花生結(jié)瘤起始因子基因鑒定及其對氮肥的響應(yīng)

田麗彬劉譯陽張佳蕾李榮沖崔 鳳萬書波李國衛(wèi)*

(1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 濟(jì)南250014;2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心/山東省作物遺傳改良與生態(tài)生理重點實驗室,山東 濟(jì)南250100)

氮是空氣中含量最豐富的元素,約占空氣總體積的78.1%,但通常情況下空氣中的氮氣不能直接被植物吸收利用,現(xiàn)代農(nóng)業(yè)依賴工業(yè)氮肥提高作物產(chǎn)量。 近年來發(fā)現(xiàn)大量使用工業(yè)氮肥存在種種弊端,除成本高昂外,還會污染環(huán)境。 于是,經(jīng)濟(jì)環(huán)保的生物固氮越來越引發(fā)關(guān)注[1]。

生物固氮是解決農(nóng)田生態(tài)環(huán)境污染、減少氮肥投入的可行性方法之一。 豆科植物與根瘤菌的共生固氮能力居各固氮體系榜首[2]。 固氮遺傳通路中的重要組成成分結(jié)瘤起始因子NIN 是最早發(fā)現(xiàn)的與結(jié)瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子,在結(jié)瘤早期發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用,同時發(fā)現(xiàn)NIN 的同源蛋白NLP(NIN-like protein)也與氮源利用有關(guān)[3-4]。 Schauser等[5-6]最早在豆科植物百脈根突變體中鑒定出NIN,發(fā)現(xiàn)它能調(diào)控根瘤菌感染線形成和原基細(xì)胞啟動,隨后在豌豆(Pisum sativum)中鑒定發(fā)現(xiàn)了NIN同源基因Sym35,又在擬南芥(Arabidopsis thaliana)和水稻(Oryza sativa)中發(fā)現(xiàn)眾多NIN-like基因[7-10]。

花生是我國重要的油料作物,種植范圍廣泛。花生與根瘤菌互作形成根瘤,根瘤固氮是花生吸收利用氮的重要方式。 然而,生產(chǎn)中氮肥的過量使用形成氮阻遏效應(yīng),抑制根瘤的形成,限制固氮作用的發(fā)揮[11]。 研究結(jié)瘤起始因子基因及其對氮肥的響應(yīng)對深入研究花生根瘤形成具有重要意義。因此,深入研究花生NIN基因家族及其在不同種植模式下對氮肥的響應(yīng),有利于了解結(jié)瘤因子在根瘤發(fā)育中的調(diào)控作用,進(jìn)而明確其在花生根瘤固氮體系中的功能,為提高花生固氮能力和減輕氮肥投入提供科技支撐。

1 材料與方法

1.1 基因檢索

在phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)數(shù)據(jù)庫中檢索大豆(Glycinemax)、水稻(Oryza sativa)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)的NIN 蛋白序列。 利用同科植物大豆NIN蛋白序列,在PeanutBase(https://peanutbase.org/)中運行BLASTP程序篩選出花生NIN 蛋白序列,以滿足E-value＜e-20的標(biāo)準(zhǔn)篩選出目標(biāo)蛋白序列,以FASTA 格式進(jìn)行保存。

1.2 生物信息學(xué)分析

通過Clustalx軟件比對擬南芥、大豆、水稻和花生NIN蛋白序列后,使用Mega5.2軟件,采用鄰接法(neighbor-joining)構(gòu)建進(jìn)化樹[12];利用GSDS(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)在線軟件分析基因結(jié)構(gòu)[13];利用MEME(http://meme-suite.org/)在線軟件分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域。 利用花生轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(NCBI:PRJNA354652),使用Cuffdiff軟件[14]計算花生NIN基因家族在不同組織的表達(dá)量(FPKM 值),利用HemI軟件進(jìn)行表達(dá)模式分析[15]。

1.3 花生NIN 基因在不同施氮條件下的表達(dá)分析

供試品種為花育22。 試驗設(shè)4個處理,花生單作不施氮肥(N0)、花生單作施90 kg/hm2氮肥(N90)、花生//玉米間作不施氮肥(IN0)和間作施90 kg/hm2氮肥(IN90)。 在始花期花生取新鮮根,清洗后液氮速凍,不同地塊分別取樣3次。 提取RNA 進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,用cv.Tifrunner基因組作為參考基因組,使用Cuffdiff軟件計算RPKM 值,分析NIN基因家族的表達(dá)豐度,利用HemI軟件進(jìn)行表達(dá)模式分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 花生NIN 基因鑒定與系統(tǒng)進(jìn)化分析

使用大豆NIN轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列在花生數(shù)據(jù)庫PeanutBase中進(jìn)行基因檢索,得到栽培種花生中33個NIN轉(zhuǎn)錄因子的蛋白序列(表1)。 分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),33個花生NIN基因不均勻地分布于14條染色體上。 其中,13號染色體上分布最多,存在5個NIN基因;其次為01 號染色體,存在4 個NIN基因;03、08、17和20號染色體上各有3個;05、10、11和15號染色體上各有2個;其余4條染色體上各有1個。 其中,Arahy.F3ZCPW和Arahy.ZR07MJ為一對等位基因。

