彩色馬蹄蓮品種對(duì)果膠軟腐桿菌Pcc抗性的評(píng)價(jià)方法及鑒定

張琪 郭彥兵 李紫薇 吳紅芝

摘 ?要：為探索彩色馬蹄蓮（Zantedeschia spp.）接種胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovora subsp. Carotovora， Pcc）的適宜方法，鑒定彩色馬蹄蓮組內(nèi)品種對(duì)軟腐病菌Pcc的抗性情況，本研究先以10個(gè)彩色馬蹄蓮品種為試驗(yàn)材料，進(jìn)行以完整葉片、葉片圓片（葉盤）為接種材料的室內(nèi)離體接種，以及以主脈、側(cè)脈為接種部位的溫室活體植株接種，接種后分別于12、24、36 h 3三個(gè)時(shí)間點(diǎn)，以發(fā)病率、病情指數(shù)為指標(biāo)，統(tǒng)計(jì)馬蹄蓮軟腐病發(fā)病情況;在明確適宜的接種方法和發(fā)病時(shí)間后，選取包括第1一步試驗(yàn)品種在內(nèi)的34個(gè)彩色馬蹄蓮品種進(jìn)行Pcc抗性鑒定。結(jié)果表明：離體接種的最佳材料為完整葉片，最佳發(fā)病觀察時(shí)間是24 h;活體接種的最佳接種部位為葉片主脈，最佳發(fā)病觀察時(shí)間是36 h;離體鑒定的中抗品種為5個(gè)，感病品種為11個(gè)，高感品種為18個(gè);而活體鑒定的中抗、感病和高感品種分別為2、17、15個(gè)。離體方法鑒定結(jié)果的中抗品種多于活體鑒定的，離體方法鑒定的抗性情況更接近更符合田間大規(guī)模生產(chǎn)的情況，其原因可能是離體方法鑒定時(shí)接種材料的均一性、環(huán)境條件的一致性好，方面更容易控制，更能反應(yīng)品種本身的抗性情況。

關(guān)鍵詞：彩色馬蹄蓮;細(xì)菌性軟腐病;離體抗性鑒定;活體抗性鑒定

中圖分類號(hào)：S436.8 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： The study was aimed to explore the suitable inoculation method of soft rot pathogen Pcc on the colored Zan-tedeschia spp.， and identify the resistance of the varieties in the section Aestivae， which are called the colored Zantede-schia spp. to Pcc. Ten cultivars from the section Aestivae were used as the experimental materials to explore the suitable method for Pcc inoculation. Whole leaf and disk disc were used as the inoculation material in the identification in vitro， and main vein or lateral vein of the plants were compared for suitable inoculation site in the field identification in vivo. Disease incidence and disease index was observed at 12 h， 24 h and 36 h respectively after inoculation. After the suitable inoculation method and the best time of observing disease development were confirmed， 34 cultivars of colored Zantedeschia spp.， including the 10 cultivars used in the first experiment were selected to identify the resistance to Pcc. The suitable material for inoculation in vitro was whole leaf， and the best observation time was 24 hours， ?main vein was better inoculation site than lateral vein for the plant in field， and the best observation time was 36 hours. There were 5 moderately resistant varieties， 11 susceptible varieties， and 18 highly susceptible varieties in the identification in vitro. There were 2 moderately resistant varieties， 17 susceptible varieties， and 15 highly susceptible varieties in the field identification in vivo. There were more moderately resistant varieties in the identification in vitro than that ones in vivo， which was in line with the situation of large-scale production in the field. The reason maybe it is easier to control the uniformity of materials inoculated and the consistency of environmental conditions in the identification in vitro than that in the field plant， so it is better to test the resistance of Zantedeschia spp. varieties to Pcc.

Keywords： Zantedeschia spp.; bacterial soft rot; in vitro resistance identification; in vivo resistance identification

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.025

彩色馬蹄蓮（Zantedeschia spp.）是天南星科（Araceae）馬蹄蓮屬（Zantedeschia）多年生草本球根花卉，其花型獨(dú)特，花葉俱賞，具有極高的觀賞價(jià)值，深受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛(ài)[1-2]。由胡蘿卜軟腐果膠桿菌（Pectobacterium carotovora subsp. Carotovora， Pcc）引起的軟腐病被稱作彩色馬蹄蓮“癌癥”[3-5]，是威脅彩色馬蹄蓮產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要病害。Pcc可以侵染馬蹄蓮各個(gè)生長(zhǎng)階段植株的任何部位，初期侵染部位病斑呈水漬狀，且病健交界明顯，隨著侵染面積不斷擴(kuò)大，染病組織開始軟化和腐爛，并散發(fā)出惡臭，最終導(dǎo)致植株死亡[6]。尚無(wú)有效的防治方法，目前主要采用嚴(yán)格的綜合措施防治馬蹄蓮軟腐病[7-8]，因此選育抗病品種是控制該病害的有效途徑。

