砷與p38 MAPK信號(hào)通路研究的系統(tǒng)評(píng)價(jià)及Meta分析

胡云華，李婷，欒君，潘映妙，周燚然，宋關(guān)玲，李述剛，郭淑霞*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)系，新疆 石河子 832000；2 首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069)

砷(Arsenic，As)是一種有毒類金屬元素，廣泛存在于自然界中，砷可通過飲水、食物和空氣等環(huán)境載體進(jìn)入體內(nèi)。WHO規(guī)定飲用水中砷的最大限度為10μg/L，超出此標(biāo)準(zhǔn)則會(huì)導(dǎo)致砷中毒。攝入過量的砷，會(huì)損壞人體的各個(gè)器官。砷中毒可致心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及皮膚損害，甚至引起皮膚、膀胱、胃、肺和肝臟等組織或器官發(fā)生癌變[1-2]。且研究顯示砷可導(dǎo)致心肌細(xì)胞破壞崩解，使心肌受損[3]；三氧化二砷對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有明顯抑制作用，可能與誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡有關(guān)[4]。且越來越多的研究認(rèn)為砷的毒作用機(jī)制與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)[5-6]，細(xì)胞凋亡會(huì)間接導(dǎo)致機(jī)體增加癌變的風(fēng)險(xiǎn)。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是由一組級(jí)聯(lián)活化的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶蛋白組成，通過依次磷酸化將上游信號(hào)傳遞至下游應(yīng)答分子。MAPK參與多種細(xì)胞的調(diào)控過程，p38是MAPK信號(hào)通路中控制炎癥的最主要成員[7]，參與細(xì)胞的增殖、凋亡等過程，在細(xì)胞的不同進(jìn)程中扮演著重要的角色。有學(xué)者提出p38信號(hào)通路在砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起作用，但其具體作用機(jī)制存在一定爭(zhēng)議。董小林等[8]發(fā)現(xiàn)10 μmol·L-1的三氧化二砷作用于Jurkat 淋巴瘤細(xì)胞48 h后，結(jié)果顯示p-p38水平高于對(duì)照組，p38信號(hào)通路被激活。而Alice M.Walker等[9]研究顯示2 μg·mL-1的三氧化二砷作用于肺癌細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組相比p38MAPK表達(dá)降低，表明p38信號(hào)通路在砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中起抑制作用。關(guān)于p38信號(hào)通路在砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的結(jié)果并不一致，需進(jìn)一步探討研究。因此，為探討p38 MAPK信號(hào)通路在砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用，本文對(duì)國(guó)內(nèi)外2019年4月1日前發(fā)表的關(guān)于砷與p38 MAPK信號(hào)通路的文獻(xiàn)進(jìn)行了Meta分析，有助于為砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制和砷中毒防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 檢索策略

根據(jù)本次Meta分析的研究目的，制定科學(xué)的文獻(xiàn)檢索策略。采用計(jì)算機(jī)、手動(dòng)檢索、相關(guān)文獻(xiàn)和資料收集追溯等方法進(jìn)行檢索，全面收集國(guó)內(nèi)外2019年4月1日以前公開發(fā)表的有關(guān)砷與p38 MAPK信號(hào)通路研究的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)。

1.1.1 檢索數(shù)據(jù)庫

英文數(shù)據(jù)庫：PubMed、Web of Science、ScienceDirect、Cochrane library。

中文數(shù)據(jù)庫：中國(guó)知網(wǎng)(CNKI)、萬方數(shù)據(jù)庫(WanFang)、維普數(shù)據(jù)庫(VIP)、中國(guó)生物醫(yī)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(SinoMed)。

1.1.2 檢索詞

英文數(shù)據(jù)庫檢索詞：“arsenic AND mitogen-activated protein kinase signal pathways” or “arsenic AND mitogen-activated protein kinase” “arsenic AND MAPK signal pathways” or “arsenic AND p38 signal pathways”。

中文數(shù)據(jù)庫檢索詞：“砷”與“MAPK信號(hào)通路”或“絲裂原活化蛋白激酶”或“MAPK”或“p38”。

1.2 文獻(xiàn)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)

1)文獻(xiàn)中研究對(duì)象為動(dòng)物、細(xì)胞；2)干預(yù)措施：實(shí)驗(yàn)組均接受砷及其化合物處理，對(duì)照組不進(jìn)行處理，為空白對(duì)照；3)結(jié)局指標(biāo)：選用反映p38信號(hào)通路被激活的相關(guān)指標(biāo)，如p-p38蛋白表達(dá)量水平；選用細(xì)胞凋亡相關(guān)指標(biāo)，如細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞存活率等；4)檢索的語言為中英文。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn)

