辛伐他汀聯(lián)合利塞膦酸鈉對地塞米松誘導(dǎo)大鼠骨丟失的作用

郭志斌，吳春芳，張國彬，遲博婧，王玉丹，劉子洪，王寶，馬超，田發(fā)明?

(1.開灤總醫(yī)院林西醫(yī)院骨外科，河北唐山 063000；2.華北理工大學(xué)，醫(yī)學(xué)實驗研究中心，河北唐山 063000；3.開灤總醫(yī)院骨外科，河北唐山 063000)

骨質(zhì)疏松癥的病理特點是骨丟失和微觀結(jié)構(gòu)劣變，并由此導(dǎo)致發(fā)生骨折的風險增加[1-2]。骨質(zhì)疏松癥病因復(fù)雜，荷爾蒙失調(diào)、久坐不動的生活方式、營養(yǎng)攝入不足、代謝和慢性炎癥疾病，都可以加速骨質(zhì)疏松癥的發(fā)展[3]。糖皮質(zhì)激素主要用于抗炎和治療自身免疫性疾病，但是長期應(yīng)用的副作用之一是可能導(dǎo)致骨質(zhì)減少，骨質(zhì)疏松癥和骨折風險增加[4]。

雙膦酸鹽類藥物，如利塞膦酸鹽、阿侖膦酸鹽等可通過抑制破骨細胞介導(dǎo)的骨吸收而阻止骨丟失。辛伐他汀是一種3-羥基-3-甲基戊二酰基輔酶A還原酶抑制劑，臨床上主要作為降脂類藥物。目前國內(nèi)外研究表明，辛伐他汀具有促進成骨細胞分化并抑制破骨細胞的形成，表現(xiàn)出一定的抗骨質(zhì)疏松潛能[5]。然而上述兩種藥物聯(lián)合應(yīng)用對地塞米松誘導(dǎo)的骨丟失的干預(yù)效果尚不明確。本研究擬通過地塞米松皮下注射誘導(dǎo)建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，并給予辛伐他汀和或利塞膦酸鈉干預(yù)，觀察兩者單獨或聯(lián)合應(yīng)用對該模型骨丟失的作用及機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

40只SPF級3月齡雄性SD大鼠，購自北京維通利華實驗動物中心【SCXK(京)2017-0001】，體重(246±18)g。所有動物在華北理工大學(xué)動物中心屏障環(huán)境中飼養(yǎng)【SYXK(冀)2015-0038】。飼養(yǎng)期間大鼠自由進食水，飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22～25℃。本研究中涉及實驗動物的處理和干預(yù)，均符合華北理工大學(xué)實驗動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定，動物實驗倫理審查證明(LX2018136)，并遵照實驗動物使用的3R(減少、替代、優(yōu)化)原則。

1.1.2 主要試劑與儀器

地塞米松(辰欣藥業(yè)股份有限公司)，辛伐他汀(浙江瑞邦藥業(yè)有限公司生產(chǎn))，利塞膦酸鈉(北京雙鷺藥業(yè)股份有限公司)，骨保護素(Osteoprotegerin，OPG)、RANKL(receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand)一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司。

微計算機斷層掃描(micro-CT，Skyscan，比利時)，AG-IS型萬能試驗機統(tǒng)(日本島津公司)，PCR儀(Applied biosystems，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及實驗干預(yù)

分為五組，每組8只，A組對照組，B組為模型組，皮下注射地塞米松(2.5 mg，每周 2 次)，C、D、E組在給予地塞米松皮下注射的基礎(chǔ)上，每天分別給予辛伐他汀(5 mg/kg)灌胃[6](C組)、利塞膦酸鈉(0.1 mg/kg)灌胃[7-8](D組)和聯(lián)合干預(yù)(E組)，8周后處死所有大鼠取材。

1.2.2 股骨骨密度檢測

取所有大鼠左側(cè)股骨，采用用Norland-XR 36雙能X線骨密度測量儀(DEXA，美國)進行骨密度分析。

1.2.3 Micro-CT分析脛骨近段松質(zhì)骨微觀結(jié)構(gòu)

用Sky Scan 1176Micro-CT系統(tǒng)(電壓50 KeV、電流270 μA)對大鼠左側(cè)脛骨進行掃描檢測，感興趣區(qū)脛骨近端松質(zhì)骨生長板下0.5～2 mm。對所有圖像分別使用CT Analyzer與 CT vox軟件分析和處理。并分析以下參數(shù)：骨體積分數(shù)(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁數(shù)(trabecular number，Tb.N)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、 骨 小 梁 間 距 (trabecular separation，Tb.Sp)。