植株抗性的表型鑒定是抗病育種工作的重要環(huán)節(jié)，鑒定方法主要有離體接種和活體接種2種，離體接種是以生長(zhǎng)發(fā)育和大小基本一致的植物組織（葉片、葉柄等）為材料[9-10]，接種Pcc后置于環(huán)境可控的培養(yǎng)箱中觀察發(fā)病情況，并進(jìn)行病害等級(jí)評(píng)價(jià);活體接種是以完整植株的植物組織為材料，將Pcc接種于植株的適宜部位后，進(jìn)行病情統(tǒng)計(jì)和抗病等級(jí)評(píng)價(jià)[11-12]。目前，關(guān)于彩色馬蹄蓮離體接種和活體接種的適宜方法尚無(wú)報(bào)道。

本研究以10個(gè)彩色馬蹄蓮品種為材料，對(duì)彩色馬蹄蓮離體接種和活體接種的接種材料、接種部位、發(fā)病時(shí)間進(jìn)行比較研究，獲得彩色馬蹄蓮Pcc抗性鑒定的適宜方法后，對(duì)34個(gè)彩色馬蹄蓮品種的軟腐病抗性進(jìn)行鑒定，以期為彩色馬蹄蓮生產(chǎn)及馬蹄蓮軟腐病抗病育種研究提供抗性資源和技術(shù)支持。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

以目前市場(chǎng)流行的34個(gè)彩色馬蹄蓮品種：‘Ym109’‘Ym110’‘Ym105’‘Ym031’‘Ym064’‘Ym035’‘Ym004’‘Ym067’‘Ym023’‘Ym015’‘Ym088’‘Ym107’‘Ym038’‘Ym066’‘Ym043’‘Ym007’‘Ym063’‘Ym034’‘Ym044’‘Ym022’‘Ym017’‘Ym025’‘Ym032’‘Ym024’‘Ym166’‘1712’‘1708’‘1716’‘1734’‘1735’‘1713’‘1714’‘1715’‘1722’為抗性鑒定試驗(yàn)材料，其基本信息如表1，其中‘1708’‘1713’‘1716’‘1722’‘1734’‘1735’‘Ym031’‘Ym034’‘Ym015’‘Ym109’10個(gè)品種同時(shí)用于發(fā)病時(shí)間、接種材料、接種部位的比較試驗(yàn)。

利用彩色馬蹄蓮帶芽塊莖進(jìn)行外植體培養(yǎng)，通過(guò)增殖、壯苗和生根獲得大量長(zhǎng)勢(shì)一致、生長(zhǎng)健壯的組培苗，煉苗一周后，移栽到裝有無(wú)菌基質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)缽中，并放在溫室中進(jìn)行同質(zhì)化水肥管理，待馬蹄蓮幼苗葉片長(zhǎng)出3～5片時(shí)，即可接種Pcc進(jìn)行后續(xù)鑒定試驗(yàn)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?軟腐病菌Pcc的培養(yǎng)方法 ?將保存于?80 ℃冰箱的Pcc菌株取出，采用平板稀釋涂布法在固體牛肉膏蛋白胨（NA）培養(yǎng)基上活化。用無(wú)菌牙簽挑取單菌落置于裝有液體NA培養(yǎng)基的50 mL無(wú)菌離心管中，28 ℃搖床上250 r/min震蕩培養(yǎng)24 h后，利用血球計(jì)數(shù)板法計(jì)算菌液濃度[13]，用無(wú)菌水將菌液濃度稀釋為108 CFU/mL備用。

