HIV檢測(cè)方法的應(yīng)用研究進(jìn)展

諶章舟， 楊細(xì)鳳，李仲娟，王小琴，游細(xì)玉*

(1.湖北理工學(xué)院 a.醫(yī)學(xué)院, b.腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 黃石 435003； 2.湖北華潤(rùn)武鋼總醫(yī)院 檢驗(yàn)科，湖北 武漢 430080)

《中國(guó)艾滋病毒治療指南(2018版)》建議，為保護(hù)患者的免疫系統(tǒng)，控制艾滋病病毒(HIV)在患者體內(nèi)復(fù)制，減少進(jìn)一步傳播，應(yīng)在所有艾滋病毒感染者中啟動(dòng)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒(ART)治療。相應(yīng)地，這要求提供高質(zhì)量的HIV診斷檢測(cè)，以識(shí)別HIV感染，監(jiān)測(cè)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療的有效性，并及時(shí)評(píng)估HIV/AIDS的控制效果及其在個(gè)人和群體層面出現(xiàn)的耐藥性[1]。因此，艾滋病病毒診斷對(duì)實(shí)現(xiàn)流行控制至關(guān)重要，需要將傳統(tǒng)的基于實(shí)驗(yàn)室的診斷檢測(cè)和新技術(shù)相結(jié)合，以擴(kuò)大覆蓋面、提高檢測(cè)率。

一般情況下，個(gè)人在感染HIV后的臨床癥狀和生物學(xué)特征分為3個(gè)主要階段。第1階段為急性期，以病毒在體內(nèi)迅速增殖和傳播為特征，多發(fā)生在感染后第2～4周。在這一階段，病毒復(fù)制爆發(fā)，血液中的p24抗原(Ag)脫落并達(dá)到峰值。第2階段是慢性或無癥狀期，在此階段，病毒繼續(xù)繁殖，但水平較低。宿主免疫系統(tǒng)也開始產(chǎn)生抗體(Ab)，同時(shí)病毒載量(Viral Load,VL)下降到穩(wěn)定狀態(tài)。隨著VL下降，p24抗原水平也下降。這是由于p24抗原與抗體結(jié)合形成抗體-p24抗原復(fù)合物，從而降低血液中游離p24抗原的水平[2]。從感染到出現(xiàn)抗體(血清轉(zhuǎn)化)的這段時(shí)間被稱為“窗口期”。如果患者不接受治療，隨著病毒繼續(xù)復(fù)制，作為病毒復(fù)制宿主靶細(xì)胞的CD4細(xì)胞會(huì)逐漸被破壞，導(dǎo)致CD4細(xì)胞數(shù)量下降。第3個(gè)階段為艾滋病階段，隨著病毒不斷復(fù)制和CD4細(xì)胞消耗，宿主免疫系統(tǒng)被削弱。這3個(gè)階段出現(xiàn)的HIV RNA、p24抗原、HIV抗體和CD4細(xì)胞的生物標(biāo)記在實(shí)驗(yàn)室診斷艾滋病病毒中的應(yīng)用包括：①抗體檢測(cè)(確定個(gè)體血清狀態(tài))；②p24抗原抗體檢測(cè)和病毒載量定量(區(qū)分短期和長(zhǎng)期感染)；③RNA和DNA檢測(cè)(用于嬰兒早期診斷，EID)；④CD4細(xì)胞的檢測(cè)(疾病進(jìn)展階段的監(jiān)測(cè))；⑤病毒載量測(cè)定(鑒定和監(jiān)測(cè)HIV/AIDS的治療效果)；⑥RNA和DNA檢測(cè)基因的耐藥突變情況(鑒定抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療有效性)。