文獻(xiàn)語言非中、英文；標(biāo)題、摘要未涉及到P38；未設(shè)置空白對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組未經(jīng)砷處理；重復(fù)發(fā)表、綜述類、會(huì)議類、書刊類、Meta類的文獻(xiàn)；無法獲取準(zhǔn)確數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)；結(jié)果不包含細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞存活率或P38蛋白表達(dá)量。

1.3 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

納入的文獻(xiàn)由兩名評(píng)價(jià)員進(jìn)行評(píng)價(jià)，當(dāng)兩者意見不一致時(shí)由第三位評(píng)價(jià)員評(píng)判。納入的文獻(xiàn)采用ToxRTool數(shù)據(jù)質(zhì)量可靠性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)[10]，以“是”(1分)或“否”(0分)進(jìn)行評(píng)分。

1.4 數(shù)據(jù)的收集

提取內(nèi)容主要包括：提取各項(xiàng)研究的基本信息，包括篇名、第一作者姓名、發(fā)表時(shí)間等；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的樣本量、砷的種類、砷的劑量、砷暴露方式和作用時(shí)間；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的結(jié)局指標(biāo)，如細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞存活率、p-p38蛋白表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析的方法

應(yīng)用ReviewManage5.3對(duì)所納入文獻(xiàn)中提取的結(jié)局指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用均數(shù)差(MD)合并效應(yīng)量，采用Q檢驗(yàn)和I2統(tǒng)計(jì)量法進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)和敏感性分析，采用漏斗圖檢驗(yàn)有無發(fā)表偏倚；以P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 檢索流程及檢索結(jié)果

根據(jù)本次Meta分析的檢索策略，制定科學(xué)的檢索式，分別在中國(guó)知網(wǎng)、維普、萬方、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫、pubmed、sincedirect、web of science、Cochrane library檢索庫中進(jìn)行檢索。共檢索到968篇文獻(xiàn)，排除重復(fù)文獻(xiàn)138篇，會(huì)議、書籍、綜述類文獻(xiàn)12篇，以及不符合納入標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)805篇，最終納入13篇文獻(xiàn)(圖1)。

圖1 文獻(xiàn)篩選流程圖

2.2 納入研究基本特征

本次研究納入2007～2017年的13篇文獻(xiàn)[7-9,11-20]。其中實(shí)驗(yàn)組給予一定劑量的砷及砷化合物，對(duì)照組為陰性對(duì)照。12篇文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為來源于人體的細(xì)胞，1篇文獻(xiàn)的實(shí)驗(yàn)對(duì)象為來源于小鼠的細(xì)胞。砷的類型有三氧化二砷、亞砷酸鈉、砷和四氧化二砷。結(jié)局指標(biāo)為細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞存活率、p-p38表達(dá)量(表1)。

表1 納入文獻(xiàn)中p38信號(hào)通路的基本信息

2.3 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

納入的13篇文獻(xiàn)中有12篇均處在15～18分之間，屬于1級(jí)可靠無限制類數(shù)據(jù)。1篇為16分，無陽性對(duì)照，屬于3級(jí)不可靠類數(shù)據(jù)(表2)。

表2 納入文獻(xiàn)的質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.4 Meta分析結(jié)果

2.4.1 細(xì)胞凋亡率

納入13篇文獻(xiàn)，提取到有關(guān)細(xì)胞凋亡率的文獻(xiàn)有5篇。經(jīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)(χ2=712.03，P<0.001)發(fā)現(xiàn)各研究間具有異質(zhì)性(I2=99%)。砷干預(yù)組細(xì)胞凋亡率MD為31.10，95%CI[10.14，52.05]，高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.91，P<0.05)?？芍?，高劑量的砷處理可以增加細(xì)胞凋亡率(圖2)。

圖2 砷干預(yù)對(duì)細(xì)胞凋亡率影響的森林圖

2.4.2 細(xì)胞存活率

納入的文獻(xiàn)中，提取到有關(guān)細(xì)胞存活率結(jié)果的有6篇。經(jīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)(χ2=634.94，P<0.001)，發(fā)現(xiàn)各研究間異質(zhì)性較大(I2=99%)。故采用隨機(jī)效應(yīng)模型且以MD合并統(tǒng)計(jì)量，砷干預(yù)組細(xì)胞存活率MD為-61.88，95%CI[-83.02，-40.74]，低于對(duì)照組，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=5.74，P<0.05)?？芍邉┝康纳樘幚砜梢越档图?xì)胞存活率(圖3)。