1.2.2 ?馬蹄蓮離體接種Pcc ?待馬蹄蓮移栽苗長(zhǎng)至3～5片葉后，從田間采集長(zhǎng)勢(shì)一致、大小均一的健康葉片，留1～2 cm葉柄，保濕后帶回實(shí)驗(yàn)室，用無(wú)菌水將葉片表面沖洗干凈，用于完整葉片和葉片圓片（葉盤）的Pcc接種。完整葉片的接種方法為：將完整葉片的葉柄用吸有無(wú)菌水的無(wú)菌脫脂棉保濕，每個(gè)品種接種3片葉，3次重復(fù)，接種后分別放在墊有無(wú)菌吸水濾紙的方形盤中。葉盤法的接種方法為：用滅菌的直徑10 mm的打孔器將葉片打孔獲得葉盤，將葉盤放在墊有無(wú)菌吸水濾紙的培養(yǎng)皿中，每個(gè)品種接種3個(gè)皿，每皿接種11個(gè)葉盤。2種材料均采用注射法接種，無(wú)菌注射器吸取10 μL的Pcc菌液注射入葉片/葉盤正面主脈，以同樣的接種方法接種等量（10 μL）的無(wú)菌水作對(duì)照，接種后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，期間噴無(wú)菌水保濕，分別于接種后12、24、36 h時(shí)計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.3 ?馬蹄蓮活體接種Pcc ?將馬蹄蓮組培苗移栽至溫室中培養(yǎng)，待其長(zhǎng)至3～5片葉時(shí)，選擇天氣晴朗、溫室溫度約22～28 ℃的上午進(jìn)行接種。每個(gè)品種選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的植株，每株接種3片葉，共接種30株苗，其中主脈和側(cè)脈各接種15株，注射法接種10 μL菌液，以同樣的接種方法接種等量（10 μL）無(wú)菌水作對(duì)照。分別于接種12、24、36 h時(shí)計(jì)算病情指數(shù)。

1.2.4 ?不同品種彩色馬蹄蓮的抗性鑒定 ?按照上述步驟篩選出的適宜鑒定方法對(duì)34個(gè)供試彩色馬蹄蓮品種進(jìn)行Pcc抗性鑒定。在Pcc接種后12、24、36 h 3個(gè)時(shí)間段，計(jì)算病情指數(shù)和抗性分級(jí)。首先使用畫有刻度線的黑色紙板作為背景，對(duì)各品種的感病葉片拍照，再將照片導(dǎo)入圖像處理軟件ImageJ V1.8.0中進(jìn)行病斑面積和完整葉片面積的計(jì)算，根據(jù)病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)（表2）進(jìn)行病害級(jí)別劃分，計(jì)算病情指數(shù)后，按照抗病性歸類標(biāo)準(zhǔn)（表3）對(duì)各品種進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。

計(jì)算公式為：

（1）發(fā)病率=發(fā)病株數(shù)/接種總株數(shù)×100%

（2）病情指數(shù)=[∑（各級(jí)病葉數(shù)×各級(jí)代表值）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)代表值）]×100。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel軟件錄入整理，采用DPS V9.01軟件進(jìn)行方差分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?彩色馬蹄蓮Pcc接種適宜離體材料及鑒定時(shí)間的篩選

由表4可知，離體完整葉片接種24 h和葉盤接種12 h時(shí)，彩色馬蹄蓮品種間軟腐病抗病性存在顯著差異（P<0.05）。10個(gè)供試馬蹄蓮品種分別采用完整葉片和葉盤法接種后的抗性評(píng)價(jià)為：‘1735’‘Ym109’‘Ym031’表現(xiàn)為中抗（MR）;‘1708’‘1716’、‘1722’‘Ym015’‘Ym034’表現(xiàn)為感病（S）;‘1713’‘1734’表現(xiàn)為高感（HS）。結(jié)果表明，完整葉片和葉盤2種接種材料中，10個(gè)品種的抗性評(píng)價(jià)一致，說(shuō)明完整葉片和葉盤這2種材料均適用于彩色馬蹄蓮Pcc離體抗性鑒定。結(jié)合圖1和圖2可知，葉盤接種鑒定法比完整葉片接種鑒定法發(fā)病速度快，葉盤接種24 h時(shí)大部分品種的病斑面積接近100%，已無(wú)法區(qū)分品種的抗性差異?？梢?jiàn)完整葉片更適合作為離體接種的材料。