1 血清學(xué)診斷平臺(tái)的研究進(jìn)展

1.1 酶免疫測(cè)定法

目前，酶免疫測(cè)定(Enzyme immunoassays, EIA)方法已經(jīng)發(fā)展到了第5代。第1代方法是使用從HIV陽性培養(yǎng)的整個(gè)病毒裂解物中提取的抗原來檢測(cè)IgG抗體。該抗原裂解液中存在大量雜質(zhì)，測(cè)定特異性較低，假陽性率極高。隨后，免疫熒光(IFA)等特異性較高的驗(yàn)證性試驗(yàn)被引入，以消除假陽性[3]。第2代檢測(cè)方法是使用從HIV-1蛋白的免疫優(yōu)勢(shì)區(qū)(IDR)和HIV-2的gp36中獲得的合成肽或重組蛋白來增加敏感性和減少假陽性。第3代檢測(cè)是使用三明治形式和多種抗原在血清中捕獲HIV-1和HIV-2抗體，包括HIV-1中的膜蛋白p24與gp160，以及HIV-2中的膜蛋白gp36、IDR的重組肽、合成肽等。除了IgG外，第3代檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)了早期HIV-1 IgM抗體，進(jìn)一步縮短了“窗口期”[4]。第4代是EIAs，使用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光微粒子技術(shù)，同時(shí)檢測(cè)HIV-1 p24抗原、HIV-1(M，N，O組)和HIV-2的抗體。HIV Ag/Ab聯(lián)合檢測(cè)p24抗原縮短了“窗口期”，增加了早期發(fā)現(xiàn)HIV感染的機(jī)會(huì)。這種檢測(cè)儀器提供隨機(jī)存取功能，無標(biāo)本測(cè)試延遲現(xiàn)象，且能在30 min內(nèi)出結(jié)果，檢測(cè)樣本量達(dá)150個(gè)/h，最適合處理大樣本量的檢測(cè)和血庫篩查試驗(yàn)，但無法單獨(dú)區(qū)分檢測(cè)到的p24抗原和HIV-1/2抗體。第5代EIAs，如Bio-Rad BioPlex 2200 HIV Ag-Ab分析，使用了多套磁珠。這些磁珠表面涂有針對(duì)HIV-1 (M，N，O組)和HIV-2的p24單克隆抗體和表位，可作為進(jìn)一步預(yù)防艾滋病毒傳播的早期干預(yù)措施。在“窗口期”感染p24抗原的急性感染者可通過單一檢測(cè)確定，感染HIV-1或HIV-2的個(gè)體也可被確認(rèn)。

1.2 免疫印跡試驗(yàn)

盡管酶聯(lián)免疫篩選技術(shù)在特異性和高敏感性方面取得了長(zhǎng)足進(jìn)展，但仍存在假陽性的問題。因此，在患者開始進(jìn)行抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療之前，需要對(duì)最初的酶聯(lián)免疫試驗(yàn)標(biāo)本進(jìn)行補(bǔ)充檢測(cè)，以確認(rèn)艾滋病毒感染。常用的輔助試驗(yàn)是免疫印跡試驗(yàn)(Western blotting,WB)，即使用梯度純化的HIV裂解液電泳，并將電泳條帶轉(zhuǎn)移到硝化纖維條帶上進(jìn)行WB測(cè)定。在WB上運(yùn)行的標(biāo)本被認(rèn)為是陽性的，其必須包含對(duì)p24抗原反應(yīng)的抗體和一個(gè)或多個(gè)針對(duì)包膜糖蛋白的抗體(gp160/gp120和/或gp41)[5]。

