基于RIP-Seq技術檢測MRTF-A結合RNA在小鼠MCAO/R模型中表達

于志君，袁瓊，金志剛，向梓非，龍萍，朱明，楊越旺，胡霞敏?

(1.武漢科技大學醫(yī)學院，新藥創(chuàng)制研究所，職業(yè)危害識別與控制湖北省重點實驗室，武漢 430065；2.華潤武鋼總醫(yī)院，武漢 430080；3.上海健康醫(yī)學院，上海 200030)

心肌素相關轉錄因子A(myocardin-relate transcription factor-A，MRTF-A)是血清反應因子(serum response factor，SRF)的轉錄共激活因子，廣泛存在于大腦皮層、心臟、血管、胚胎及腫瘤組織中，參與包括阿爾茨海默病[1]、心臟缺血再灌注損傷[2]、動脈粥樣硬化[3]、惡性腫瘤[4]等在內(nèi)的多種病理生理過程。研究發(fā)現(xiàn)，MRTF-A主要定位于胞質，可通過與肌動蛋白結合與解離在細胞質和細胞核之間穿梭。外界刺激(如缺血、缺氧等)可引起胞質內(nèi) G-肌動蛋白與 MRTF-A解離，促進MRTF-A由胞質轉移至胞核，入核的MRTF-A與SRF形成復合物后，結合靶基因啟動子上的CC[A/T]6GG DNA序列，又稱CArG盒，引起靶基因的轉錄激活，參與細胞增殖、分化、凋亡及信號轉導等過程[5]，從而對外界刺激產(chǎn)生快速基因反應。楊輝等[6]研究發(fā)現(xiàn)，在心肌缺血再灌注損傷時，上調心肌中MRTF-A表達，可促進Bcl-2、Mcl-1表達，抑制Bax表達，縮小心肌梗死面積，抑制心肌細胞凋亡，發(fā)揮心肌保護功能。本課題組前期研究也證實，在腦缺血再灌注(ischemic/reperfusion，I/R)誘導的大鼠模型及氧糖剝奪/復氧(oxygen-glucose deprivation/reoxygenation，OGD/R)誘導的細胞模型中，MRTF-A可通過SRF/CArG途徑激活抗凋亡基因Mcl-1、Bcl-2轉錄發(fā)揮重要的神經(jīng)保護作用[7]。

目前，關于MRTF-A機制的研究均基于對轉錄水平的調節(jié)，其可否通過結合RNA發(fā)揮其他生物功能目前尚不清楚。因此，為了深入了解MRTF-A在腦I/R損傷中的分子功能，本研究利用RIP-Seq技術對小鼠MCAO/R模型中MRTF-A結合RNA的表達譜進行深度測序，以挖掘差異基因，繼而通過生物信息方法在分子功能、信號通路等方面進行探討，為下一步實驗研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

18只6～8周齡SPF級健康雄性C57BL/6小鼠，體重20～25 g，購自湖北省實驗動物研究中心【SCXK(鄂)2015-0018】。小鼠飼養(yǎng)于武漢科技大學實驗動物中心【SYXK(鄂)2018-0045】。飼養(yǎng)期間小鼠自由進食、飲水。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度在22～25℃。實驗前將小鼠隨機分為假手術組及I/R組(n＝9)，進行2，3，5-氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色、RNA結合蛋白免疫沉淀-高通量測序(RNA immunoprecipitation，RIP-Seq)及測序結果驗證(n＝3)。所有操作均符合武漢科技大學實驗動物倫理學要求(審批號：201849)。

1.1.2 主要試劑與儀器

線栓購于廣州佳靈生物有限公司；RIP試劑盒、IgG抗體購自Millipore公司；MRTF-A抗體購自CST公司，辣根過氧化物酶標記的羊抗兔/鼠二抗購自Santa Cruz公司；酚∶氯仿∶異戊醇＝125∶24∶1(pH＝4.3)，購自索萊寶科技有限公司。

體式顯微鏡(Motic SMZ-140，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)；熒光定量PCR儀(Bio-Rid CFX96，美國伯樂)；旋轉混勻器(SilentShake，美國CRYSTAL)；恒溫搖床(KYC-100B，上海福瑪實驗設備有限公司)；測序儀器(Hiseq 2500，美國Illumina公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠MCAO模型的建立

參照改良的Longa法[8]制備小鼠右側局灶性MCAO模型。術前小鼠禁食8～10 h，自由飲水。腹腔麻醉，仰臥固定于37℃恒溫手術臺上。消毒頸部皮膚，體式顯微鏡下暴露右側頸部總動脈(common carotid arter，CCA)，頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)。 結扎ECA遠心端后，切開ECA，插入線栓，使線栓經(jīng)由CCA、ICA后入顱，直至大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)，插入深度約 0.8～1 cm。待缺血 1 h后緩慢拔出線栓實現(xiàn)再灌注，24 h后處死小鼠，取樣。假手術組只暴露相關血管而不插入線栓。

1.2.2 神經(jīng)功能學評分

動物麻醉清醒后，采用Longa’s 5分法進行評分。0分：無神經(jīng)損傷癥狀；1分：不能伸展左側前爪；2分：提尾向左側轉；3分：向左側傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識喪失。剔除0分及4分，選取1～3分的小鼠進行RIP-Seq。

1.2.3 TTC染色

在設備生產(chǎn)運行過程中，長期存在著過載工況，原有的系統(tǒng)在此工況下，會長時間出現(xiàn)電機溫升過高，嚴重情況下甚至導致電機被動停機。新系統(tǒng)通過優(yōu)化堵轉保護功能，在檢測到電機最大轉矩工作轉速降至200r/min后，電機主動停機，防止堵轉發(fā)生，重新調整原料多少后，再重新啟動運行，相比原系統(tǒng)的異步機人工拉閘動作，安全系數(shù)更高提高，避免了操作工人的緊張情緒，不再擔心堵轉發(fā)生，快速拉閘動作。

再灌注24 h后，每組隨機選取3只小鼠，斷頭取腦進行梗死體積檢測。新鮮腦組織-80℃速凍3 min后取出，以2 mm厚度做冠狀切片，隨后浸泡于1%TTC磷酸鹽緩沖液中，37℃避光孵育15 min，期間將腦片上下翻轉至少1次，使之染色均勻。TTC染劑可將正常腦組織染為深紅色，梗死區(qū)腦組織染為白色。最后將腦片浸泡于4%多聚甲醛中，4℃固定過夜，拍片，計算腦梗死體積百分比。腦梗死體積百分比利用Image J圖像分析軟件對梗死體積進行量化，首先計算每片腦組織的梗死體積，每片腦片梗死體積＝梗死面積 ×切片厚度，再求和算出總梗死體積，腦梗死體積百分比＝總梗死體積/全腦體積 ×100%。

1.2.4 RIP實驗

RIP實驗所有試劑均需無酶處理。再灌注24 h后取患側大腦半球組織(梗死區(qū)及非梗死區(qū))，用預冷的 PBS沖洗勻漿，制成單細胞懸液。4℃，1500 rpm離心5 min，棄上清，加入等體積裂解液冰上裂解5 min，-80℃保存?zhèn)溆?。RIP實驗具體操作按照Millipore公司RIP試劑盒操作說明進行。即每組50 μL 磁珠中，加入 MRTF-A/IgG 抗體5 μg，室溫孵育1 h，獲得磁珠抗體復合物。洗滌磁珠，900 μL RIP免疫共沉淀緩沖液中加入100 μL腦組織裂解液，4℃孵育過夜，蛋白酶K消化后酚∶氯仿∶異戊醇＝125∶24∶1(pH＝4.3)提取 RNA，待質檢合格后進行高通量測序，驗證樣本則用于差異RNA表達qRT-PCR檢測。

1.2.5 RNA高通量測序

樣本(Sham MRTF-A-RIP組及I/R MRTF-ARIP組)委托廣州市銳博生物科技有限公司，采用Illumina HiSeq TM2500測序方式進行。

1.2.6 測序數(shù)據(jù)分析

Illumina HiSeq TM2500測序所得50 nt序列(reads)，通過初步過濾，得到干凈序列。利用Tophat(v2.0.13)軟件將其與參考基因組比對，挑選出比對reads進行全基因組分布、結合峰(Peak)檢測、注釋及相關統(tǒng)計分析，最后獲得差異Peaks，并對差異基因進行GO和KEGG分析?；虮磉_采用RPKM法估算，用Zscore值表示某Peak在成對樣本中的差異程度，以｜Zscore｜＞2作為RNA差異性表達的篩選條件。

