PFKFB3敲減抑制肺腺癌細胞A549增殖和轉(zhuǎn)移

王希方，雷 雨，劉 屹，岳青芳，侯銀銀，曹 菲，孫 超，王海鵬，陸王鋒

(1.陜西省人民醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，西安 710068；2.商洛市中心醫(yī)院胃腸外科，陜西 商洛，726000)

肺癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是導致癌癥相關(guān)死亡的主要原因。肺腺癌約占非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的80%，已成為最常見的亞型[1-2]。肺腺癌發(fā)病率呈快速上升趨勢，且其發(fā)病機制至今仍不清楚[3-4]。因此，對引起肺腺癌患者癌變的相關(guān)分子機制進行廣泛的研究十分必要。6-磷酸果糖-2-激酶/2-果糖-2,6-雙磷酸酶(PFKFBs)為一雙功能酶，具有激酶和磷酸酶活性，可因不同的基因編碼4個不同的PFKFBs(PFKFB1,PFKFB2,PFKFB3,PFKFB4)，且酶的活性和組織表達譜完全不同[5]。在PFKFBs成員中，PFKFB3的激酶活性更高，雙磷酸酶活性更低。這增加了果糖2,6-二磷酸(F2,6BP)的產(chǎn)量，在正常和病理生理條件下嚴格控制糖酵解速率[6-7]。既往研究[8]發(fā)現(xiàn)PFKFB3在不同器官和腫瘤細胞中廣泛表達，如胃癌、結(jié)腸癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、甲狀腺癌等，它會引起新陳代謝的改變，導致腫瘤細胞的增殖和存活。PFKFB3具有類似于癌基因的調(diào)控元件，且PFKFB3的高表達是肺腺癌患者總體生存期較差的獨立預后標志物[9]。本研究通過敲減肺腺癌細胞A549中PFKFB3，與未敲減的A549細胞比較細胞活力、細胞周期、細胞轉(zhuǎn)移，探討PFKFB3敲減對肺腺癌細胞A549增殖和轉(zhuǎn)移的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑

人肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。Lipofectamine TM 2000以及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa公司)，PCR引物序列由浙江格魯斯特生物科技公司合成?；A(chǔ)培養(yǎng)基和胎牛血清(美國Biological Industries)，si-PFKFB3 1/2(美國Sigma公司)，青霉素和鏈霉素(上海艾研生物科技有限公司)，酶標儀(美國BD公司)，Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(美國生物工程有限公司)，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)一抗和羊抗兔IgG二抗(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

將A549細胞置于添加青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 μg·mL-1的含15%胎牛血清1640培養(yǎng)液中，置37 ℃、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育。細胞生長覆蓋瓶底時，用0.25%胰蛋白酶消化傳代，平均1～2 d傳代1次。選取對數(shù)生長期的A549細胞經(jīng)胰酶消化后，用基礎(chǔ)培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度為1×106mL-1，將細胞接種到6孔板后37 ℃孵育24 h，按照制造商說明書分別使用si-PFKFB3#1、si-PFKFB3#2以及si-ctrl轉(zhuǎn)染細胞，并檢測轉(zhuǎn)染效率。質(zhì)粒si-PFKFB3#1(5’-AGCCCGGATTACAAAGACTGC-3’)、si-PFKFB3#2(5’-GGTAGCTGGCTTCATAGC’)及對照質(zhì)粒si-ctrl購自美國Sigma公司。

1.3 MTT檢測細胞活力

取對數(shù)生長期轉(zhuǎn)染24 h后的A549細胞，調(diào)整細胞密度以5×103·孔-1接種96孔板內(nèi)，于5%CO2、37 ℃分別孵育24、48、72、96 h后，每孔分別加入20 μL MTT液(5 mg·mL-1)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。終止培養(yǎng)，以500×g離心3 min，棄上清，按照試劑盒說明書使用細胞增殖試劑盒Ⅱ(MTT，Roche，德國)評估細胞增殖，用全自動酶標儀于490 nm處測定并記錄各孔吸光值(A值)，參比波長為630 nm。實驗重復3次。