為進(jìn)一步了解花生NIN 與其他物種NIN 的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,利用擬南芥(14個)、水稻(13個)、大豆(28個)和花生(33個)的NIN 轉(zhuǎn)錄因子蛋白構(gòu)建進(jìn)化樹(圖1)。 根據(jù)親緣關(guān)系遠(yuǎn)近將NIN分為A、B、C和D 4組,其中A 組又進(jìn)一步分為A1～A4 4個亞組。 A組中花生NIN基因最多,共14個,A1和A3亞組各含5個花生NIN基因,A2和A4亞組各含2個;B組中花生NIN基因次之,為11個;C組和D組各含4個NIN基因。 不同物種NIN基因分散于4組中,并未因物種差異而單獨聚集,說明花生與其他物種NIN基因之間親緣關(guān)系較近。

2.2 花生NIN 基因結(jié)構(gòu)分析

對33個花生NIN基因結(jié)構(gòu)分析,發(fā)現(xiàn)多數(shù)花生NIN基因的外顯子數(shù)目為4～6個,其中14個基因含有4個外顯子,10個基因含有5個外顯子,6個基因含6個外顯子。 花生NIN基因的外顯子長度和內(nèi)含子數(shù)量相似,說明花生NIN基因在進(jìn)化上保守。 其中,Arahy.1E9R5B、Arahy.L1HKP、Arahy.ILQ5AU和Arahy.P2WFEB變異較大。Arahy.1E9R5B和Arahy.L1HKP發(fā)生了外顯子增多的變異,其中Arahy.1E9R5B含有10個外顯子,并且內(nèi)含子長度明顯增長,其編碼的氨基酸數(shù)目也較其他的多;Arahy.L1HKP含8個外顯子,內(nèi)含子長度增長,但其外顯子長度減少,導(dǎo)致編碼氨基酸數(shù)目并未增多。Arahy.ILQ5AU和Arahy.P2WFEB發(fā)生了外顯子減少的變異,二者均只含有1個外顯子,導(dǎo)致其編碼氨基酸數(shù)目減少 (圖2)。

表1 花生NIN 基因家族生物信息學(xué)分析Table 1 Bioinformatics analysis of NIN family in peanut

2.3 花生NIN 轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域分析

利用MEME在線軟件搜索花生NIN 轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域,結(jié)果發(fā)現(xiàn)花生NIN 轉(zhuǎn)錄因子具有10個保守結(jié)構(gòu)域,分別命名為motif 1～motif 10(圖3)。 同一組的花生NIN 家族成員具有相似的保守結(jié)構(gòu)域,不同組的花生NIN 家族成員的保守結(jié)構(gòu)域相差較大。 所有的花生NIN 轉(zhuǎn)錄因子中均含有motif 7。 經(jīng)鑒定,motif 7 為RWP-RK(PF02042,一段保守的60個氨基酸長度的蛋白質(zhì)序列,可與DNA 結(jié)合),該序列是NIN 轉(zhuǎn)錄因子中最典型的結(jié)構(gòu),廣泛存在于其他物種NIN 轉(zhuǎn)錄因子中, 是識別NIN 家族成員的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)[16-17]。 A 組中只含 有motif 1 和motif 7 兩 個保守結(jié)構(gòu)域。 B組中保守結(jié)構(gòu)域最多,其中motif 9和motif 10是其所特有的,除Arahy.XY5KEE和Arahy.L1 HKPT 外,B 組花生NIN 轉(zhuǎn)錄因子序列含有特殊的motif 10。 B 組 和C 組 都 存 在motif 3,鑒定為PB1(Protein binding 1),推測其可能為蛋白質(zhì)識別結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

2.4 花生NIN 基因組織表達(dá)分析

利用19個花生組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)繪制基因表達(dá)熱圖,分析NIN基因在花生不同組織中的表達(dá)情況,推測該基因在花生中的功能(圖4)。 分析發(fā)現(xiàn),Arahy.I65W25和Arahy.V4BGUX兩個基因在花生根和根瘤表達(dá)量最高,說明這兩個基因與早期根瘤形成有關(guān),與之前報道過的其他物種NIN基因在結(jié)瘤早期發(fā)揮作用結(jié)果一致[18]。 除上述2個基因在根與根瘤表達(dá)量高外,Arahy.2T470H、Arahy.1E9R5B、Arahy.LH2L98和Arahy.0FWB0U在根和根瘤也有較高表達(dá),推測上述4個基因與早期根瘤形成也有一定關(guān)系。Arahy.62AJ6F、Arahy.K1SYDF、Arahy.LH2L98和Arahy.0FWB0U在 花生各個組織中均有表達(dá),推測其表達(dá)具有時空特異性,參與花生各個部位氮素利用的調(diào)控。 其余基因在檢測的組織中表達(dá)量較小,推測這些基因可能在其他未檢測組織表達(dá)。

圖1 花生、大豆、水稻和擬南芥NIN 家族進(jìn)化樹Fig.1 The phylogenetic analysis of the NIN family in peanut,soybean,rice and Arabidopsis