2 HIV快速檢測(cè)平臺(tái)的研究進(jìn)展

2.1 HIV快速檢測(cè)

HIV快速檢測(cè)在20世紀(jì)90年代初開始使用，用于在進(jìn)行外科手術(shù)和器官移植之前及產(chǎn)婦分娩之前迅速確定患者血清狀態(tài)。其優(yōu)勢(shì)在于初級(jí)衛(wèi)生保健中心的非實(shí)驗(yàn)室工作人員也可以為居住在偏遠(yuǎn)地區(qū)的患者提供診斷服務(wù)。開發(fā)的第1個(gè)HIV快速檢測(cè)方法是微基因凝集試驗(yàn)和Abbott Murex單次使用診斷系統(tǒng)[6]。這些早期艾滋病毒快速檢測(cè)的一個(gè)主要問題是具有相當(dāng)高的假陽性和假陰性結(jié)果率。隨后，使用不同的檢測(cè)平臺(tái)，如側(cè)流裝置(測(cè)定HIV-1/2、Unigold、StatPak和OraQuick Advance HIV-1/2)、流式細(xì)胞儀(Insti HIV-1/2)和改良的凝集測(cè)定，極大地簡(jiǎn)化和改進(jìn)了檢測(cè)程序，提高了檢測(cè)敏感性和特異性。這些檢測(cè)平臺(tái)能在30 min內(nèi)完成檢測(cè)，因此非常適合在初級(jí)衛(wèi)生保健站點(diǎn)和流動(dòng)診所進(jìn)行檢測(cè)和咨詢。Insti HIV-1/2檢測(cè)只需1 min，其準(zhǔn)確性也比較高。非實(shí)驗(yàn)室工作人員也可以通過標(biāo)準(zhǔn)的培訓(xùn)進(jìn)行最快速的檢測(cè)。OraQuick Advance HIV-1/2快速檢測(cè)等檢測(cè)方法使用口腔液替代手指穿刺全血的樣本類型，用于提供個(gè)體的HIV血清狀態(tài)[7]。

2.2 HIV自我檢測(cè)平臺(tái)

HIV自我檢測(cè)是一種創(chuàng)新方法，可用于接觸HIV感染高危人群的檢測(cè)，允許個(gè)人收集自己的樣本(口腔液或全血)進(jìn)行HIV測(cè)試。世界衛(wèi)生組織對(duì)HIV快速檢測(cè)手段進(jìn)行了資格預(yù)審，分別是使用全血作為樣本的Autotest VIH和Insti HIV-1/2抗體檢測(cè)，使用口腔液的OraQuick Advance HIV-1/2抗體快速檢測(cè)[8]。同樣，美國(guó)FDA批準(zhǔn)了VIH和Insti的全血HIV-1/2抗體測(cè)試和OraQuick Advance的口腔液HIV-1/2抗體測(cè)試。用戶可以在藥店購買艾滋病毒自我測(cè)試試劑盒，用刺血針刺手指進(jìn)行測(cè)試，按照提供的解釋結(jié)果說明判斷是否感染。若測(cè)試無任何反應(yīng)，但已知最近接觸過艾滋病毒或處于感染高風(fēng)險(xiǎn)的個(gè)人應(yīng)在6周后重復(fù)自我檢測(cè)，以排除處于“窗口期”的可能性。

3 抗體親和力檢測(cè)平臺(tái)的研究進(jìn)展

抗體的親和力(抗體的結(jié)合強(qiáng)度)大小被認(rèn)為是試驗(yàn)是否可靠的標(biāo)志。成熟的抗體已被用來識(shí)別和區(qū)分許多病毒的近期感染(低抗體親和)和長(zhǎng)期感染(高抗體親和)。早期，使用不同的解離試劑對(duì)商業(yè)性HIV檢測(cè)試驗(yàn)(如測(cè)定抗體親和指數(shù))進(jìn)行了改造，雖然提供了一些有用信息，但限制了抗原的使用，還需要自動(dòng)化的平臺(tái)(如Abbott Axsym或Architect)來計(jì)算親和度指數(shù)。為了解決抗原的多樣性問題，一種新型的單孔親和度測(cè)定方法被采用。其使用一定量抗原的孔來進(jìn)行檢測(cè)，限制抗原的數(shù)量，迫使二價(jià)抗體以單價(jià)結(jié)合，從而在一個(gè)孔內(nèi)分離近期感染(弱抗體)和長(zhǎng)期感染(強(qiáng)抗體)。有限抗原親和度EIA的效果比測(cè)定抗體親和度指數(shù)的雙孔試驗(yàn)更好，并已運(yùn)用到商業(yè)試劑盒的開發(fā)中[9]。