圖3 砷干預(yù)對(duì)細(xì)胞存活率影響的森林圖

2.4.3 p-p38表達(dá)量

納入的文獻(xiàn)中，提取到有關(guān)p-p38表達(dá)量的文獻(xiàn)有7篇。經(jīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)(χ2=1456.84，P<0.001)顯示各研究間具有異質(zhì)性(I2=100%)。砷干預(yù)組p-p38表達(dá)量MD為0.34，95%CI[-0.03，0.71]，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=1.81，P=0.07)。結(jié)果表明：高劑量的砷處理可以增加p-p38表達(dá)量(圖4)。

圖4 砷干預(yù)對(duì)p-p38表達(dá)量影響的森林圖

2.4.4 亞組分析

經(jīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率結(jié)果各研究間存在異質(zhì)性(I2=99%)。為探討異質(zhì)性來源，進(jìn)行亞組分析。根據(jù)砷的不同作用時(shí)間(≤24 h或>24 h)、劑量(≤10 μmol·L-1或>10 μmol·L-1)分為不同亞組。按不同作用時(shí)間分組后，亞組分析結(jié)果為(χ2=0.21，P=0.65，I2=0%)，兩亞組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

因此砷的作用時(shí)間不是細(xì)胞存活率異質(zhì)性的主要來源(圖5)。

圖5 砷干預(yù)對(duì)細(xì)胞存活率按作用時(shí)間亞組分析的森林圖

按砷的不同劑量分組后，亞組分析結(jié)果為(χ2=0.95，P=0.33，I2=0%)，兩亞組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，因此砷的劑量也不是細(xì)胞存活率異質(zhì)性的主要來源(圖6)。

圖6 砷干預(yù)對(duì)細(xì)胞存活率按暴露劑量亞組分析的森林圖

2.5 敏感性分析

為了評(píng)價(jià)研究結(jié)果的穩(wěn)定性，對(duì)納入的文獻(xiàn)包含p-p38表達(dá)量的7項(xiàng)研究進(jìn)行敏感性分析，探討異質(zhì)性的來源以及對(duì)合并效應(yīng)量產(chǎn)生的影響程度。敏感性分析結(jié)果顯示每剔除一項(xiàng)納入研究，其MD、可信區(qū)間及異質(zhì)性檢驗(yàn)結(jié)果并未發(fā)生明顯改變，說明分析結(jié)果比較穩(wěn)健。且去除Jeong,Chang Hee[12]的文獻(xiàn)后，異質(zhì)性顯著下降，敏感性分析見表3。

表3 p-p38表達(dá)量的敏感性分析

2.6 發(fā)表偏倚(圖7)

本研究采用漏斗圖來判斷納入研究的發(fā)表偏倚見圖7。

圖7 p-p38表達(dá)量的漏斗圖

大樣本研究的點(diǎn)集中分布于圖形的頂部和中部，而小樣本研究分布在漏斗的底部，離散度較小。漏斗圖結(jié)果顯示:未沿中心線呈對(duì)稱分布，提示存在一定的發(fā)表偏倚(圖7)。

3 討論

砷是一種常見的環(huán)境污染物和毒物，攝入過量的砷會(huì)引起砷中毒及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[3-4,21]，且砷暴露可導(dǎo)致癌癥、糖尿病、高血壓、心血管疾病、皮膚損傷和代謝紊亂等多種疾病，對(duì)人類健康造成極大的危害[22]。然而，有研究表明砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用在治療白血病和控制腫瘤方面具有及其重要的意義。近年來關(guān)于砷毒作用機(jī)制提出了多種假說：其中絲裂活化蛋白原激酶MAPK信號(hào)通路的改變對(duì)砷所致細(xì)胞增殖與凋亡的影響受到廣泛關(guān)注[23]。p38 MAPK是MAPK信號(hào)通路的主要成員之一，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與p38信號(hào)通路關(guān)系的研究結(jié)果尚存在爭(zhēng)議[8-9,24]，因此展開本研究，為今后揭示砷的毒性作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