1.2.4 生物力學(xué)檢測股骨最大載荷

所有大鼠左側(cè)股骨完成骨密度檢測后，進行三點彎曲試驗，跨距20 mm，中央垂直施加載荷，速率10 mm/min，在軟件里直接得到最大載荷。

1.2.5 免疫組化檢測OPG和RANKL蛋白水平的表達

取所有大鼠右側(cè)股骨，常規(guī)固定、脫鈣后，脫水并用石蠟包埋，制備6 μm的石蠟切片，經(jīng)烤片、二甲苯透明脫脂、梯度乙醇至純水水化后，抗原修復(fù)，過氧化氫處理后，滴加 OPG、RANK 一抗45 μL，孵育過夜。次日按照PV6000試劑盒滴加二抗并進行后續(xù)操作，最終由DAB顯色，蘇木素復(fù)染、鹽酸酒精分化及自來水返藍，中性樹膠封片。光學(xué)顯微鏡采圖，Image-Pro Plus軟件進行積分光密度值分析(integratal optical density，IOD)。

1.2.6 Real time PCR檢測OPG和RANKL mRNA水平的表達

取右側(cè)脛骨制備組織勻漿，采用TRIzol法提取RNA，并經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA后，測定質(zhì)量和濃度。采用Real time PCR體系擴增目的基因與內(nèi)參基因(GAPDH)，計算兩者相對表達量的比值。PCR反應(yīng)體系：總體積 50 μL，包括：Real time PCR MasterMix 25 μL，cDNA 模板 5 μL，引物(10 μmol/L)各2 μL。PCR反應(yīng)條件：OPG和RANKL為同一條件：95℃，5 min；95℃，10 s；69℃，30 s；45 個循環(huán)；72℃，5 min。引物序列：GAPDH(擴增產(chǎn)物為bp)的上游引物：5′-TGCTGAGTATGTCGTGGAG-3′，下游引物：5′-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3′；OPG 上游引物：5′-GTCCCTTGCCCTGACTACTCT-3′，下游引物：5′-GACATCTTTTGCAAACCGTGT-3′；RANKL 上游引物： 5′-CCCATCGGGTTCCCATAAAGTC-3′， 下 游 引物：5′-GCCTGAAGCAAATGTTGGCGTA-3′。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)錄入Excel表格，采用SPSS 21.0進行統(tǒng)計學(xué)分析，采用單因素方差初步分析是否存在組間差異，后續(xù)兩兩比較采用LSD-t檢驗，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差()表示，P＜0.05表示差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 骨密度

骨密度檢測結(jié)果：雙能X線骨密度分析結(jié)果如圖1所示，A組骨密度最高，顯著高于其余四組(P＜0.05)，利塞膦酸鈉組顯著高于模型組(P＜0.05)，聯(lián)合治療組顯著高于模型組和單獨用藥組(P＜0.05)。

2.2 生物力學(xué)檢測

各組大鼠股骨最大載荷：模型組(90.2±7.1)N顯著低于對照組(104.6±10.62)N(P＜0.05)和聯(lián)合治療組(101.4±7.7)N。辛伐他汀組(94.7±9.6)N、利塞膦酸鈉組(98.5±10.9)N與其他各組比較均無顯著性差異(圖2)。

2.3 Micro-CT分析

Micro-CT檢測脛骨近端松質(zhì)骨結(jié)果如表1所示：骨小梁體積分數(shù)：模型組和各治療組均顯著低于對照組(P＜0.05)，聯(lián)合治療組顯著高于模型組和單獨用藥組，但仍低于對照組(P＜0.05)。骨小梁數(shù)量：模型組和各給藥組均顯著低于對照組，聯(lián)合用藥組顯著高于對照組(P＜0.05)。骨小梁厚度：模型組顯著低于對照組，聯(lián)合用藥組顯著高于模型組(P＜0.05)，其余各組間比較無顯著差異。骨小梁分離度：模型組和各治療組均顯著高于對照組(P＜0.05)，聯(lián)合治療組顯著低于模型組和單獨用藥組，但仍高于對照組(P＜0.05)。

