轉(zhuǎn)錄因子Sp7/Osterix的研究進展

李紫玲(綜述)，李經(jīng)堂(審校)

(1.南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)療系2016級；2.江西省人民醫(yī)院骨科，南昌 330006)

基因工程技術(shù)修復(fù)骨缺損是骨組織工程學(xué)發(fā)展方向，通過基因技術(shù)將編碼與骨組織再生相關(guān)的生長因子基因片段轉(zhuǎn)移至種子細(xì)胞中，使種子細(xì)胞持續(xù)高效表達促骨生長因子，從而促進骨形成，這在骨組織工程技術(shù)中有重要研究意義[1]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(bone morphogenetic protein 2，BMP2)是經(jīng)典的骨生長因子[2]，在 BMP2促進成骨信號通路中，Sp7/Osterix(Osx)是一特異性的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子。Osterix于2002年由NAKASHIMA等[3]在BMP2誘導(dǎo)的成肌細(xì)胞C2C12中首次發(fā)現(xiàn)，它位于BMP2下游，通過Wnt/β-Catenin通路、NO66等多種反饋調(diào)控機制調(diào)控成骨細(xì)胞分化，參與骨形成[4]，對骨骼形成至關(guān)重要。

1 Osterix蛋白結(jié)構(gòu)與Sp7基因定位

Osterix是一種由428個氨基酸組成的具有典型轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征的多肽，其分子質(zhì)量為46 kDa。因Osterix與Sp(special protein)家族中的Sp1，Sp3和Sp4具有高度同源性，故將其歸于SP/XKLF家族，人類Osterix的同源物又稱Sp7。

Osterix碳末端存在3個C2H2型鋅指基序結(jié)構(gòu)，為其DNA結(jié)合域，能與富含GC的真核細(xì)胞啟動子牢固結(jié)合，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄[5]。鋅指結(jié)構(gòu)域的上游存在一串與早期生長反應(yīng)因子1(early growth response protein 1，EGR-1)區(qū)域氨基酸相似的堿性氨基酸，對核定位起重要作用。Osterix亦包含了一個由27～192位氨基酸殘基構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域，該區(qū)富含脯氨酸和絲氨酸。Osterix氮末端存在富含脯氨酸的區(qū)域(proline-rich region，PRR)，可介導(dǎo)蛋白質(zhì)相互作用，并通過抑制Wnt信號通路負(fù)向調(diào)控成骨細(xì)胞增殖[6]。

Osterix的亞細(xì)胞定位局限于細(xì)胞核內(nèi)，小鼠的Osterix基因位于15號染色體上Wnt10b和Itga5之間[3]。應(yīng)用熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù)進一步定位人類的Sp7基因，確定其位于人類染色體12q13.13處[7]。

2 Osterix在組織中的表達與功能

2.1 Osterix與骨形成

NAKASHIMA等[3]通過研究小鼠胚胎的發(fā)育過程，最早在13.5 d的胚胎中分化的軟骨細(xì)胞和外周軟骨膜中檢測到了Osterix的表達，并且15.5 d及以后的胚胎中所有骨小梁相關(guān)細(xì)胞和骨領(lǐng)形成相關(guān)細(xì)胞中均有高表達的Osterix。出生13 d后的小鼠骨小梁和次級骨化中心都存在Osterix的高表達，同一時期的骨基質(zhì)、骨內(nèi)膜和骨外膜也有Osterix表達。敲除Osterix基因的小鼠表現(xiàn)出顱蓋骨骨化延遲和顱面畸形[8]。Osterix還被證實可以限制顱骨的起始發(fā)生位置，并參與顱縫的形成[9]。這些實驗結(jié)果表明Osterix對促進成骨細(xì)胞的分化和骨形成至關(guān)重要。

