P2Y12敲除在LPS誘導(dǎo)的急性肺炎肺損傷中的保護(hù)作用

張 鵬，潘改燕，孫巨軍

(1.西安市工會醫(yī)院a.檢驗科；b.腫瘤科，西安 710100；2.西電集團(tuán)醫(yī)院檢驗科，西安 710077)

肺炎是由細(xì)菌、病毒、真菌等致病微生物引起的發(fā)生在終末氣道、肺泡和肺間質(zhì)的炎癥[1]。然而隨著肺炎臨床治療過程中耐藥菌的出現(xiàn)[2-3]，尋找新的抗肺炎藥物成為臨床藥物研究新的挑戰(zhàn)。嘌呤P2受體家族是比較復(fù)雜的受體家族之一，可分為門控離子通道P2X受體和G蛋白偶聯(lián)P2Y受體，目前已發(fā)現(xiàn)7種P2X受體和8種P2Y受體。其中P2Y受體在體內(nèi)分布廣泛，功能復(fù)雜，迄今為止已發(fā)現(xiàn)的P2Y受體有P2Y1、2、4、6、11、12、13、14[4]?，F(xiàn)在的研究發(fā)現(xiàn)，P2Y12受體基因與肺部炎癥和哮喘的發(fā)病密切相關(guān)[5]。

脂多糖(LPS)是內(nèi)毒素的主要成分，存在于革蘭陰性菌細(xì)胞壁的外膜，是現(xiàn)在常用的動物肺炎誘導(dǎo)試劑[6]。本研究通過檢測小鼠肺支氣管灌洗液(BALF)中中性粒細(xì)胞比例和蛋白質(zhì)含量，并通過HE染色觀察肺組織肺損傷情況以及ELISA法檢測肺組織中炎癥因子水平，用于評價P2Y12敲除對LPS誘導(dǎo)的急性肺炎小鼠的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

LPS購自美國Sigma公司；HE染色試劑盒購自西安百螢生物科技有限公司；小鼠腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、白細(xì)胞介素-10(IL-10)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白1β(MIP1b)ELISA試劑盒購自上海晶抗生物工程有限公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.1.2 實驗動物

8周左右C57BL/6J背景P2Y12 KO小鼠(P2Y12 KO組)以及WT小鼠(WT組)購買自上海西普爾-必凱實驗動物有限公司。小鼠均飼養(yǎng)在SPF級動物房內(nèi)，室溫(23±1)℃，晝夜循環(huán)12 h。將WT組和P2Y12 KO組小鼠隨機(jī)分為磷酸緩沖鹽溶液(PBS)處理組(對照組)和LPS處理組(LPS組)2個亞組，每個亞組小鼠40只。LPS組小鼠給予單次腹腔注射LPS(5 mg·kg-1)，建立小鼠急性肺炎模型；對照組小鼠注射等體積PBS。將各亞組小鼠分成2部分，一部分用于生存分析，每組20只，每天觀察并統(tǒng)計小鼠死亡只數(shù)，共觀察7 d；另一部分用于生化檢測，每組20只，觀察PBS處理及LPS處理6、12、48 h生化指標(biāo)變化情況，每次處理小鼠樣本數(shù)為4只。所有動物實驗都遵從動物福利3R原則，本實驗通過本院倫理委員會審查。

1.2 實驗方法

1.2.1 BALF收集與檢測

小鼠過量乙醚麻醉處死，小鼠四肢固定后打開胸腔暴露肺組織，以靜脈滯留針插入氣管，以無菌PBS緩慢沖洗肺組織并回收灌注液。取1 mL BALF在多功能生化分析儀上檢測中性粒細(xì)胞比例；并用RIPA裂解液萃取BALF中總蛋白，并采用BCA試劑盒檢測BALF中總蛋白含量。

1.2.2 組織學(xué)分析

小鼠過量乙醚麻醉后快速打開胸腔，取出肺組織。肺組織分成2部分，一部分凍存在-80 ℃；另一部分快速固定于4%福爾馬林緩沖液中，24 h后進(jìn)行石蠟包埋處理。石蠟包埋的肺組織，用石蠟切片機(jī)切為5 μm厚度的肺組織切片，肺組織切片脫蠟復(fù)水后，用HE常規(guī)染色后觀察其形態(tài)學(xué)變化，并使用Image Pro Plus軟件進(jìn)行分析。

1.2.3 ELISA分析

取凍存的肺組織，經(jīng)勻漿后，用RIPA裂解組織，并收集上清液。根據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟，每個反應(yīng)孔中加100 μL緩沖液稀釋過的抗體，4 ℃包埋孵育過夜，第2天洗板3次。將樣品加入上述已包被的反應(yīng)孔中，37 ℃孵育1 h。洗板后加入酶標(biāo)抗體，37 ℃孵育1 h。加入TMB底物溶液37 ℃反應(yīng)30 min，最后加入硫酸終止反應(yīng)。酶標(biāo)儀中450 nm檢測OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出樣品中各物質(zhì)濃度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)表示，組與組數(shù)據(jù)之間的多重比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 P2Y12敲除對LPS誘導(dǎo)的急性肺炎小鼠生存率的影響

生存分析結(jié)果顯示，與WT組比較，P2Y12 KO組小鼠LPS誘導(dǎo)處理后24～168 h生存率明顯增加(圖1)，表明P2Y12敲除可顯著增加急性肺炎小鼠生存率。