圖2 花生NIN 家族基因結(jié)構(gòu)Fig.2 Gene structure of NINs in peanut

圖3 花生NIN 家族保守結(jié)構(gòu)域Fig.3 Conserved motifs of NIN family members in peanut

2.5 花生NIN 基因在不同施氮條件下的表達(dá)分析

為進(jìn)一步分析花生NIN基因?qū)Σ煌氐捻憫?yīng),利用轉(zhuǎn)錄測序分析了花生單作和花生//玉米間作兩種模式下始花期花生根系中NIN基因?qū)Φ实捻憫?yīng)。 與圖4結(jié)果一致,該基因家族在根中的表達(dá)豐度都比較低,檢測到有10個基因在4種生長條件下均沒有表達(dá),但Arahy.K1SYDF、Arahy.DEK8Z8、Arahy.62AJ6F和Arahy.657RUG在4種處理下表達(dá)量高。 另外,檢測到12個基因在兩種條件下表達(dá)豐度發(fā)生變化。 單作條件下,Arahy.0FWB0U和Arahy.2T470H的表達(dá)受氮素誘導(dǎo),表達(dá)量升高,Arahy.DEK8Z8、Arahy.657RUG、Arahy.8R729R和Arahy.JSL8JQ的表達(dá)受氮素抑制,表達(dá)量降低;間作條件下,Arahy.K1SY0F、Arahy.8R729R、Arahy.2T470H和Arahy.62AJ6F的表達(dá)受氮素誘導(dǎo),表達(dá)量升高,Arahy.0FWB0U和Arahy.657RUG的表達(dá)受氮素抑制,表達(dá)量降低(圖5)。

圖4 花生NIN 基因組織特異性表達(dá)分析Fig.4 Tissue-specific expression of NIN gene family in peanut

圖5 花生NIN 基因在不同氮肥情況下的表達(dá)分析Fig .5 Expression analysis of peanut NIN gene under different nitrogen fertilizers

3 討 論

生物固氮是解決氮肥造成的環(huán)境污染問題的重要方法之一。 NIN轉(zhuǎn)錄因子是根瘤固氮遺傳通路上的重要組成成分,在結(jié)瘤早期發(fā)揮重要作用,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),盡管其功能不同,但都與氮素利用有關(guān)。在沒有根瘤菌侵染的情況下,NIN 轉(zhuǎn)錄因子能夠誘導(dǎo)根瘤皮層細(xì)胞分裂[19];在不同氮素條件下,NLP7能提高植物光合速率和氮同化能力,增加植物的生物量,而nlp7突變體則表現(xiàn)出明顯的氮缺乏表型和抗旱能力[9,20];NLP8通過響應(yīng)硝酸鹽信號促進(jìn)種子萌發(fā)[21],這說明NIN及其同源蛋白在植物根瘤形成與根系氮素利用方面發(fā)揮重要作用。 因此,研究花生NIN基因的功能,能夠明確其在花生根瘤固氮體系中的作用,探索提高花生根瘤固氮能力,減少氮肥施用量,解決氮肥過度使用造成的環(huán)境污染問題。

本研究利用生物信息學(xué)技術(shù)對花生NIN基因的理化性質(zhì)、進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式等進(jìn)行了初步分析。 花生NIN基因按親緣關(guān)系遠(yuǎn)近分為4組,其他物種NIN基因分散于各組中。 A3亞組中Arahy.ILQ5AU僅編碼69個氨基酸,形成RWPRK保守結(jié)構(gòu)域,且該結(jié)構(gòu)域為NIN基因家族所共有的,由此推測花生NIN基因通過RWP-RK 保守結(jié)構(gòu)域起始根瘤形成,調(diào)節(jié)氮素利用[16,19]。 基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析表明,花生NIN 家族外顯子數(shù)目及長度相似,并且同一組的花生NIN 轉(zhuǎn)錄因子具有相似的保守結(jié)構(gòu)域,說明同組的花生NIN基因可能具有相似的功能。 花生NIN基因家族成員較多,說明該家族可能在花生不同部位發(fā)揮不同功能,Arahy.I65W25和Arahy.V4BGUX兩個基因在花生根和根瘤處表達(dá)量相對較高,推測它們可能是花生中主要參與根瘤形成的基因,進(jìn)一步驗證了NIN轉(zhuǎn)錄因子在根瘤形成早期中的作用[18]。Arahy.F3ZCPW和Arahy.ZR07MJ在花生籽仁中相對表達(dá)量較高,推測其參與硝酸鹽促進(jìn)種子萌發(fā)過程,與先前報道過的擬南芥At NLP8 的表達(dá)模式一致[21-22]。Arahy.657RUG、Arahy.DEK8Z8、Arahy.K1SYDF和Arahy.62AJ6F等4個基因在不同種植模式以及不同施氮條件下表達(dá)量變化較明顯,說明這4個基因可能參與了不同種植模式及氮肥條件下根瘤發(fā)育的調(diào)控。 上述研究為挖掘花生根瘤固氮潛力,提高花生對氮肥的利用率,從而解決氮肥過量使用造成的環(huán)境污染問題奠定了理論基礎(chǔ)。