1.2.7 qRT-PCR驗證基因表達

使用Thermo Scientific逆轉錄試劑對RIP純化后的RNA樣品進行逆轉錄，逆轉錄條件為：42℃60 min，70℃ 10 min，4℃，終止反應。 qRT-PCR 按照Yeasen試劑盒說明書進行擴增，反應條件為：95℃，2 min；95℃ 10 s，60℃ 20 s，72℃ 20 s，共40 個循環(huán)，反應結束后對所得數(shù)據(jù)進行處理，按2-ΔΔCt法計算基因的相對表達量。引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 qRT-PCR primer sequence

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 成功構建小鼠腦I/R模型

小鼠MCAO模型成功構建是本實驗的關鍵，因此我們采用神經(jīng)功能缺陷評分和TTC染色對腦損傷程度進行評估，以確保測序樣本符合腦I/R損傷。結果顯示，I/R組均出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)損傷癥狀，評分為2.5±1.0，而假手術組無神經(jīng)損傷癥狀(圖1A)。每組隨機選取3只小鼠行TTC染色，結果如圖1B所示，假手術組腦組織染色正常，而I/R組呈現(xiàn)不同程度的梗死灶，梗死體積百分比為(28.42±7.73)%(圖1C)，以上結果提示，小鼠腦I/R模型構建成功。

2.2 MRTF-A結合RNA差異表達

本研究以｜Zscore｜＞2作為篩選條件，共獲得429個RNA差異結合峰，其中上調203個，下調226個；通過對 RNA類型分析發(fā)現(xiàn) mRNA 384個，ncRNA 45個，其中長鏈非編碼 RNA(lncRNA)24個。表2顯示變化最顯著的10個結合峰，具體為Gm33780、 LOC105245688、 Gm3871、 Rpph1、 Hic2、Olfr856-ps1、Gm32291、Jarid2、Gm10845、Malat1，其中l(wèi)ncRNA有7個，可見lncRNA在MRTF-A參與的腦I/R損傷中可能發(fā)揮重要作用。

圖1 成功構建小鼠腦I/R模型Note.A.Neurological score.B.TTC staining.C.Percentage of cerebral infarction volume.Compared with sham group， ??P ＜ 0.01.Figure 1 Successful construction of mice cerebral I/R injury model

表2 10個最顯著RNA差異結合峰Table 2 Ten most significant RNAs differential binding peaks

2.3 RNA差異結合峰在功能元件及染色體來源上的分布分析

通過分析RNA差異性結合峰在不同基因組功能元件上的分布，發(fā)現(xiàn)差異性結合峰主要分布于外顯子(exon)、內(nèi)含子(intron)及3’UTR區(qū)，分別為63.40%、14.69%及13.05%，其他8.86%分布于基因間區(qū)(Intergenic)、5’UTR區(qū)和宿主基因上游(upstream)序列，分別為 4.20%、4.20%和 0.47%(圖2A)。染色體來源分析發(fā)現(xiàn)，大量差異性結合峰來源于4號及7號染色體(圖2B)。其中4號染色體178個，約占總差異性結合峰的41.49%；7號染色體100個，占總差異性結合峰的23.31%，而6、11、17、X染色體未發(fā)現(xiàn)peak富集。以上結果提示，腦I/R后MRTF-A相關的RNA不僅在功能元件上分布不同，且與染色體來源關系密切。

2.4 RNA差異表達基因GO分析

對MRTF-A結合RNA差異性表達基因進行GO分析發(fā)現(xiàn)，差異基因在生物進程中主要富集RNA、mRNA的加工、拼接、代謝過程，細胞及骨架組成、微管解聚以及蛋白質復性等。在細胞組成方面，富集包括軸突、突觸、神經(jīng)元、神經(jīng)元突觸后密度、投射神經(jīng)元等。在分子功能注釋中主要富集與多種物質的結合功能，如與MHC的結合、鈣結合素結合、脂蛋白受體結合等，其中富集最多的注釋為RNA結合，共富集31個基因，而富集最為顯著是Poly(A)RNA結合(表3，P＜1.09×10-5)。結果提示，腦I/R損傷時MRTF-A可以通過募集特異性RNA，在RNA結合、Poly A RNA結合等方面發(fā)揮重要的生物功能。