本研究Meta分析顯示砷干預(yù)組的細(xì)胞凋亡率、p-p38表達(dá)量均高于對(duì)照組，細(xì)胞存活率低于對(duì)照組，表明砷在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡過程中，可降低細(xì)胞存活率，使p-p38表達(dá)量升高，同時(shí)p38信號(hào)通路被激活，這與段曉旭[25]、韓雪松[26]的研究結(jié)果一致。細(xì)胞凋亡是由相應(yīng)基因控制細(xì)胞自主的程序性死亡，其對(duì)于維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)具有重要意義。p38信號(hào)通路是MAPK家族中重要的一員，其存在于細(xì)胞漿內(nèi)[7]。細(xì)胞在受到砷的刺激時(shí)，自細(xì)胞表面受體起通過MAPK激酶激酶(MAPKKK)→MAPK激酶(MAPKK)→MAPK三級(jí)級(jí)聯(lián)反應(yīng)途徑依次磷酸化MEKK→MKK3/6→P38，磷酸化后的p38(p-p38)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，進(jìn)而調(diào)控其下游轉(zhuǎn)錄因子p53、NF-kB等的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，完成對(duì)外界刺激的反應(yīng)[27-28]。當(dāng)細(xì)胞受到各種外界刺激后，可將刺激放大并傳遞至細(xì)胞核內(nèi)，使p38信號(hào)通路磷酸化，p-p38表達(dá)量升高，活化的磷酸化p38通過降低Bcl-2水平，減少 NF-kB 向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)，同時(shí)導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放和caspase-3的活化從而介導(dǎo)線粒體途徑的細(xì)胞凋亡[29-30]。本次Meta分析研究也得出了同樣的結(jié)果：砷作用細(xì)胞后激活了p38信號(hào)通路，活化的p38信號(hào)通路可能通過上述途徑使細(xì)胞發(fā)生凋亡，因此，為了降低砷對(duì)機(jī)體的損傷作用，可從下調(diào)p38途徑研究，降低p-p38表達(dá)量，減緩細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)而減輕對(duì)機(jī)體的影響。

經(jīng)異質(zhì)性檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)各研究間存在異質(zhì)性，為探討異質(zhì)性來源，根據(jù)砷的作用時(shí)間、劑量進(jìn)行了亞組分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明砷的作用時(shí)間和劑量不是產(chǎn)生細(xì)胞存活率這一結(jié)局指標(biāo)異質(zhì)性的來源。推測(cè)本研究的異質(zhì)性可能來源于文獻(xiàn)中未做詳細(xì)描述的因素如砷的暴露方式、細(xì)胞的培養(yǎng)方式等。對(duì)p-p38表達(dá)量這一指標(biāo)進(jìn)行敏感性分析，本次研究中逐一去除單項(xiàng)研究后，總合并效應(yīng)量未發(fā)生大的變化，說明敏感性低，結(jié)果較穩(wěn)定。本課題組后續(xù)擬進(jìn)行體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)小鼠實(shí)驗(yàn)，明確分組方式、納入可能的因素進(jìn)行深入研究，且本研究的結(jié)果可為探討MAPK信號(hào)通路在砷誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)亡或機(jī)體損傷過程中的作用及砷的毒性機(jī)制提供參考依據(jù)。

本次Meta分析解決了砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與p38信號(hào)通路關(guān)系的爭(zhēng)議，但研究存在一定局限性：目前關(guān)于砷與p38信號(hào)通路研究相對(duì)較少，最終納入13篇文獻(xiàn)，但有1篇文獻(xiàn)未設(shè)置陽性對(duì)照組，且各個(gè)研究間的樣本量差異較大，所得結(jié)果可能不夠全面；對(duì)異質(zhì)性較大研究進(jìn)行了亞組分析，尚未找到確切的異質(zhì)性來源。后續(xù)還需通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證研究來明確。

4 展望

通過對(duì)砷與p38 MAPK信號(hào)通路的Meta分析研究，可初步認(rèn)為砷及其化合物能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，降低細(xì)胞存活率，且砷誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制與增加p-p38 蛋白表達(dá)水平，激活p38信號(hào)通路有關(guān)。目前砷的毒性機(jī)制和致癌機(jī)制尚未明確得出結(jié)論，但已有研究顯示與MAPK信號(hào)通路的密切有關(guān)；MAPK信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡等各種生理過程，且在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)變中發(fā)揮著極其重要的作用。因此，明確砷與p38信號(hào)通路之間的關(guān)系對(duì)研究砷的毒性機(jī)制以及致癌機(jī)制有著重大的作用，這些發(fā)現(xiàn)可為今后研究砷的毒作用機(jī)制以及地方性砷中毒的防治提供一定的參考依據(jù)，砷與MAPK信號(hào)通路的相互作用也是后續(xù)研究的重點(diǎn)方向。