2.2 P2Y12敲除對LPS誘導(dǎo)的急性肺炎小鼠BALF中性粒細(xì)胞及總蛋白含量的影響

WT組、P2Y12 KO組小鼠LPS處理后各時點BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量及總蛋白含量均較PBS處理顯著升高(P<0.05或P<0.01)，而LPS處理后各時點P2Y12 KO組BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量及總蛋白含量均顯著低于WT組(P<0.05或P<0.01)，見圖2。表明P2Y12敲除可顯著降低小鼠LPS后肺損傷程度。

2.3 P2Y12敲除對LPS誘導(dǎo)的急性肺炎小鼠肺組織中性粒細(xì)胞募集和肺水腫的影響

HE染色結(jié)果顯示，WT組小鼠LPS處理24 h后肺組織聚合纖維蛋白染色較PBS處理明顯變深，而P2Y12 KO組小鼠LPS處理24 h后肺組織聚合纖維蛋白染色較WT組小鼠LPS處理24 h后明顯變淺(圖3A)。與WT組比較，P2Y12 KO組小鼠LPS處理24 h后肺組織中性粒細(xì)胞募集、肺水腫水平均顯著減少(圖3B、3C，P<0.01)。表明P2Y12敲除可顯著抑制LPS誘導(dǎo)小鼠肺部炎癥反應(yīng)和肺損傷。

2.4 P2Y12敲除對LPS誘導(dǎo)的急性肺炎小鼠肺組織中炎癥因子表達(dá)的影響

WT組、P2Y12 KO組小鼠LPS處理24 h后TNF-α、IL-6、IL-10和MIP1b表達(dá)水平均較PBS處理顯著升高(P<0.001)，而LPS處理24 h后P2Y12 KO組TNF-α、IL-6、IL-10和MIP1b表達(dá)水平均顯著低于WT組(P<0.01或P<0.001)，見圖4。表明P2Y12敲除可顯著降低LPS誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥反應(yīng)。

3 討論

肺炎在全球范圍內(nèi)具有較高的發(fā)病率，由于抗生素的大規(guī)模使用，肺炎的病死率已經(jīng)得以控制，然而抗生素耐藥性問題逐漸成為全球肺炎治療共同面對的挑戰(zhàn)之一[2-3]。非抗生素類藥物在肺炎治療中越來越受到關(guān)注，例如針對細(xì)菌毒素的中和抗體，針對重癥肺炎病理生理變化的抗凝藥物、免疫調(diào)節(jié)劑、生長因子、間充質(zhì)干細(xì)胞等都顯示出一定的治療效果[7]。

P2Y12受體主要和ADP結(jié)合，是噻氯吡啶、氯吡格雷和AR-C復(fù)合物等作用的靶點[8]。ADP與P2Y12受體結(jié)合后與Gi蛋白耦連，抑制腺苷酸環(huán)化酶活化，誘發(fā)血小板的聚集，從而引起血栓[9]。有研究[10]報道LPS誘導(dǎo)大鼠炎癥后氯吡格雷(P2Y12拮抗劑)治療可降低細(xì)胞因子(IL-6和TNF-α)，并減少肺損傷和肝損害。這些結(jié)果提示了P2Y12抑制可能在肺炎的發(fā)生中起到保護(hù)作用。

本實驗通過LPS注射建立了小鼠肺炎模型，首先研究了WT和P2Y12 KO小鼠BALF中性粒細(xì)胞的變化。中性粒細(xì)胞數(shù)量是臨床肺炎診斷的參考之一，肺炎發(fā)生后中性粒細(xì)胞數(shù)量會顯著增加[11]。本實驗結(jié)果顯示，P2Y12 KO小鼠BALF中性粒細(xì)胞數(shù)量顯著低于WT小鼠。隨后通過HE染色進(jìn)一步驗證了此結(jié)果，P2Y12 KO小鼠肺組織中顯示出更少的中性粒細(xì)胞募集，并且HE染色結(jié)果還顯示P2Y12 KO小鼠肺部聚合纖維蛋白染色較淺，肺水腫程度相比于WT小鼠也明顯減少。

為進(jìn)一步驗證P2Y12 KO對小鼠在LPS肺炎模型中對肺損傷的保護(hù)作用，本研究檢測了BALF總蛋白含量。急性肺損傷發(fā)生時，細(xì)胞釋放出大量抗體等蛋白，總蛋白含量將會升高[12]。本實驗發(fā)現(xiàn)P2Y12 KO在LPS注射后，BALF總蛋白含量明顯低于WT組，并且在LPS注射后0～7 d顯示出較高的存活率。

有研究[13]發(fā)現(xiàn)，LPS在動物體內(nèi)可引起多種免疫細(xì)胞高表達(dá)趨化因子和炎癥因子，在肺組織中引起中性粒細(xì)胞聚集，并增加細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)。本實驗通過ELISA檢測小鼠肺組織中炎癥因子的表達(dá)情況，結(jié)果顯示，P2Y12 KO小鼠肺組織中TNF-α、IL-6和MIP1b含量明顯下降。

綜上所述，本研究結(jié)果表明P2Y12敲除可顯著降低小鼠LPS后肺部炎癥反應(yīng)并減少肺損傷，為肺炎的非抗生素類藥物研發(fā)提供了新的靶點。