4 病毒載量的檢測(cè)和定量平臺(tái)的研究進(jìn)展

在《使用抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物治療和預(yù)防艾滋病毒感染的綜合指南》(2013版)中，世界衛(wèi)生組織強(qiáng)烈建議在監(jiān)測(cè)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒和確認(rèn)治療效果時(shí)使用病毒載量(VL)檢測(cè)。與免疫學(xué)和臨床監(jiān)測(cè)標(biāo)記相比，VL檢測(cè)是ART成功的準(zhǔn)確記錄。在確定HIV載量的檢測(cè)中，最早是通過定量培養(yǎng)外周血單核細(xì)胞或血漿來測(cè)量VL，該方法為勞動(dòng)密集型，缺乏可重復(fù)性。自1996年首次使用PCR技術(shù)分析VL以來，已研發(fā)出幾種商業(yè)分析方法。病毒載量檢測(cè)法已經(jīng)被美國(guó)FDA批準(zhǔn)，并獲得WHO認(rèn)可。在早期階段，該方法會(huì)出現(xiàn)假陽性，而且在同樣的測(cè)量中會(huì)有較大的VL數(shù)據(jù)差異。然而，通過使用污染控制策略、內(nèi)部校準(zhǔn)控制、過程自動(dòng)化和實(shí)時(shí)檢測(cè)技術(shù)，病毒載量測(cè)定法得到了很大的改進(jìn)。隨著所有制造商采用一套通用的已知VL標(biāo)準(zhǔn)，VL測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)化成為可能。制造商還利用收集的臨床標(biāo)本檢驗(yàn)分析敏感性和特異性[10]。血漿中HIV-1 VL的定量被標(biāo)準(zhǔn)化，并表示為每毫升血漿中HIV-1 RNA拷貝數(shù)[11]。

根據(jù)放大原理，病毒載量檢測(cè)試驗(yàn)可分為3組檢測(cè)。第1組是使用逆轉(zhuǎn)錄PCR (RT-PCR)逆轉(zhuǎn)錄HIV病毒RNA為cDNA的檢測(cè)。使用RT-PCR的檢測(cè)包括Abbott RealTime HIV-1 PCR、Beckman Coulter DXN Veris HIV-1檢測(cè)、生物中心通用型HIV-1病毒載量檢測(cè)、Cepheid GeneXpert HIV-1病毒載量檢測(cè)、Roche Cobas CAP/CTM HIV-1病毒載量檢測(cè)和Siemens Versant HIV-1 RNA1.5。第2組采用bioMerieux NucliSens EasyQ HIV-1 v2.0檢測(cè)和Hologic Aptima HIV-1定量檢測(cè)，使用T7 RNA聚合酶進(jìn)行擴(kuò)增。第3組采用 HIV-1 RNA 3.0 (bDNA[DNA])檢測(cè)，采用信號(hào)擴(kuò)增方法。但該檢測(cè)方法也有缺點(diǎn)，如遺傳多樣性可能對(duì)病毒的定量檢測(cè)構(gòu)成挑戰(zhàn)。大多數(shù)VL檢測(cè)是基于PCR擴(kuò)增和來自HIV基因組保守區(qū)域的引物/探針的雜交。然而，在引物的3’端存在1個(gè)或2個(gè)核苷酸取代，就可能導(dǎo)致VL被低估100多倍。早期版本的VL測(cè)試主要是基于B亞型病毒開發(fā)的，通常在非B亞型病毒的測(cè)試中失敗。目前，大多數(shù)的檢測(cè)方法都是針對(duì)HIV-1組M亞型(A至H亞型)多個(gè)保守區(qū)域的引物/探針和循環(huán)重組形式進(jìn)行改進(jìn)。由于遺傳多樣性可以顯著影響VL的測(cè)定，因此檢測(cè)人員必須能夠識(shí)別異常的VL測(cè)定，同時(shí)能夠比較不同VL檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)結(jié)果，并正確量化該檢測(cè)結(jié)果[12]。