圖2 MRTF-A結合RNA差異結合峰分析Note.A.Distribution of RNAs differential binding peaks on functional elements.B.Chromosome source of RNAs differential binding peak.Figure 2 MRTF-A binding RNAs differential binding peak analysis

2.5 RNA差異表達基因KEGG通路分析

通過對MRTF-A結合RNA差異性表達基因進行KEGG信號通路分析顯示，差異表達基因主要富集10條信號通路，分別是甲狀腺激素合成、胃酸分泌、唾液分泌、雌激素信號通路、多巴胺能突觸、谷氨酸突觸、胰島素分泌、安非他明成癮、內(nèi)質網(wǎng)蛋白加工及RNA轉運。在10條顯著富集的信號通路中，雌激素信號通路是富集最顯著的信號通路(表4，P＜6.09×10-4)，共富集 6個基因，分別為Hsp90b1、Hspa8、Gabbr2、Hsp90aa1、Calm1、Atf2。 提示，在腦I/R損傷后，MRTF-A主要通過雌激素信號通路發(fā)揮神經(jīng)保護功能。

2.6 qRT-PCR驗證篩選基因的表達

為了驗證測序結果及生物信息預測結果的可信度，本實驗在差異表達前10的RNA中隨機選取4 個基因(Gm33780、Gm3871、Hic2、Malat1)進行測序結果的驗證；同時在KEGG預測富集最顯著的雌激素信號通路中選取3個基因(Hsp90b1、Hspa8、Calm1)進行生物信息預測結果驗證，結果發(fā)現(xiàn)MRTF-A抗體無論在假手術組還是I/R組均能富集到相應RNA表達(圖3)，且均發(fā)生差異性改變，其變化趨勢與測序結果一致。

圖3 差異RNA的qRT-PCR驗證Note.Compared with sham group，?P ＜ 0.05，??P ＜ 0.01Figure 3 qRT-PCR verification of differential RNAs

3 討論

MRTF-A是SRF轉錄共激活劑，主要通過核轉位與SRF結合，促進SRF結合靶基因啟動子上的CArG盒，激活靶基因轉錄，從而在轉錄水平發(fā)揮調節(jié)功能[5]。然而MRTF-A是否存在其他作用方式，目前尚未闡明。隨著各種測序技術及生物信息學技術的發(fā)展，為探尋分子在不同水平的作用機制提供了技術支持。RNA結合蛋白免疫共沉淀-高通量測序技術(RIP-Seq)是研究細胞內(nèi)RNA與蛋白結合及轉錄后調控網(wǎng)絡動態(tài)過程的工具，能幫助發(fā)現(xiàn)蛋白-RNA復合體的相互作用。因此，為了深入了解MRTF-A在腦 I/R損傷中的作用方式，探尋與MRTF-A相關的潛在靶基因，我們采用RIP-Seq技術對比正常小鼠與腦I/R損傷小鼠腦組織中MRTF-A抗體結合RNA表達，以獲得差異表達譜。

表3 GO分析中的分子功能注釋Table 3 Annotation of molecular functions in GO analysis

表4 KEGG通路分析Table 4 KEGG signal pathway analysis

本研究結果顯示，在腦 I/R損傷時，429個MRTF-A結合RNA呈現(xiàn)顯著改變，其分類主要為mRNA，少量為ncRNA。在變化最顯著的10個差異RNA中 lncRNA占 7/10，可見 lncRNA可能在MRTF-A參與的腦I/R損傷中發(fā)揮著不可忽視的調控作用。LncRNA是一類長度大于 200 nt的ncRNA，能夠與DNA、RNA及蛋白質作用參與機體的各種生理病理過程[9]。研究發(fā)現(xiàn)，腦I/R損傷時存在大量lncRNA異常表達[10]，它們通過影響細胞凋亡、炎癥、自噬、血管生成等在疾病的進展及轉歸中發(fā)揮作用[11]。本研究獲得多條已證實在腦卒中中發(fā)揮重要作用 lncRNA，如 Malat1、Meg3及Kcnq1ot1等[12-13]，除此還篩選出多個尚未報道功能的 lncRNA，如 Gm33780、Gm32291、LOC105245688等。為了驗證測序結果的可靠性，我們在差異表達最顯著的10個RNA中選取4個進行qRT-PCR驗證，其中包括lncRNA 3個。結果顯示MRTF-A抗體可以富集這些RNA，同時在缺血性腦卒中后發(fā)生差異性改變，其變化趨勢與測序結果一致，可見本次測序結果可靠，而這些RNA，尤其是lncRNA如何通過與MRTF-A結合發(fā)揮生物功能有待進一步研究。