runt相關(guān)基因2(runt-related transcription factor 2，Runx2)為具有異聚體的轉(zhuǎn)錄因子多瘤病毒增強結(jié)合因子2/核結(jié)合因子的α亞單位(Runx2/Cbfα1)，是另一個調(diào)控成骨細(xì)胞分化的重要特異性轉(zhuǎn)錄因子。在Osx(-/-)小鼠中Runx2的表達水平是正常的，說明Osterix對于Runx2的表達并不是必需的，而在Runx2剔除小鼠中則未見Osterix表達，提示Osterix作為Runx2的下游基因發(fā)揮成骨作用[3]。有研究[10]證實Runx2/Osterix 可以和鋅(Zn2+)協(xié)同作用調(diào)節(jié)成骨分化。Osterix還被證明可以上調(diào)成熟成骨細(xì)胞下游標(biāo)志物的表達，包括半胱氨酸分泌蛋白(secreted protein acidic cysteine-rich，SPARC)，骨橋蛋白(osteopontin)，骨唾液蛋白(bone sialoprotein，BSP)，骨鈣蛋白(osteocalcin)和堿性磷酸鹽(alkaline phosphatase，ALP)。此外，Osterix也影響了成骨細(xì)胞的遷移、凋亡和死亡[11]，且能抑制成骨細(xì)胞的增殖[6]。MOON等[12]還發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞中Osterix的破壞會導(dǎo)致皮質(zhì)化過程延遲、成骨細(xì)胞分布異常以及肢體長度減短。

最近有研究應(yīng)用轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在小鼠次級骨化中心發(fā)生之前條件性地破壞骨骺軟骨細(xì)胞中Osterix的表達，發(fā)現(xiàn)小鼠脛骨骨骺的繼發(fā)骨化受損，說明Osterix在軟骨細(xì)胞肥大、分化為成骨細(xì)胞和次級骨化時軟骨向骨轉(zhuǎn)變過程中均起關(guān)鍵作用，研究還發(fā)現(xiàn)Osterix可上調(diào)軟骨細(xì)胞肥大標(biāo)志物表達，包括X型膠原蛋白(collagen type X，Col10)和基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13，MMP13)[13]。Osterix被募集到-30 kb、-20 kb和啟動子近端區(qū)域以激活MMP13表達[14]。軟骨基質(zhì)相關(guān)蛋白(cartilage matrix-associated protein，Ucma)是由LEE等[15]發(fā)現(xiàn)的Osterix下游基因，可促進成骨細(xì)胞分化和結(jié)節(jié)形成。NIU等[16]利用Osterix突變體斑馬魚模型，發(fā)現(xiàn)Col10ɑ1a作為成骨細(xì)胞標(biāo)志物之一而位于Osterix下游。

2.2 Osterix與牙發(fā)育

有研究[17]表明Osterix能以特定位點的方式調(diào)節(jié)成牙本質(zhì)細(xì)胞的分化、成熟和根伸長，是牙根形成中必不可少的因子。Osterix基因在斑馬魚牙冠部牙基質(zhì)發(fā)育礦化中發(fā)揮了一定作用[18]，此外有研究發(fā)現(xiàn)Osterix在成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達存在時間特異性，在分泌牙本質(zhì)基質(zhì)的階段表達強烈[19]。CHOI等[20]繼續(xù)發(fā)現(xiàn)在牙骨質(zhì)形成過程中，Wnt/β-連環(huán)素(β-Catenin)通路的T細(xì)胞因子/淋巴增強因子(T-cell factor/lymphoid enhancer factor，Tcf/Lef)的結(jié)合活性依賴于Osterix的表達。在上頜骨成骨過程中，Osterix存在于Meckel軟骨附近未分化的外基質(zhì)細(xì)胞和腭突的骨化中心[21]。

