復方七芍降壓片對TNF-α誘導的與平滑肌細胞共培養(yǎng)的血管內皮細胞中炎癥因子與AP-1、MCP-1蛋白表達的影響

龔姍，李弘，劉葉倩，陳春茗，馬丹鳳，劉林，任衛(wèi)瓊?

(1.湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，長沙 410007；2.湖南省兒童醫(yī)院，長沙 410006)

高血壓是心血管疾病的獨立危險因素之一，每年全球因高血壓死亡人數(shù)約有900多萬[1]，嚴重危害人類身體健康。血管重塑是許多血管疾病共同的關鍵病理環(huán)節(jié)[2]，也是高血壓靶器官損害的病理基礎和導致其他心血管疾病發(fā)生引起死亡的重要原因[3]。

高血壓是一種慢性炎癥性疾病，隨著病程的發(fā)展，血管的切應力增加，更多的炎癥因子會損傷內皮細胞，導致血管舒張功能降低，進一步促進血管內皮細胞的炎性損傷，引起平滑肌細胞的增殖、遷移，導致組織纖維化而出現(xiàn)血管結構的改變[4-5]。激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)是細胞內一類轉錄激活因子，能夠誘導調控多種炎癥因子的釋放，加速內皮損傷，促進平滑肌細胞增殖和分泌，參與血管重塑[6-7]。單核細胞趨化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是炎性反應重要的趨化因子，機體發(fā)生炎癥時，導致血管內皮細胞受損，MCP-1大量分泌，促進血管內皮修復及血管新生[8]。因此，以內皮細胞炎癥反應為切入點研究高血壓病血管重塑的發(fā)生機制具有重要意義。針對高血壓“虛、瘀、風”的病機，我們采用養(yǎng)陰柔肝、化瘀息風立法的復方七芍降壓片治療“肝腎陰虛、陰虛陽亢”型高血壓。前期研究發(fā)現(xiàn)復方七芍降壓片能降低患者血壓[9]，有效降低原發(fā)性高血壓大鼠(spontaneous hypertension rat，SHR)腸系膜動脈上血管重塑標志物活性和炎癥因子表達，改善血管重塑[10-11]，但是否與調控內皮細胞AP-1、MCP-1蛋白表達，影響內皮細胞炎癥反應，調節(jié)平滑肌細胞增殖有關，尚不清楚。因此，本實驗利用炎癥因子腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)誘導內皮細胞與平滑肌細胞共培養(yǎng)體系模擬高血壓炎癥環(huán)境，觀察復方七芍降壓片對內皮細胞炎癥因子和AP-1、MCP-1的影響及其與血管平滑肌細胞損傷相關性，并在此基礎上探討復方七芍降壓片的干預機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

15只3～4月齡的SPF級雄性SD大鼠，體重230～250 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司【SCXK(湘)2016-0002】，室溫22℃、濕度50%，12 h光照/黑暗循環(huán)。實驗動物倫理審批號(ZYFY2018112503)，由湖南省科技廳實驗動物管理辦公室審批實驗動物環(huán)境設施合格證號【SYXK(湘)2015-0003】。

1.1.2 細胞

原代大鼠血管平滑肌細胞株和內皮細胞株均購于Procell公司。

1.2.3 主要試劑與儀器

復方七芍降壓片(批號：20181026，規(guī)格：每片0.46 g)，人臨床日用量為12片，相當于生藥量97 g，購自湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院制劑室。厄貝沙坦片(批號：17122111，規(guī)格：每片 75 mg)，人臨床日用量為300 mg，購自揚子江藥業(yè)集團北京海燕藥業(yè)有限公司。

TNF-α 購 自 美 國 eprotech公 司， 批 號：101373A2918，P2Y6受體阻斷劑MRS2578購自美國selleck公司，批號：S285501，IL-8 ELISA檢測試劑盒購自上海晶天生物科技有限公司，批號：20190305，AP-1一抗、MCP-1一抗、β-actin內參抗體均購自北京博奧森生物技術有限公司，批號分別為：AI03113818、AB05105689、AH11286487。

MK3型酶標儀(雷勃，芬蘭)，電泳儀(BIORAD，mini protean 3 cell，美國)，離心機(Eppendorf，Centrifuge 5424 R 型，德國)，冰箱 (Haier，BCD-196TMZL型，中國)，全自動化學發(fā)光分析(上海天能科技有限公司，Tanon-5200型)，實驗室超純水(MilliPORE，ULUPURE 型，法國)。