為了深入了解MRTF-A在腦I/R損傷中的作用機制，我們采用生物信息學方法對差異表達基因進行了GO及KEGG分析。GO分析發(fā)現(xiàn)MRTF-A主要通過RNA結合、Poly(A)RNA結合發(fā)揮生物功能，于是推測 MRFT-A可能作為 RNA結合蛋白(RNA binding protein，RBP)及 Poly(A)結合蛋白(Poly(A)binding protein，PABP)參與腦I/R損傷病理進程。RBP是一類可與雙鏈或單鏈RNA結合，在轉錄后水平發(fā)揮重要調節(jié)作用。人抗原R(HuR)是一種RBP，研究發(fā)現(xiàn)，缺血性腦中風時，HuR可正性調節(jié)炎癥相關基因 TNF-α，IL-6，IL-1β的mRNA穩(wěn)定和翻譯效率，參與腦損傷過程[14]。同樣，存在于胞漿中PABP，可通過RNA識別基序與真核mRNA的3’Poly(A)尾結合，發(fā)揮 mRNA成熟、輸出及穩(wěn)定功能[15]。本實驗中檢測出多個與mRNA成熟、穩(wěn)定密切相關的差異基因，如Eef1a1、Eif5b等。內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是心血管系統(tǒng)的重要保護因子，可調節(jié)一氧化氮的產(chǎn)生，與缺血性腦卒中發(fā)生密切相關[16]，研究發(fā)現(xiàn)Eef1a1可通過維持eNOS mRNA穩(wěn)定，上調其表達，保護腦血管內(nèi)皮免受腦缺血損傷[17]。而Eif5b在腦I/R損傷中目前尚無報道，但研究指出，正常非必需的Eif5b在缺氧條件下是缺氧誘導因子(hypoxia-inducible factor，HIF)1α和2α合成機制的重要組成部分，它們的轉錄和翻譯表現(xiàn)出顯著的 Eif5b依賴性[18]。因此，推斷MRTF-A可通過與這些基因結合發(fā)揮生物學功能。KEGG信號通路分析發(fā)現(xiàn)，雌激素信號通路是富集最為顯著通路。研究證實雌激素通路在腦I/R損傷中發(fā)揮重要作用，雌性動物腦缺血后神經(jīng)元損傷弱于雄性動物，且隨著生殖衰老或內(nèi)源性雌激素釋放停止而消失[19]，雌激素缺乏小鼠在腦I/R后長期給予雌激素受體激動劑可通過抑制炎癥減輕腦損傷[20]。為了進一步證實生物信息學預測結果，本實驗在雌激素信號通路預測富集的6個差異表達基因中隨機選取3個進行驗證，結果發(fā)現(xiàn)，MRTF-A可以富集這些mRNA，并且在缺血性腦卒中后發(fā)生差異性改變，其改變趨勢與測序趨勢一致。因此，我們推測在腦I/R損傷時MRTF-A可結合差異表達RNA通過雌激素信號通路發(fā)揮作用。研究報道lncRNA可通過雌激素通路在腫瘤增殖、轉移等過程中發(fā)揮重要作用[21]，lncRNA Malat1在乳腺癌腫瘤中的表達改變與雌激素通路及其靶基因差異表達密切相關，且與不良預后相關[22]。然而在缺血性腦卒中研究中，尚未發(fā)現(xiàn)lncRNA通過雌激素通路發(fā)揮相關功能。因此，lncRNA通過雌激素信號通路在腦缺血神經(jīng)損傷中發(fā)揮作用，還需要進一步深入研究。

綜上，本研究通過 RIP-Seq技術獲得小鼠MCAO/R模型中與MRTF-A相關的潛在靶基因，通過生物信息學分析推斷MRTF-A可能作為RBP或PABP通過雌激素信號通路等發(fā)揮生物學功能，從而為深入了解MRTF-A作用機制提供了理論基礎，為探討其在腦I/R損傷中的新機制提供研究方向，課題組將在下步實驗中進行深入研究。