2.3 Osterix與脂肪形成

Osterix可直接與各種蛋白質(zhì)相互作用調(diào)節(jié)它們的功能活性。有研究發(fā)現(xiàn)Osterix能與脂肪形成標(biāo)志物之一過氧化物酶體增殖物活化受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPAR-γ)的配體結(jié)合域(ligand-binding domain，LBD)結(jié)合，負(fù)向調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄活性，抑制了羅格列酮誘導(dǎo)的脂肪生成[22]。

2.4 Osterix與腫瘤

此外，早已發(fā)現(xiàn)在一些與骨相關(guān)的腫瘤細(xì)胞如骨肉瘤細(xì)胞、骨巨細(xì)胞瘤間質(zhì)細(xì)胞中存在Osterix。LIU等[23]發(fā)現(xiàn)骨髓瘤細(xì)胞中高表達的胸苷磷酸化酶(thymidine phosphorylase，TP)能降低成骨細(xì)胞中Osterix表達水平，從而抑制了成骨細(xì)胞分化，增強了破骨細(xì)胞活性，使骨骼重塑的平衡轉(zhuǎn)變?yōu)楣墙M織的凈損失。YAO等[24]發(fā)現(xiàn)Osterix在乳腺癌細(xì)胞中高表達，與侵襲相關(guān)的分子MMP9是Osterix新的下游靶點。Osterix可通過上調(diào)賴氨酰氧化酶(lysyl oxidase，LOX)的表達而促進乳腺癌侵襲和骨轉(zhuǎn)移，提示預(yù)后不良[25]。

PARK 等[26-27]還發(fā)現(xiàn)發(fā)育的小鼠胚胎中嗅球存在Osterix表達，小腦和大腦皮層則有低水平表達的Osterix。WU等[28]則發(fā)現(xiàn)Osterix譜系細(xì)胞可能促進了結(jié)節(jié)性硬化癥(tuberous sclerosis complex，TSC)患者腎囊腫的發(fā)生。

相信在未來的研究中會揭示Osterix在更多生命過程中的聯(lián)系與機制。

3 Osterix表達的調(diào)控

目前已證實多條調(diào)控Osterix的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(圖1)[29-43]，包括經(jīng)典的絲裂原活化蛋白激酶信號系統(tǒng)(mitogen activated protein kinase cascsde，MAPK)途徑、轉(zhuǎn)化生長因子β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白(TGFβ/Smad)信號通路和Wnt/β-Catenin通路，其中MAPK通路主要有4條，即細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal regulated kinase，ERK)1/2通路、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、p38 MAPK通路及ERK5通路。值得指出的是，上述信號通路并非獨立作用，而是相互聯(lián)系，共同調(diào)控著Osterix表達，組成了錯綜復(fù)雜的信號調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。SAKISAKA等[29]發(fā)現(xiàn)Wnt3a是通過活化p38 MAKP從而上調(diào)牙囊細(xì)胞中Osterix表達，此過程并不受Wnt-受體相關(guān)蛋白(receptor-related protein，LRP)5/6-糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase-3β，GSK3β)軸調(diào)節(jié)。

SUBRAMANIAM等[30]證實TGFβ誘導(dǎo)早期基因-1(TGFβ inducible early gene-1，TIEG-1)直接與Osterix啟動子結(jié)合，在Osterix上游發(fā)揮作用，是BMP2和TGFβ介導(dǎo)的誘導(dǎo)Osterix表達過程中所必需的。在Osterix翻譯水平上，目前發(fā)現(xiàn)的一些調(diào)節(jié)點主要在起始階段。近年來有研究通過間歇流體剪應(yīng)力(intermittent fluid shear stress，IFSS)證實機械敏感性瞬間受體電位離子通道蛋白7(transient receptor potential melastatin 7，TRPM7)通過激酶磷酸化、胞內(nèi)鈣沉積和成骨標(biāo)志基因表達上調(diào)激活Osterix通路[31]。