由表5可知，離體完整葉片和葉盤接種Pcc后的發(fā)病率隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷增大（12 h<24 h<36 h），且馬蹄蓮品種間存在顯著差異（P<0.05）。在24 h時(shí)，發(fā)病達(dá)到高峰，而36 h時(shí)的發(fā)病率較24 h時(shí)變化不大，發(fā)病情況基本穩(wěn)定。從圖1可看出，完整葉片接種24 h時(shí)，病斑面積較為明顯，而接種36 h時(shí)，整片葉均被病菌侵染，無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算病斑面積;由圖2可知，葉盤接種12 h時(shí)病斑面積較大，而接種24 h時(shí)病斑幾乎浸漬整個(gè)葉盤無(wú)法準(zhǔn)確計(jì)算病斑面積?？梢?jiàn)，根據(jù)馬蹄蓮離體葉片接種Pcc后病斑面積的變化趨勢(shì)，離體接種適宜的發(fā)病時(shí)間為24 h。

2.2 ?彩色馬蹄蓮Pcc活體接種適宜部位及鑒定時(shí)間的篩選

由表6可知，植株葉片主脈和側(cè)脈接種Pcc 36 h時(shí)，‘Ym109’接種主脈鑒定為中抗品種（病情指數(shù)為46.20），接種側(cè)脈鑒定為感病品種（病情指數(shù)為68.70），而其他品種抗性評(píng)價(jià)基本一致，部分品種的病情指數(shù)達(dá)到差異顯著水平（P< 0.05）?！甕m109’接種過(guò)程中由于分布側(cè)脈的葉片較薄，注射菌液時(shí)容易把葉片刺穿，造成傷口，加快發(fā)病速度，因此彩色馬蹄蓮活體接種Pcc適宜的接種部位為葉片主脈（圖3）。

從表7可以看出，不同彩色馬蹄蓮品種葉片主脈和側(cè)脈接種Pcc后，馬蹄蓮品種間各時(shí)間點(diǎn)的發(fā)病率均存在顯著差異（P<0.05），且發(fā)病率均在36 h時(shí)達(dá)到最大。其中，主脈接種12、24、36 h時(shí)的最高發(fā)病率分別為86.67%、93.47%、100.00%;側(cè)脈接種12、24、36 h時(shí)的最高發(fā)病率分別為80.00%、85.00%、93.60%。由圖4可看出，馬蹄蓮葉片主脈在接種Pcc后于不同的時(shí)間點(diǎn)（12、24、36 h）進(jìn)行發(fā)病情況觀察發(fā)現(xiàn)，病斑面積隨接種時(shí)間的延長(zhǎng)而不斷擴(kuò)大，36 h時(shí)各個(gè)品種的葉片病斑最為明顯，此時(shí)能較為準(zhǔn)確地鑒定馬蹄蓮抗性。因此，馬蹄蓮活體接種最佳發(fā)病時(shí)間為接種后36 h。

2.3 ?彩色馬蹄蓮組內(nèi)不同品種的抗性鑒定

2.3.1 ?離體抗性鑒定 ?離體完整葉片接種Pcc 24 h對(duì)34個(gè)供試品種進(jìn)行Pcc抗性鑒定。由表8可知，不同抗性等級(jí)的部分品種間病情指數(shù)達(dá)到差異顯著水平（P<0.05），供試品種的發(fā)病率在81.33%～100.00%之間，病情指數(shù)在53.99～93.86之間，其中，表現(xiàn)為中抗（MR）、感?。⊿）和高感（HS）的占比分別為14.71%、32.35%和52.94%。中抗（MR）的品種有：‘1735’‘Ym109’ ‘Ym110’‘Ym105’‘Ym031’，其病情指數(shù)分別為57.51、59.59、53.99、57.69、54.20。

2.3.2 ?活體抗性鑒定 ?馬蹄蓮苗期葉片主脈接種Pcc 36h進(jìn)行抗性鑒定表明（表9），不同抗性等級(jí)的部分供試品種間病情指數(shù)達(dá)到差異顯著水平（P<0.05），各品種發(fā)病率在62.39%～97.94%之間，病情指數(shù)在50.77～93.76之間。對(duì)34個(gè)供試品種進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)發(fā)現(xiàn)，中抗（MR）、感?。⊿）和高感（HS）品種分別占5.90%、50.00%和44.10%，其中品種‘Ym031’和‘Ym110’的抗性評(píng)價(jià)為中抗（MR），其病情指數(shù)分別為50.77和52.76。