1.2 方法

1.2.1 含藥血清及對照血清的制備

SPF級雄性SD大鼠15只，根據(jù)體重隨機分為3組，即空白對照組(5只)、厄貝沙坦片組(5只)、復方七芍降壓片組(5只)。分別按臨床等效劑量臨床成人常用劑量3倍給予等體積蒸餾水、厄貝沙坦片(0.081 g/kg)和復方七芍降壓片(1.50 g/kg)，灌胃。每天2次，連續(xù)給藥7次。末次給藥后2 h，腹主動脈取血于血清管中，離心10 min(4500 r/min)，取上清液，水浴滅活(56℃，30 min)，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 細胞培養(yǎng)

將原代內皮細胞和平滑肌細胞分別于專用培養(yǎng)液(條件：5%CO2，37℃)中傳代培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 共培養(yǎng)體系的建立

按細胞常規(guī)方法培養(yǎng)，將內皮細胞消化后接種至康寧24孔細胞培養(yǎng)板中，處于對數(shù)生長期的平滑肌細胞消化后接種至康寧Transwell小室內側，置于細胞培養(yǎng)箱內(條件：5%CO2，37℃)，培養(yǎng)1～2 d后，即可成功構建內皮細胞和平滑肌細胞共培養(yǎng)體系[12]。

1.2.4 分組及給藥

將共培養(yǎng)好的細胞隨機分為7組，即正常對照組(A)：內皮細胞 +平滑肌細胞；模型組(B)：炎癥因子+內皮細胞 +平滑肌細胞；空白血清對照組(C)：炎癥因子+內皮細胞+平滑肌細胞+空白血清；MRS2578組(D)：炎癥因子 +沉默內皮細胞 +平滑肌細胞；厄貝沙坦片含藥血清組(E)：炎癥因子+內皮細胞+平滑肌細胞 +厄貝沙坦片血清；復方七芍降壓片含藥血清組(F)：炎癥因子 +內皮細胞+平滑肌細胞 +復方七芍降壓片血清；MRS2578+復方七芍降壓片含藥血清組(G)：炎癥因子 +沉默內皮細胞+平滑肌細胞 +復方七芍降壓片血清。除A組外的共培養(yǎng)體系中加入10 ng/mL的TNF-α，構建模擬高血壓炎癥微環(huán)境，給藥組加入10%的含藥血清，其余各組加入等量空白血清，沉默內皮細胞為加入10 μm的MRS2578的內皮細胞，造模及給藥干預24 h后進行相關指標檢測。

1.2.5 細胞活力檢測

采用CCK-8法檢測各組平滑肌細胞及內皮細胞活性。棄孔內液體，然后加入完全培養(yǎng)基200 μL，同時每孔加入 10 μL CCK8 溶液，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3 h，最后用酶標儀于450 nm波長下測定各孔OD值，扣除板底值，并計算各組細胞的相對存活率。其中細胞存活率率＝給藥組細胞存活率/正常組細胞存活率。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測平滑肌細胞與內皮細胞共培養(yǎng)液中炎癥因子IL-8的水平

收集平滑肌細胞與內皮細胞共培養(yǎng)上清液，離心15 min(3000 r/min)，取上清，按照ELISA試劑盒說明書，檢測共培養(yǎng)體系中培養(yǎng)液中IL-8水平。

1.2.7 免疫熒光法檢測內皮細胞中MCP-1、AP-1的蛋白表達

將共培養(yǎng)后的各組細胞，移去Transwell小室及孔內液體，冷PBS潤洗，多聚甲醛固定30 min。用0.25%Triton-100通透15 min，滴加5%BSA封閉10 min，根據(jù)1∶100的體積比分別加入AP-1、MCP-1一抗稀釋液，4℃避光孵育，PBS潤洗。根據(jù)1∶400的體積比加入二抗稀釋液，37℃避光孵育30 min，冷PBS潤洗4次。滴加DAPI避光孵育15 min，PBS潤洗4次。熒光檢測并采集圖像，并記錄細胞平均熒光強度值。

1.2.8 蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測內皮細胞中MCP-1、AP-1的蛋白表達