Osterix蛋白的功能活性可被各種轉(zhuǎn)錄后修飾調(diào)控，包括磷酸化、酰基化、泛素化和甲基化。CHOI等[32]最新發(fā)現(xiàn)，非受體型酪氨酸激酶之一c-Src蛋白通過Osterix的磷酸化提高其蛋白穩(wěn)定性、成骨活性和轉(zhuǎn)錄活性。XU等[33]發(fā)現(xiàn)Ser422是Osterix一個磷酸化新位點，GSK3β正是在此位點與Osterix相互作用。而Osterix中Ser76和Ser80殘基的磷酸化對增強連接蛋白43(connexin 43，Cx 43)啟動子活性具有至關(guān)重要的作用[44]。SIRT7，一種高度特異性的H3K18Ac(組蛋白H3的乙?；?8位賴氨酸殘基)去乙?；?，最近被證實可使Osterix碳末端第368位賴氨酸(K)去乙酰化，從而促進其氮末端的轉(zhuǎn)錄活性，另外這種去乙?；€促進了SIRT1的Osterix去丙?；饔茫瑥亩鰪奜sterix的轉(zhuǎn)錄活性[34]。

值得注意的是，Osterix是一個不穩(wěn)定蛋白，其穩(wěn)定性受泛素-蛋白酶體系統(tǒng)調(diào)節(jié)[45]。近年來，除了發(fā)現(xiàn)高度保守和特異的多肽脯氨酰基順反異構(gòu)酶Pin1可抑制多泛素介導(dǎo)的Osterix蛋白酶體降解[35]，還發(fā)現(xiàn)褪黑素也通過抑制泛素-蛋白酶體介導(dǎo)的Osterix降解以穩(wěn)定其表達[36]。與此作用效應(yīng)相反，RING指型E3泛素連接酶Cbl-b和c-Cbl可增強泛素化，誘導(dǎo)Osterix降解，達到抑制Osterix功能的目的[37]，Hsp70相互作用蛋白(CHIP或STUB1)羧基末端的E3連接酶亦可調(diào)節(jié)Osterix表達，削弱成骨細(xì)胞分化[38]。

除此之外，小分子RNA如miR-302b也參與了Osterix的表達調(diào)控[39]。我國學(xué)者SUN等[40]研究發(fā)現(xiàn)一個在人和小鼠成骨細(xì)胞中都特異性上調(diào)的長非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)分子，命名為lnc-Ob1。他們進一步研究發(fā)現(xiàn)lnc-Ob1通過抑制Osterix啟動子的組蛋白H3的第27號位氨基酸(H3K27me)上三甲基化，顯著上調(diào)Osterix表達。在成骨細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，lnc-Ob1能夠與多梳蛋白Suz12結(jié)合，削弱了H3K27甲基化酶復(fù)合體在Osterix啟動子上的募集程度，從而增強Osterix表達。

Osterix在含Dlx的調(diào)控復(fù)合物中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄共激活因子[46]。腫瘤抑制因子p53抑制Osterix與其成骨靶基因啟動子的Sp1/GC富含位點結(jié)合，且這種相互作用使Osterix與遠(yuǎn)端缺失基因5(distal less like gene 5，Dlx5)分離，此競爭阻礙了Osterix充當(dāng)Dlx5輔助因子激活含同源域啟動子的能力[41]。其他陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的影響Osterix表達的因素還有胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)[47]和1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)[48]。XING等[49]通過實時PCR發(fā)現(xiàn)，當(dāng)正常小鼠血清中甲狀腺激素水平達到峰值時，甲狀腺激素缺乏鼠骨骺中Osterix表達嚴(yán)重受損。進一步發(fā)現(xiàn)甲狀腺激素對Osterix表達的調(diào)控是通過激活甲狀腺激素受體β1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)而實現(xiàn)的[42-43]。