1.4 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

取轉(zhuǎn)染24 h后A549細胞，按1×106mL-1接種24孔板內(nèi)，放入37 ℃、5%CO2、濕度100%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集各組細胞，棄上清，遇冷PBS洗滌2次，吸去PBS，加入預冷75%乙醇，于4 ℃固定4 h以上。1500 r·min-1離心5 min，棄上清，以3 mL的PBS洗滌3次，按Muse Annexin V、Cell Cycle試劑盒(美國Millipore&Billerica公司)說明書操作，加入Annexin V結(jié)合液重懸細胞，吹打均勻，使細胞密度約為1×108L-1，移至流式管中再加入5 μL Annexin V-FITC染色液，混勻，置于4 ℃避光孵育15 min后，加入10 μL PI染色液混勻，置于4 ℃避光孵育5 min，然后使用熒光激活細胞分選FACS Array生物分析儀(美國Biosciences公司)檢測細胞周期。

1.5 transwell檢測細胞轉(zhuǎn)移能力

1.6 western-bolt(WB)檢測PFKFB3蛋白表達

取轉(zhuǎn)染24 h后A549細胞，以5×103L-1的密度接種，棄培養(yǎng)基，胰酶消化，離心收集細胞，使用PBS稀釋40 μg總蛋白后(1:1000)，加入上樣緩沖液，將其混合并置于95 ℃水浴鍋中水浴5 min加熱變性后進行上樣，配制Mini-PROTEAN TGX凝膠(25%，美國CST公司)，80 V恒壓下蛋白電泳至分離膠與濃縮膠界面時換為120 V電壓，然后在含15%甲醇的Tris-甘氨酸緩沖液中平衡10 min，35 V下轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(美國Billerica公司)。在含5%脫脂牛奶的TBS中室溫封閉1 h，然后與PFKFB3一抗4 ℃孵育過夜。用TBST清洗PVDF膜4次后與IgG二抗室溫孵育2 h。TBST洗滌去除多余抗體后加入化學發(fā)光試劑ECL進行顯影。GAPDH用作內(nèi)參，用Image J軟件進行相應條帶的蛋白水平分析。實驗重復3次。

1.7 統(tǒng)計學方法

實驗數(shù)據(jù)用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用ANOVA方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PFKFB3敲減效率檢測

在A549細胞中轉(zhuǎn)染2種敲減PFKFB3序列的質(zhì)粒，采用WB檢測PFKFB3敲減效率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與si-ctrl組比較，si-PFKFB3#1組和si-PFKFB3#2組PFKFB3/GAPDH蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，見圖1和表1。

表1 WB檢測PFKFB3敲減效率定量結(jié)果

2.2 PFKFB3敲減抑制肺腺癌細胞A549增殖

MTT檢測各組細胞活力，孵育48、72和96 h，與si-ctrl組相同時間點比較，si-PFKFB3#1組和si-PFKFB3#2組細胞活力降低，抑制率升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表2。

表2 各組不同時間點490 nm的平均A值及抑制率比較

2.3 PFKFB3敲減引起肺腺癌細胞A549阻滯在G1期

流式細胞術(shù)檢測各組細胞周期，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與si-ctrl組比較，si-PFKFB3#1組和si-PFKFB3#2組細胞G1期比例增加，S期比例減少，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3和圖2。

表3 各組細胞周期占比比較

2.4 PFKFB3敲減抑制肺腺癌細胞A549轉(zhuǎn)移

transwell檢測各組細胞轉(zhuǎn)移能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與si-ctrl組(305±27)比較，si-PFKFB3#1組(125±20)和si-PFKFB3#2組(136±18)轉(zhuǎn)移細胞數(shù)顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3。