嚴格按照BCA蛋白檢測試劑盒說明書操作，根據(jù)標準曲線求出每個樣本的蛋白濃度。提取各組細胞蛋白，100℃變性后，SDS-PAGE電泳后采用濕轉轉膜，用含5%脫脂奶粉在室溫封閉2 h。一抗孵育4℃過夜，PBST洗滌 5 min，3次。二抗孵育，PBST洗滌5 min，3次。取ECL發(fā)光液與膜的正面充分接觸進行化學發(fā)光，置于全自動化學發(fā)光分析儀中曝光，通過TANON GIS軟件讀取相關蛋白的條帶灰度值。

1.2.9 實時熒光定量法(qPCR)檢測內皮細胞中AP-1、MCP-1 mRNA的表達

加入適量TRIzol試劑，離心12 000 rpm，5 min，取上清液加入200 μL氯仿溶液，劇烈振蕩15 s后離心，取上清液，加入等體積的異丙醇溶液以沉淀其中的RNA，待RNA沉淀干燥后加入RNAse-fre溶液反復吹打使其完全溶解。按試劑盒說明書操作，逆轉錄合成cDNA，進行PCR反應。通過Primer 5.0軟件設計引物，引物序列見表1。

表1 PCR各基因引物序列Table 1 Primer sequences of PCR genes

1.3 統(tǒng)計學分析

運用SPSS 21.0軟件進行統(tǒng)計學分析。各組實驗數(shù)據(jù)均用平均值±標準差()表示，多組間比較用單因素方差分析，兩組間比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異具顯著性。

2 結果

2.1 對內皮細胞及平滑肌細胞活力的影響

與A比，B組和C組內皮細胞及平滑肌細胞存活率明顯降低(P＜0.01)，表明TNF-α介導的炎癥微環(huán)境對細胞具有一定的損傷作用；與B組比，D組、E組、F組以及G組中的內皮細胞及平滑肌細胞存活率不同程度增加(P＜0.01或P＜0.05)。與D組比，G組內皮細胞及平滑肌細胞存活率增加(P＜0.05)。MRS2578和復方七芍降壓片含藥血清均能明顯恢復炎癥微環(huán)境損傷后的內皮細胞及平滑肌細胞活性(見圖1)。

2.2 對平滑肌細胞與內皮細胞共培養(yǎng)液中炎癥因子IL-8水平的影響

與A組比，B組和C組平滑肌細胞與內皮細胞共培養(yǎng)液中IL-8水平明顯升高(P＜0.01)，表明TNF-α干預構建炎癥微環(huán)境后會造成炎癥因子IL-8分泌增加；與B組比，D、E、F、G組平滑肌細胞與內皮細胞共培養(yǎng)液中IL-8水平不同程度降低(P＜0.01或P＜0.05)；與D組比，G組IL-8水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。MRS2578和復方七芍降壓片含藥血清均能抑制炎癥微環(huán)境損傷后炎癥因子IL-8分泌增加(見圖2)。

2.3 對內皮細胞中AP-1、MCP-1蛋白表達的影響

免疫熒光結果顯示：與A組比，B、C組內皮細胞中 AP-1、MCP-1熒光強度值明顯升高(P＜0.01)；與 B 組比，D、E、F、G 組內皮細胞中AP-1、MCP-1熒光強度值明顯降低(P＜0.01)。與D組比，G組AP-1、MCP-1蛋白熒光強度值降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。復方七芍降壓片能夠抑制炎癥因子誘導的內皮細胞中AP-1、MCP-1蛋白的表達水平，且與MRS2578合用時，這種抑制程度更加明顯(見圖3、4)。

圖1 各組內皮細胞及平滑肌細胞活力比較(，n＝3)Note.Group A.Normal control group.Group B.Model group.Group C.Blank serum control group.Group D.MRS2578 group.Group E.Irbesartan tablet drug-containing serum group.Group F.Compound Qishao Jiangya tablet containing serum group.Group G.MRS2578+compound Qishao Jiangya tablet containing serum group.Compared with the normal control group，?P＜ 0.05， ??P＜ 0.01.Compared with the model group，#P＜0.05，##P＜ 0.01.Compared with MRS2578 group，▲P＜ 0.05， ▲▲P＜ 0.01.(The same in the following figures)Figure 1 Comparison of the viability of endothelial cells and smooth muscle cells in each group(，n＝3)