2.4 免疫組化檢測結(jié)果

免疫組化檢測OPG在各組右側(cè)股骨松質(zhì)骨表達的結(jié)果：模型組、利塞膦酸鈉組、聯(lián)合用藥組均顯著低于對照組(P＜0.05)，辛伐他汀組和聯(lián)合用藥組顯著高于模型組(P＜0.05)(圖3)。

免疫組化檢測RANKL在各組右側(cè)股骨松質(zhì)骨表達的結(jié)果：模型組及各用藥組RANKL的表達均顯著高于對照組(P＜0.05)，聯(lián)合用藥組顯著低于模型組(P＜0.05)(圖4)。

2.5 Real time PCR檢測結(jié)果

Real time PCR定量分析OPG mRNA在各組表達結(jié)果：B組顯著低于 A組、C組顯著高于 B組(P＜0.05)，其他組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)；B組RNAKL mRNA的表達顯著高于其他4組(P＜0.05)，C組RNAKL mRNA的表達顯著高于A組，其他兩兩組間比較未見顯著差別(P＞0.05)。

圖1 骨密度檢測結(jié)果(xˉ±s，n＝8)Note.Compared with group A，aP＜ 0.05.Compared with group B，bP＜ 0.05.Compared with group C，cP＜ 0.05.Compared with group D，dP＜ 0.05.(The same in the following figures and tables)Figure 1 Results of BMD test(xˉ±s，n＝8)

圖2 骨密度檢測結(jié)果(，n＝8)Figure 2 Results of BMD test(，n＝8)

表1 Micro-CT分析結(jié)果(，n＝8)Table 1 Results of Micro-CT test(，n＝8)

表1 Micro-CT分析結(jié)果(，n＝8)Table 1 Results of Micro-CT test(，n＝8)

組別Groups骨體積比Bone volume/total volume骨小梁數(shù)量Trabecular number骨小梁厚度Trabecular thickness骨小梁分離度Trabecular separation A組Group A 29.5±2.7 2.9±0.3 101.6±4.9 231.4±63.8 B組Group B 20.1±2.1a 2.3±0.2a 93.3±4.6a 394.1±41.3a C組Group C 21.6±2.8a 2.4±0.1a 98.8±8.0 356.1±36.4a D組Group D 21.9±2.6a 2.5±0.1a 98.9±7.5 354.9±33.7a E組Group E 25.3±2.9abcd 2.6±0.2ab 103.7±6.4b 294.9±49.6abcd

圖3 免疫組化檢測各組OPG的表達(，n＝8)Figure 3 Immunohistochemistry staining and IOD analysis of OPG(，n＝8)

圖4 免疫組化檢測各組RANKL的表達(，n＝8)Figure 4 Immunohistochemistry staining and IOD analysis of RANKL(，n＝8)

圖5 PCR檢測結(jié)果(，n＝8)Figure 5 Results of PCR analysis(，n＝8)

3 討論

3.1 地塞米松誘發(fā)大鼠骨質(zhì)疏松模型

本研究證實，在大鼠皮下注射地塞米松8周后，誘發(fā)大量骨丟失、微結(jié)構(gòu)退化、生物力學(xué)性能下降，這也與先前的研究結(jié)果一致。研究表明，地塞米松通過抑制成骨細胞細胞增殖及細胞外基質(zhì)合成降低成骨能力[9]。此外，地塞米松促進破骨細胞的增殖[10]。長期接受地塞米松治療的患者在誘發(fā)骨丟失的同時，還存在易于發(fā)生骨折的風險[11-12]。我們通過對骨保護素和破骨細胞分化因子的蛋白和mRNA水平的比較分析發(fā)現(xiàn)，地塞米松可以抑制骨保護素的表達，且同時刺激破骨細胞分化因子的表達，這些結(jié)果提示地塞米松誘發(fā)大鼠骨丟失的作用機制與抑制成骨細胞功能同時促進破骨細胞活性有關(guān)。