3 ?討論

植物病原抗性鑒定時(shí)，接種植物材料的不同會(huì)影響接種病菌后的病情發(fā)生情況，馬蹄蓮Pcc抗性鑒定常用的接種材料有葉片[11]、葉柄[3-4]、莖[12]、種球[14]等組織。本研究以彩色馬蹄蓮苗期完整葉片和葉盤為材料，通過(guò)注射法接種Pcc，結(jié)果表明，完整葉片接種24 h時(shí)病斑癥狀明顯且能區(qū)分不同品種間的差異，36 h時(shí)所有品種病斑幾乎擴(kuò)展整個(gè)葉片;相比完整葉片接種，葉盤法接種24 h時(shí)病斑幾乎擴(kuò)展至整個(gè)葉盤，病害癥狀發(fā)展過(guò)快，難于區(qū)分不同品種間的抗性差異。因此，彩色馬蹄蓮苗期離體接種時(shí)，適宜的接種材料為完整葉片。

不同的接種方法對(duì)植株的發(fā)病情況也有影響，細(xì)菌接種常用的方法有針刺法、涂抹法、噴霧法、注射法。王雪皎等[11]以彩色馬蹄蓮葉片為材料，采用葉片噴菌液、針刺侵染菌液、注射器注射菌液3種方法接種Pcc，發(fā)現(xiàn)只有針刺法和注射法能使葉片發(fā)病。商雨等[15]采用直接葉片噴菌液、傷口噴菌液、針刺侵染菌液3種方法接種Pcc至彩色馬蹄蓮葉片，發(fā)現(xiàn)只有傷口噴菌液和針刺接種菌液能使葉片產(chǎn)生發(fā)病。說(shuō)明Pcc病菌入侵植株需要有傷口。針刺法造成的傷口不均一且菌液量難以控制，相比針刺法，注射法傷口少且能實(shí)現(xiàn)定量注射菌液，使鑒定結(jié)果更為準(zhǔn)確，可作為抗性鑒定和評(píng)價(jià)的依據(jù)。

光溫水汽等外在環(huán)境條件以及品種之間基因型的差異也是影響植物發(fā)病的重要因素[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)34個(gè)彩色馬蹄蓮品種的離體和活體抗性鑒定結(jié)果存在差異。離體鑒定的抗性情況更接近田間大規(guī)模生產(chǎn)，這可能是由于離體接種是在室內(nèi)，溫濕度等環(huán)境條件一致性好，環(huán)境差異導(dǎo)致的影響小，更能反應(yīng)品種本身的抗性情況。此外，在離體接種中，較容易獲得長(zhǎng)勢(shì)一致，大小均一的葉片較容易，而在活體抗性鑒定中，不易獲得長(zhǎng)勢(shì)一致，大小均一的植株不容易。

本研究鑒定了國(guó)內(nèi)普遍栽培的34個(gè)彩色馬蹄蓮品種的軟腐病抗性，是國(guó)內(nèi)主要栽培彩色馬蹄蓮品種對(duì)軟腐病菌Pcc抗性的首次報(bào)道，為彩色馬蹄蓮軟腐病防控和研究應(yīng)用提供了有力支持。從數(shù)量和栽培品種的覆蓋率方面，本研究遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)王雪皎等[11]報(bào)道的6個(gè)品種，其中‘Ym044’和‘Ym063’在本研究中也為供試品種。在王雪皎等[11]的鑒定中，這2個(gè)品種的抗性等級(jí)均為中抗，與本研究中‘Ym044’高感、‘Ym063’感病的結(jié)果不一致。本研究和王雪皎等[11]的研究中使用的方法均為注射法接種活體植株，而鑒定結(jié)果產(chǎn)生差異的原因可能是由于活體鑒定的植株長(zhǎng)勢(shì)和環(huán)境條件存在差異。

4 ?結(jié)論

本研究以10個(gè)彩色馬蹄蓮品種為材料，通過(guò)離體接種（完整葉片、葉盤）和溫室活體接種（主脈、側(cè)脈）以及接種后12、24、36 h 3三個(gè)時(shí)間段內(nèi)馬蹄蓮軟腐病發(fā)病情況的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)離體接種的最佳材料為完整葉片，最佳病情統(tǒng)計(jì)時(shí)間是24 h;溫室活體接種的最佳部位是葉片主脈，最佳病情統(tǒng)計(jì)時(shí)間是36 h。

采用完整葉片離體接種鑒定法和溫室活體主脈接種鑒定法對(duì)34個(gè)彩色馬蹄蓮品種進(jìn)行Pcc抗性鑒定，離體鑒定結(jié)果為中抗品種5個(gè)，感病品種11個(gè)，高感品種18個(gè);溫室活體鑒定結(jié)果為中抗品種2個(gè)，感病品種17個(gè)，高感品種15個(gè)，2種方法鑒定的結(jié)果稍有差異。

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