Western Blot結果顯示：與A組相比，B、C組內皮細胞中 AP-1、MCP-1光密度比值明顯升高(P ＜0.01)。 與B組比較，D、E、F、G組內皮細胞中AP-1、MCP-1光密度比值均明顯降低(P＜0.01)。與D組比較，G組AP-1、MCP-1光密度比值明顯降低(P＜0.01)。復方七芍降壓片能夠抑制炎癥因子誘導的內皮細胞中AP-1、MCP-1蛋白的高表達，且與MRS2578合用時，作用更加明顯(見圖5、6)。

2.4 對內皮細胞中AP-1、MCP-1mRNA的影響

qPCR結果顯示：與A組比，B、C組內皮細胞中AP-1、MCP-1mRNA表達水平均明顯升高(P ＜0.01)。 與B組比較，D、E、F、G組內皮細胞中AP-1、MCP-1mRNA表達水平均明顯降低(P＜0.01)。與D組比較，G組AP-1、MCP-1 mRNA表達水平降低，但差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。復方七芍降壓片能夠抑制炎癥因子誘導的內皮細胞中AP-1、MCP-1mRNA的表達水平(見圖7)。

圖2 各組平滑肌細胞與內皮細胞共培養(yǎng)液中IL-8水平比較(，n＝3)Figure 2 Comparison of IL-8 levels in co-culture medium of smooth muscle cells and endothelial cells in each group( ˉx± s，n＝3)

圖3 各組內皮細胞中AP-1、MCP-1蛋白表達比較Figure 3 Comparison of AP-1、MCP-1 protein expression in each group of endothelial cells

圖4 各組內皮細胞中AP-1、MCP-1熒光強度值比較(，n＝3)Figure 4 Comparison of the fluorescence intensity value of AP-1 and MCP-1 in each group of endothelial cells(，n＝3)

圖5 各組內皮細胞中AP-1、MCP-1蛋白表達比較Figure 5 Comparison of AP-1、MCP-1 protein expression in each group of endothelial cells

圖6 各組內皮細胞中AP-1、MCP-1灰度值比值比較(，n＝3)Figure 6 Comparison of the gray value ratio of AP-1 and MCP-1 in each group of endothelial cells(，n＝3)

圖7 各組內皮細胞中AP-1、MCP-1 mRNA水平比較(，n＝3)Figure 7 Comparison of the mRNA levels of AP-1 and MCP-1 in each group of endothelial cells(，n＝3)

3 討論

復方七芍降壓片是根據(jù)高血壓病“肝腎陰虛、瘀血阻絡”的發(fā)病特點，采用“養(yǎng)陰柔肝、化瘀息風”的立法組方而成。該方由三七、白芍、天麻、杜仲、丹參等11味中藥組成。方中三七活血化瘀通絡、白芍養(yǎng)陰柔肝息風，共為君藥；天麻平肝息風、桑寄生、杜仲補益肝腎、丹參活血祛瘀，共為臣藥；蘿芙木平肝清熱、葛根生津活血、地龍息風通絡、炒香附理氣疏肝，共為佐藥；甘草為使，調和諸藥；以上諸藥合用使陰虛得補，陽亢得平，脈絡得暢，髓海得濡、清竅得養(yǎng)、眩暈自止。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)：三七、天麻、丹參都具有擴張血管、減少外周血管阻力、增加血流量起到降低血壓的作用[13-15]，白芍、杜仲能降低內皮素-1(endothelin-1，ET-1)和增加一氧化氮(nitric oxide，NO)濃度，改善內皮功能，調節(jié)血管重構，降低血壓[16-17]。