3.2 辛伐他汀聯(lián)合利塞膦酸鈉抗骨質(zhì)疏松效果優(yōu)于單獨用藥

辛伐他汀作為同類藥物中應(yīng)用較多的一種，除了降脂作用，其對骨代謝的影響也日益受到關(guān)注，且部分前期實驗已經(jīng)證實其促進骨形成或抑制骨吸收的潛能[6，13-14]，如辛伐他汀可以激活 TGF-β/smad3信號通路拮抗地塞米松誘導(dǎo)的破骨細胞凋亡[15]，其抗破骨作用還與誘導(dǎo)OPG的表達并抑制RANKL的表達有關(guān)[16]。然而，在本研究中，辛伐他汀對于糖皮質(zhì)激素誘發(fā)的大鼠骨丟失的干預(yù)效果并不顯著，未能達到預(yù)期，雖然通過對OPG、RANKL免疫組化和PCR的檢測提示辛伐他汀具有刺激OPG并抑制RANKL表達的作用，但在組織學(xué)和生物力學(xué)水平的分析結(jié)果提示其作用不能阻止該模型的骨丟失。與之相對應(yīng)的，利塞膦酸鈉對該模型骨丟失的作用則較為顯著，表現(xiàn)出比辛伐他汀更強的抑制骨丟失的作用，具體表現(xiàn)為，辛伐他汀單獨用藥骨密度雖然具有高于模型組大鼠的趨勢，但差異并不顯著；而利塞膦酸鈉組大鼠的骨密度則顯著高于模型組大鼠。通過進一步分析聯(lián)合用藥的效果，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組大鼠骨密度不僅高于模型組大鼠，也顯著高于兩組單獨用藥的大鼠，提示聯(lián)合用藥較之單獨用藥抗骨質(zhì)疏松的作用更強。然而，通過與正常對照組大鼠比較，我們發(fā)現(xiàn)，無論單獨用藥還是聯(lián)合用藥骨密度都未能恢復(fù)到正常值。此外，本研究的辛伐他汀和利塞膦酸鈉藥物劑量參考以往類似研究[6-8]，藥物劑量在安全范圍，但并未觀察聯(lián)合用藥是否增加毒副作用，在今后的研究中應(yīng)予以重視。

除骨密度外，我們進一步分析了各組大鼠股骨的最大載荷，也進一步證實了單獨用藥效果不及聯(lián)合用藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有聯(lián)合用藥組大鼠股骨的最大載荷顯著高于模型組，而單獨用藥組與模型組比較，雖有升高趨勢，但差別并不顯著。相比較而言，利塞膦酸鈉組較辛伐他汀最大載荷數(shù)值表現(xiàn)出更高的趨勢。我們通過micro-CT分析對松質(zhì)骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)的比較發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合用藥組較單獨用藥組表現(xiàn)出更高的骨量、骨小梁數(shù)量，更低的骨小梁分離度，提示聯(lián)合用藥較單獨用藥對于保持骨量和微觀結(jié)構(gòu)具有更顯著的作用。

3.3 不足與展望

此外，與辛伐他汀和利塞膦酸鈉單獨干預(yù)相比，聯(lián)合用藥組在組織學(xué)和分子水平的作用都更強。利塞膦酸鈉作為第三代雙膦酸鹽類藥物，目前仍是治療骨質(zhì)疏松的首選藥物之一[17-19]。因為其作用機制主要是抑制破骨細胞的功能活性，對骨形成的影響甚微，因此為提高其應(yīng)用效果和擴大適用范圍，目前多項研究探討了其與其它性質(zhì)藥物的聯(lián)合應(yīng)用對骨代謝的影響，包括分別與甲狀旁腺激素1-34[20]和維生素K[21]的聯(lián)合應(yīng)用，其中與甲狀旁腺激素1-34聯(lián)合或序貫應(yīng)用效果較單獨應(yīng)用更佳，但對后者而言，與維生素K的聯(lián)合應(yīng)用并未表現(xiàn)出優(yōu)于利塞膦酸鈉單獨用藥。因此，本研究雖然初步證實辛伐他汀與利塞膦酸鈉聯(lián)合應(yīng)用能更好的治療激素誘發(fā)的大鼠骨丟失，但并未能完全抑制其進程，是否能通過調(diào)整劑量和作用周期，或者改變干預(yù)方案如序貫治療等進一步增強聯(lián)合使用的療效，這些都有待進一步研究證實。