4 與Osterix相關(guān)的臨床疾病

骨質(zhì)疏松癥是由骨吸收增加和骨形成減少引起的骨疾病，其臨床治療包括使用雙磷酸鹽(如阿侖磷酸鹽、利塞磷酸鹽或唑磷酸鹽)或RNA配體(RANKL)抑制劑減少骨吸收。另一種方法是增加骨形成，目前臨床應(yīng)用的唯一高效促進骨形成藥物甲狀旁腺激素PTH[50]，存在使用年限短、治療骨折不敏感、潛在骨肉瘤風(fēng)險等弊端，新的骨形成藥物亟待研發(fā)。王曉剛團隊利用前期構(gòu)建的成骨細(xì)胞靶向遞送系統(tǒng)[51]，實現(xiàn)了卵巢切除所致骨質(zhì)疏松小鼠的lnc-Ob1靶向基因治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)治療后的小鼠骨形成能力顯著增強，骨量顯著增加，提示骨組織特異性lncRNA可能是一個骨質(zhì)疏松精準(zhǔn)治療的潛在靶點[42]。其他近年來新發(fā)現(xiàn)的各種調(diào)節(jié)Osterix表達的因子，提示了治療骨質(zhì)疏松的其他可能靶點，為骨形成藥物的開發(fā)提供了新的策略。HAN等[36]發(fā)現(xiàn)，褪黑素可提高Osterix蛋白穩(wěn)定性，并通過PKA和PKC信號通路調(diào)節(jié)其表達，這為褪黑素作為有效治療骨質(zhì)疏松癥的藥物提供了進一步的證據(jù)。

鑒于Osterix在骨皮質(zhì)形成過程中的重要作用，臨床上對身材矮小的治療也許可以通過上調(diào)Osterix表達而實現(xiàn)[12]。在多發(fā)性骨髓瘤患者骨損傷的預(yù)防和治療中，抑制TP活性從而增加Osterix表達具有重要臨床意義[23]。SHI等[52]發(fā)現(xiàn)頸椎后縱韌帶骨化癥(ossification of the posterior longitudinal ligament，OPLL)由Osterix通過Wnt/β-Catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑介導(dǎo)發(fā)生。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-302/367家族成員miR-302b可通過調(diào)控BMP2/Runx2/Osterix信號通路，提高鈣磷代謝，抑制血管鈣化，緩解大鼠慢性腎衰的狀況，這為慢性腎衰的治療開辟了新思路[39]。在2型糖尿病腎病大鼠模型的腎動脈組織中，Osterix表達隨病程進展而增加，阻斷Osterix相關(guān)信號通路有望成為防治糖尿病血管鈣化的治療靶點[53]。

由于Osterix在骨組織細(xì)胞外沒有任何可測量的范圍，因此它不僅可作為用來確定骨組織工程構(gòu)建體再生潛力的關(guān)鍵標(biāo)志物，而且可確定成骨特異性細(xì)胞的定位和遷移。有實驗從人體天然骨中取出人供骨膜組織，將其包裹在合成聚合物支架上，植入裸鼠體內(nèi)10周后，用免疫組化方法鑒定骨膜細(xì)胞中Osterix的存在和定位，以確定人供骨膜是否保持生物活性和成骨潛能[54]。這一作用促進了臨床應(yīng)用骨組織工程技術(shù)治療各種原因?qū)е碌墓侨笔Ъ膊　?/p>

5 結(jié)語

隨著對Osterix各方面的深入研究，人們對其在各種生命過程中的作用有了越來越清晰的認(rèn)識。Osterix作為成骨細(xì)胞特異轉(zhuǎn)錄因子被發(fā)現(xiàn)，其對骨形成的重要性不容小覷。通過細(xì)致深入研究影響Osterix表達的細(xì)胞信號通路和陸續(xù)發(fā)現(xiàn)各種新的上下游因子，可以極大地推動靶向特定通路或位點的促進骨形成藥物的開發(fā)進程，同時促進骨組織工程的發(fā)展，為臨床上精準(zhǔn)治療各種骨相關(guān)疾病提供新思路和策略。