血管平滑肌細胞和內皮細胞是血管中的兩個重要組成成分，兩種細胞之間存在肌內皮縫隙連接，允許電和小分子物質傳遞，在調節(jié)血管收縮和舒張功能中起重要作用[18]。內皮功能的損傷是發(fā)生血管重塑的始動環(huán)節(jié)[19]，在炎癥因子TNF-α誘導的血管內皮細胞中，細胞存活率降低，凋亡細胞增多，內皮細胞大量分泌白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素 8(interleukin-8，IL-8)、TNF-α、MCP-1等前炎性因子，導致血管內皮細胞損傷，平滑肌細胞的增殖、遷移，組織纖維化而出現(xiàn)血管結構的改變[20-21]。劉雅蓉等[12]發(fā)現(xiàn)丹皮酚能減少血管內皮細胞炎性分泌的作用，影響血管平滑肌細胞中p38MAPK信號通路，最終抑制其凋亡。黃荷等[22]在內皮細胞-平滑肌細胞共培養(yǎng)體系中發(fā)現(xiàn)，內皮細胞的損傷可引起Toll樣受體4(toll-like receptor 4，TLR4)炎癥蛋白的表達增加，導致內皮細胞炎癥反應加劇，平滑肌細胞增殖、遷移，進而誘發(fā)血管重塑。以上說明內皮細胞的損傷，可以導致其分泌炎癥因子增加，作用于平滑肌細胞，影響血管舒張功能以及促進血管重塑。因此，研究內皮細胞對平滑肌細胞的影響，對保護血管正常功能和改善血管重塑有重要意義。建立內皮細胞-平滑肌細胞共培養(yǎng)體系，模擬體內細胞微環(huán)境，是目前研究內皮細胞和平滑肌細胞相互作用的理想模型[23]。本實驗以TNF-α聯(lián)合血管內皮細胞和血管平滑肌細胞共培養(yǎng)體系構建高血壓炎癥環(huán)境，觀察內皮細胞炎癥對平滑肌細胞增殖、遷移的影響。

AP-1是機體內一類重要的核轉錄因子，由c-Jun和c-Fos兩個亞單位組成的AP-1異源二聚體最為典型。MCP-1屬于趨化類細胞因子，是重要的促炎細胞因子，在單核細胞、內皮細胞、平滑肌細胞等不同細胞中均有表達。內皮細胞中AP-1的兩個亞單位c-Jun和c-Fos的激活可上調MCP-1的表達，促進多種炎癥因子的分泌，引起血管平滑肌增殖、遷移，引發(fā)病理性血管重塑[24-27]。任衛(wèi)瓊等[28]通過抑制SHR大鼠腸系膜動脈中AP-1的活化，抑制MCP-1蛋白表達，能夠降低炎癥因子水平，抑制炎癥反應，保護血管，改善血管重構。氧化低密度脂蛋白的內皮受體-1(lectin-like ox-LDL receptor 1，LOX-1)通過KLF2/AP-1途徑介導內皮功能障礙和損傷，內皮功能的損傷進一步加劇內皮炎癥反應，導致平滑肌細胞增殖、遷移，引發(fā)血管重塑[29-30]。李恒華等[31]發(fā)現(xiàn)葛根素聯(lián)合丹參酮ⅡA通過有效抑制糖尿病大鼠主動脈中MCP-1、TNF-α的表達，減輕血管內皮炎癥反應，增強對血管內皮的保護作用，促使平滑肌細胞功能修復，改善血管重塑。TNF-α通過誘導內皮細胞中AP-1蛋白的活化，可調控多種炎癥因子的釋放，導致內皮功能紊亂，加劇炎癥因子的表達，促使血管平滑肌細胞異常增殖[32-33]；P2Y6受體阻斷劑MRS2578是炎性蛋白的抑制劑，能夠阻斷TNF-α的炎性信號傳遞，抑制平滑肌細胞增殖，改善血管重構[34]。本實驗研究結果顯示，TNF-α誘導的血管內皮細胞和平滑肌細胞存活率明顯降低，血管平滑肌細與內皮細胞共培養(yǎng)產生的炎癥因子IL-8的含量增加，內皮細胞中AP-1、MCP-1蛋白表達和mRNA表達升高。給予藥物干預后，復方七芍降壓片含藥血清組、厄貝沙坦含藥血清組、MRS2578組、MRS2578+復方七芍降壓片含藥血清組內皮細胞及平滑肌細胞存活率增加，IL-8水平降低，內皮細胞中 AP-1、MCP-1蛋白及其mRNA的表達水平降低。提示，復方七芍降壓片能恢復內皮細胞和平滑肌細胞活性，抑制炎癥微環(huán)境損傷后細胞炎癥因子分泌，降低內皮細胞中AP-1、MCP-1的活性，改善內皮損傷，保護平滑肌細胞正常功能，抑制血管重塑。

本實驗研究發(fā)現(xiàn)，復方七芍降壓片能夠改善因炎癥因子TNF-α誘導的內皮細胞及平滑肌細胞的存活率，抑制血管重塑，其機制可能與抑制IL-8的分泌，降低AP-1和MCP-1的活性，抑制內皮細胞炎癥反應，改善內皮損傷，保護平滑肌細胞正常功能有關。