染方式感染的小鼠都出現(xiàn)了間質(zhì)性肺炎，肺水腫等典型病變。

表1 H1N1 PR8引物序列Table 1 Primer sequences of H1N1 PR8

表2 兩種感染方式小鼠死亡情況(n＝8)Table 2 The death of mice in two modes of infection(n＝8)

圖1 攻毒后小鼠體重變化率及肺指數(shù)Note.Significant difference in lung index of the groups of intranasal and aerosol， ?P＜ 0.05.(The same in the next figure)Figure 1 The body weight change ratio of the mice and lung index of the mice after inoculation

圖2 攻毒后小鼠病毒載量Figure 2 Viral load of the mice after virus inoculation

2.5 感染小鼠肺炎癥細(xì)胞因子的測(cè)定

各組小鼠于感染后第3、7、14天處死，取肺組織勻漿上清進(jìn)行 IL-1α、IL-6、TNF-α 和 IFN-γ 等炎癥細(xì)胞因子的檢測(cè)，結(jié)果顯示氣溶膠組小鼠肺內(nèi)IL-1α、IL-6的表達(dá)量在感染后第3、7天均高于滴鼻組(P＜0.05)，第14天稍高于滴鼻組，但無顯著性差異。氣溶膠組小鼠肺內(nèi)TNF-α的表達(dá)量在感染后第7天高于滴鼻組(P＜0.05)，在感染后第3、14天稍高于滴鼻組，但無顯著性差異。IFN-γ在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)氣溶膠組略高于滴鼻組，但無顯著差異(圖4)。

3 討論

建立流感動(dòng)物模型有很多感染方式。人類流感為呼吸系統(tǒng)疾病，因此建立模型最有效的方式就是呼吸道感染，滴鼻和氣溶膠是目前最常用的兩種呼吸道感染方式[7-8]。病毒氣溶膠是指病毒以單獨(dú)懸浮狀態(tài)、與干燥固體顆粒(塵埃)、液體微粒(液體小滴)相連接在空氣中懸浮，其粒徑約 0.001～100 μm[9]。Tellier[10]證實(shí)在部分人類流感傳染過程中氣溶膠傳染方式起主要作用，因此近年來，很多學(xué)者采用氣溶膠的方式來建立流感動(dòng)物模型。滴鼻方式主要模擬人類飛沫感染方式，是目前被廣泛采用的建立流感動(dòng)物模型的方法[11]，氣溶膠與滴鼻兩種感染方式建立的流感動(dòng)物模型有什么差異?目前未見相關(guān)報(bào)道。因此開展兩種感染方式建立模型的比較研究，對(duì)于合理使用動(dòng)物模型以及深入研究該疾病的發(fā)病機(jī)制都有重要意義。

圖3 攻毒后小鼠肺的病理改變Note.A.Gross pathological changesin unaided viewing.B.Histopathological changes in microscopic.HE staining.Figure 3 Pathological changes in the mice after virus inoculation

圖4 攻毒后小鼠肺內(nèi)細(xì)胞因子含量Figure 4 Level of cytokines in lung of mice after inoculation

本研究采用滴鼻和氣溶膠兩種感染方式構(gòu)建流感模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種方式均可成功建立流感小鼠模型，病程進(jìn)展的總體趨勢(shì)基本一致。但兩組小鼠流感模型的感染特點(diǎn)存在一定差異，在感染的早期，氣溶膠感染組小鼠肺內(nèi)病毒載量和炎癥細(xì)胞因子的浸潤程度明顯高于滴鼻組；提示氣溶膠感染方式更易快速引起肺部的感染并激活人的免疫系統(tǒng)。推測(cè)可能的原因是滴鼻方式感染時(shí)小鼠處于病理的麻醉狀態(tài)，而氣溶膠方式感染時(shí)小鼠處于清醒狀態(tài)，因此病毒更容易進(jìn)入肺內(nèi)復(fù)制并引發(fā)體內(nèi)的應(yīng)答，且氣溶膠方式完全模擬了流感病毒空氣內(nèi)的傳播方式，在流感的預(yù)防感染研究方面具有優(yōu)勢(shì)。因此氣溶膠感染方式建立的小鼠模型是更理想的流感預(yù)防和發(fā)病機(jī)制研究模型。同時(shí)氣溶膠感染方式也存在缺陷，如目前并不是所有流感病毒都能夠通過氣溶膠傳播，或即使能夠在某種動(dòng)物間表現(xiàn)出氣溶膠傳播特性的病毒在其它品種的易感宿主間可能不能傳播[12]。因此對(duì)于一些不能用于氣溶膠傳播的病毒或動(dòng)物感染研究時(shí)，可以選擇滴鼻感染方式進(jìn)行模型構(gòu)建。

人類疾病模型的價(jià)值在于與人臨床癥狀和病變程度的相似程度[13]。本文通過對(duì)氣溶膠和滴鼻兩種感染方式建立的模型進(jìn)行了初步的研究比較，發(fā)現(xiàn)氣溶膠感染方式建立的小鼠模型更適用于預(yù)防和發(fā)病機(jī)制研究，滴鼻方式建立的小鼠模型可用于不通過氣溶膠傳播的流感病毒研究。本文只是對(duì)目前與人類最相似的兩種呼吸道感染方式建立的模型進(jìn)行了初步研究，若想選擇出更理想的小鼠流感模型及了解流感發(fā)病機(jī)制和預(yù)防，還需進(jìn)一步的深入研究。