5 HIV耐藥性檢測(cè)平臺(tái)的研究進(jìn)展

5.1 表型及基因型檢測(cè)方法

HIV耐藥性(Drug resisitance, DR)監(jiān)測(cè)可通過表型或基因型檢測(cè)方法實(shí)現(xiàn)[13]。表型分析是在體外進(jìn)行的，并在細(xì)胞培養(yǎng)中測(cè)量HIV對(duì)抗逆轉(zhuǎn)錄病毒(Antiretrovirals，ARVs)的敏感性，將HIV基因50%復(fù)制抑制率所需的ARV濃度作為基本評(píng)價(jià)單位，即為[IC50]。由于表型分析方案的復(fù)雜性，它們通常被推薦用于已知或懷疑有復(fù)雜DR突變模式的人，特別是對(duì)蛋白酶抑制劑耐藥的人。本試驗(yàn)需要3 mL血漿，VL最低為500拷貝數(shù)/mL,2～4周即可出報(bào)告，價(jià)格便宜?；蛐蜋z測(cè)則是包括對(duì)HIV基因組的蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或整合酶區(qū)域的測(cè)序，以及識(shí)別對(duì)ARVs具有臨床意義的耐藥突變[14]。在美國(guó)，基因型檢測(cè)被推薦為耐藥檢測(cè)的首選方法，也是標(biāo)準(zhǔn)HIV護(hù)理和管理的一個(gè)組成部分，但由于其高昂的成本及對(duì)實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)設(shè)施和檢測(cè)人員分析技能的高要求，對(duì)于大多數(shù)貧窮國(guó)家是難以承受的。

5.2 基因分型方法

基因分型方法有3種基本類型。①基于Sanger的測(cè)序。以HIV-1基因組的蛋白酶、逆轉(zhuǎn)錄酶或整合酶編碼序列為目標(biāo)，采用傳統(tǒng)的Sanger測(cè)序原理，即DNA聚合酶在體外復(fù)制過程中將鏈終止的二脫氧核苷酸選擇性結(jié)合。最常用的商業(yè)測(cè)定是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的Trugene和ViroSeq測(cè)定。試劑盒的價(jià)格昂貴，主要用于血漿標(biāo)本或外圍單核細(xì)胞檢測(cè)[15]。②深度測(cè)序。目前，有3種不同類型的深度測(cè)序儀器被用于深度測(cè)序，包括Illumina MiSeq、羅氏454/GS初級(jí)測(cè)序儀和離子PGM 200測(cè)序儀。這些儀器的操作原理相似，可在1～2 d內(nèi)完成耐藥性報(bào)告[16]。耐藥相關(guān)基因用患者特異性的引物進(jìn)行擴(kuò)增，并且可同時(shí)將96名患者的擴(kuò)增產(chǎn)物集中在一次深度測(cè)序試驗(yàn)中，從而大大降低操作成本。由于擴(kuò)增的病毒序列具有克隆性，檢測(cè)微小變異的靈敏度可由桑格法的20%提高到1%～5%[17]。Sanger測(cè)序和深度測(cè)序分析都要求對(duì)單個(gè)樣本進(jìn)行常規(guī)測(cè)序或?qū)R集樣本進(jìn)行新一代高通量測(cè)序。這些分析應(yīng)用程序的一個(gè)基本要求是建立一個(gè)復(fù)雜的高維護(hù)性分子實(shí)驗(yàn)室，配備DNA測(cè)序儀和高技能的實(shí)驗(yàn)人員。③ 等位多通道特異性等位基因測(cè)定(Multiplex allele-specific,MAS)。該方法不需要使用測(cè)序儀。例如,多通路復(fù)用基因特異性陣列分析優(yōu)化了20個(gè)耐藥性位點(diǎn)B亞型。C-specific MAS耐藥性試驗(yàn)優(yōu)化了耐藥性樣本，并取得了比較好的效果。耐藥性檢測(cè)結(jié)果主要與Sanger測(cè)序法生成的數(shù)據(jù)序列對(duì)比,由羅氏454 GS-based深度測(cè)序驗(yàn)證[18]。等位基因特異性鑒別檢測(cè)的結(jié)果很容易解釋。如果對(duì)特定國(guó)家或地區(qū)的已知循環(huán)病毒進(jìn)行優(yōu)化，該檢測(cè)可以快速產(chǎn)生耐藥性監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，從而為國(guó)家或地區(qū)的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療政策提供信息。