3 討論

肺癌在癌癥中發(fā)病率和病死率位居第一，根據(jù)組織學分類，可分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，約占所有肺癌病例的80%，肺腺癌已成為最常見的亞型，占非小細胞肺癌病例的75%[10]。早期一般沒有明顯的臨床癥狀，往往在胸部X線檢查時被發(fā)現(xiàn)，表現(xiàn)為圓形或橢圓形腫塊，一般生長較慢，但腺癌具有高度浸潤和破壞性生長特征，易侵犯血管，因此極易發(fā)生轉(zhuǎn)移，預后較差。近年來，肺癌的治療取得了許多進展，但非小細胞肺癌的預后至今未見明顯改善。即使進行手術(shù)輔以放化療，肺癌患者的5年生存率也未超過30%[11]。以往的研究[12]發(fā)現(xiàn)：肺腺癌比肺鱗癌(squamous cell lung carcinoma，SqCC)更容易生長和擴散，然而肺腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機制至今仍不清楚。因此，通過識別新的肺腺癌生物標志物，能準確識別肺腺癌的生物學特征，將有助于肺腺癌的診斷、治療和預后，并提供可靠的理論支持。

在PFKFBs家族的4種亞型中，PFKFB3亞型最為重要，因為它功能最為強大。有研究[13]顯示，腫瘤組織中的PFKFB3 mRNA和蛋白水平明顯高于正常組織。最近的研究[14-15]表明，激活PFKFB3分子相關(guān)通路能夠抑制T24細胞PD-L1分子的表達并能夠增強膀胱癌細胞的增殖和遷移能力；PFKFB3在乳腺癌組織中高表達，且與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其高表達提示乳腺癌患者預后不良。雖然科學家們一直未能完全闡明PFKFB3在人類癌癥細胞高表達的確切機制，但是已經(jīng)證明HIF-1α促進PFKFB3 mRNA在人類癌癥細胞的轉(zhuǎn)錄[5,16]。且敲除PFKFB3基因可以降低癌細胞的葡萄糖代謝，進而抑制癌細胞的進展。因此，該酶有望成為腫瘤抗癌治療的靶點。近年來，隨著RNA干擾技術(shù)的進展，已廣泛應用于致癌基因的抑制研究[17]。以往的研究[5]證明PFKFB3在加速糖酵解、血管生成和腫瘤進展中起重要作用。且腫瘤細胞即使處在正常氧含量的狀態(tài)下，也會以增加糖酵解的方式來增加能量供應。有研究[18]報道PFKFB3通過參與糖酵解影響葡萄糖代謝，或者在阻斷PFKFB3的作用時，通過使腫瘤組織的血管正?；瘉頊p少癌細胞的侵襲、血管內(nèi)滲和轉(zhuǎn)移。此外，PFKFB3對胃癌的細胞周期、凋亡、腫瘤生長和侵襲性有顯著的控制作用[19-20]。通過抑制PFKFB3的表達可以將細胞周期停留在G1期，抑制細胞增殖，進而實現(xiàn)癌細胞的凋亡。

本研究通過在A549細胞中轉(zhuǎn)染2種敲減PFKFB3序列的質(zhì)粒證明，si-PFKFB3#1組和si-PFKFB3#2組PFKFB3/GAPDH蛋白相對表達量顯著降低；細胞活力降低；A549細胞阻滯在G1期；抑制肺腺癌細胞A549轉(zhuǎn)移。近年來研究[21]證實，PFKFB3過表達，可增加糖酵解、加快血管生成和腫瘤進展。本研究敲減PFKFB3，其蛋白表達量降低，細胞增殖、轉(zhuǎn)移能力下降，進而抑制肺腺癌進展，其與上述研究相符。這可能與降低其糖酵解，減少能量供應，且促進腫瘤血管正常化，進而抑制了細胞增殖、轉(zhuǎn)移[22]有關(guān)。

綜上所述，敲減PFKFB3，可顯著降低PFKFB3/GAPDH蛋白的表達，抑制肺腺癌A549細胞增殖和轉(zhuǎn)移。提示PFKFB3是一種有前途的抗腫瘤靶向位點，對于肺腺癌的治療有較大的意義，為其藥物的開發(fā)提供了理論依據(jù)。