6 CD4細(xì)胞檢測(cè)平臺(tái)的研究進(jìn)展

CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)已成為艾滋病毒感染患者護(hù)理的關(guān)鍵參考指標(biāo)，是指導(dǎo)患者開始抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療和監(jiān)測(cè)治療效果的主要實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。研究人員開發(fā)了CD4 T細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)，作為識(shí)別和監(jiān)測(cè)HIV感染患者的臨床實(shí)驗(yàn)室測(cè)試。流式細(xì)胞術(shù)允許使用光散射技術(shù)對(duì)單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行定量分析，以確定細(xì)胞的大小和內(nèi)部的復(fù)雜性，并使用激光激發(fā)與細(xì)胞成分結(jié)合的熒光色素來識(shí)別特異性修飾的目標(biāo)細(xì)胞。最早的CD4檢測(cè)采用了雙平臺(tái)方法，使用流式細(xì)胞儀確定CD4 T細(xì)胞的百分比，使用血液學(xué)分析儀提供總淋巴細(xì)胞數(shù)，用這2個(gè)值來計(jì)算CD4 T細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)[19]。體積流式細(xì)胞術(shù)通過流式細(xì)胞和基于珠粒的計(jì)數(shù)(即流式細(xì)胞術(shù))提供精確的樣品體積(在每個(gè)樣本中加入已知濃度的熒光珠)，可以在一臺(tái)儀器上測(cè)定CD4百分比和CD4絕對(duì)計(jì)數(shù)，從而降低結(jié)果的處理復(fù)雜性和可變性[20]。

Becton Dickinson (BD) FACS計(jì)數(shù)系統(tǒng)于1994年發(fā)布，是第一個(gè)專門用于臨床CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)的儀器，是一個(gè)單獨(dú)使用BD試劑的封閉系統(tǒng)，是一種彩色流式細(xì)胞儀，與流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)試劑盒一起用于測(cè)量CD4、CD3和CD8細(xì)胞計(jì)數(shù)。其他試劑，如BD流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)CD4試劑，可用于測(cè)量CD4百分比和CD4細(xì)胞的絕對(duì)計(jì)數(shù)。因具有自動(dòng)選通道和預(yù)先測(cè)量的試劑管，F(xiàn)ACS計(jì)數(shù)系統(tǒng)操作比較方便。但其局限在于相對(duì)較低的吞吐量，每天只能分析30～80個(gè)標(biāo)本[21]。2015年，Beckman Coulter推出的aquos CL儀器作為第一款“加載-運(yùn)行”式的細(xì)胞儀被推向市場(chǎng)。這是一個(gè)完全自動(dòng)化的大型臺(tái)式細(xì)胞儀，減少了實(shí)驗(yàn)室人員的操作時(shí)間。所有的試劑在儀器上都有條形碼，還有專門的質(zhì)量控制材料。在儀器上對(duì)這些材料進(jìn)行分析，如果超出范圍或過期就標(biāo)記出來。Beckman Coulter Aquios CL儀器代表了臨床流式細(xì)胞儀的一個(gè)新時(shí)代，可以自動(dòng)處理標(biāo)本，并跟蹤質(zhì)量控制的有效性和試劑的貨架期。

7 結(jié)束語

在過去的30多年里，HIV診斷學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，HIV分子檢測(cè)的出現(xiàn)縮短了“窗口期”，并從最初主要基于艾滋病毒B亞型的設(shè)計(jì)發(fā)展到包括非B亞型，以克服HIV遺傳多樣性的障礙。除了解決HIV遺傳多樣性之外，還改進(jìn)了檢測(cè)方法，避免誤診、漏診，提高了檢測(cè)率，并不斷改變指導(dǎo)方針，以便在更好地了解艾滋病疫情的情況下，提高患者護(hù)理的質(zhì)量。HIV快速檢測(cè)診斷，能及時(shí)在抗逆轉(zhuǎn)錄病毒治療中確定HIV狀態(tài)和病毒治療效果，在人類與HIV/AIDS的斗爭(zhēng)中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。