龍眼DlTRF2-like的克隆及表達模式分析

李浩然 張樹偉 王金英 黃小雄 彭宏祥 徐炯志 潘介春 朱建華 譚春露 李平 丁峰

摘 ?要：以龍眼成熟葉片為材料，克隆龍眼MYB-related基因家族TRF2-like基因，命名為DlTRF2-like，并對其進行生物信息學(xué)和表達模式分析。DlTRF2-like基因?qū)儆贛YB-related家族的TRF-like亞家族，ORF長度是909 bp，編碼含有302個氨基酸殘基的蛋白，預(yù)測該基因定位于細(xì)胞核，同源基因進化分析表明龍眼DlTRF2-like與阿月渾子PvTRF2-like親緣關(guān)系最近。利用實時熒光定量PCR檢測DlTRF2-like基因在‘四季蜜’龍眼不同組織及乙烯利和多效唑處理后不同時間的相對表達量。結(jié)果表明：DlTRF2-like在龍眼不同組織中均有表達，在花芽中表達量最高;乙烯利和多效唑處理后，DlTRF2-like基因的表達量明顯高于對照，推測DlTRF2-like響應(yīng)乙烯利和多效唑信號促進龍眼成花。

關(guān)鍵詞：龍眼;MYB-related;龍眼成花;TRF-like亞家族;表達模式分析

中圖分類號：S667.2 ? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

Abstract： The TRF2-like gene of MYB-related family was cloned from the mature leaves of longan and named DLTRF2-like. Bioinformatics and the expression pattern of DLTRF2-like were analyzed. DLTRF2-like gene belongs to the TRF-like subfamily of MYB-related family， with an ORF length of 909 bp， encoding a protein of 302 amino acids which was predicted to be located in the nucleus. Evolution analysis of homologous genes indicated that DLTRF2-like was most closely related to PvTRF2-like in Pistacia vera L. The expression pattern of DLTRF2-like in different tissues and leaves treated by ethephon and paclobutrazol was analyzed by real-time quantitative PCR. The results showed that DLTRF2-like was expressed in all the samples， and the highest expression level was found in flower buds. The expression level of DLTRF2-like gene in the leaves treated by ethephon and paclobutrazol was significantly higher than that of the control. The results indicated that DLTRF2-like might response to ethephon and paclobutrazol signal to promote the flowering of longan.

Keywords： longan; MYB-related; longan flowering; TRF-like subfamily; expression pattern analysis

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.012

龍眼（Dimocarpus longan Lour.）是無患子科龍眼屬常綠果樹，在我國栽培歷史悠久。廣西是龍眼主產(chǎn)地之一，采收期在7月中下旬至8月下旬。產(chǎn)期過于集中是我國龍眼生產(chǎn)面臨的主要問題之一，為了有效調(diào)節(jié)龍眼產(chǎn)期，提高龍眼生產(chǎn)效益，生產(chǎn)上多采用修剪和化學(xué)調(diào)控等方法促進龍眼成花?；瘜W(xué)調(diào)控主要采用植物生長調(diào)節(jié)劑和氯酸鉀誘導(dǎo)龍眼成花，但是不同品種及不同地區(qū)的調(diào)控效果存在差異?！募久邸梢荒甓啻纬苫ǎ３霈F(xiàn)花果同期現(xiàn)象，生產(chǎn)上常用乙烯利、多效唑等處理，調(diào)控‘四季蜜’龍眼成花坐果時間。因此，解析龍眼成花的分子調(diào)控機制具有重要的理論和生產(chǎn)意義。

MYB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、生長代謝和細(xì)胞形態(tài)建成等生物學(xué)過程，在植物響應(yīng)逆境脅迫[1-5]、花色素苷合成[6-7]、調(diào)控開花時間[8]等過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)高度保守的結(jié)構(gòu)域的特征，可將MYB轉(zhuǎn)錄因子分為4個亞類，1R-MYB（MYB-related）、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB（4個R1/R2的重復(fù)）。1R-MYB轉(zhuǎn)錄因子亞類，是重要的端粒結(jié)合蛋白，在生長發(fā)育過程中起重要作用[9]。MYB-related家族可劃分為5個亞家族：CAA1-like/R-R、TBP-like、CPC-like、I-BOX-like和TRF-like。各亞家族結(jié)構(gòu)高度保守，其中CAA1-like/R-R亞家族成員結(jié)構(gòu)均含有1個保守的氨基酸基序（SHAQK（Y/F）F）;TBP-like亞家族成員結(jié)構(gòu)均含有1個LKDKW（R/K）（N/T）基序;CAA1-like/R-R和TBP-like亞家族都含有紅藻同源基因且最古老，而CPC-like和I-BOX- like亞家族在被子植物中才形成;其中CPC-like是從2R-MYB類的R3重復(fù)區(qū)域演化而來，I-BOX-like則是從含有2個MYB結(jié)構(gòu)域的R-R類型的第一個MYB重復(fù)區(qū)域演化而來;TRF-like亞家族在進化過程中非常保守，且數(shù)量最少。

端粒結(jié)合蛋白TRF（telomere repeat binding factor， TRF）在人和動物中的功能研究較多，端粒結(jié)合蛋白TRF1、TRF2（telomere repeat-binding factor， TRF）與抑制因子激活蛋白Rap1（repressor activator protein 1）、TRF1相互作用的核蛋白2（TRF1-interacting nuclear protein 2， TIN2）、端粒保護蛋白1（protection of telomeres 1， POT1）和POT1結(jié)合蛋白1（telomere-binding protein POT1- interacting protein 1， TPP1）形成復(fù)合物，參與維持端粒DNA結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和損傷修復(fù)、細(xì)胞的衰老凋亡、增殖和分化等[10]。TRF1和TRF2均以同源二聚體的形式結(jié)合到端粒雙鏈DNA的YTAGGGTTR序列。TRF2和Ku70相互作用可以抑制端粒重組[11]。在擬南芥、水稻和玉米中，端粒長度與開花時間呈負(fù)相關(guān)，端粒越長，開花更早[12]。在擬南芥中，TRB通過結(jié)合telobox基序招募PRC2（polycomb repressive complexes）到靶基因介導(dǎo)H3K27me3表觀修飾[13]。在植物春化過程中PRC2與VIN3（vernalization insensitive 3）共同參與開花抑制基因FLC的表觀沉默，從而促進植物開花[14]。

為探索龍眼DlTRF2-like基因在成花調(diào)控中的生物學(xué)功能，本研究以龍眼葉片為材料克隆該基因，對其進行生物信息學(xué)分析，采用實時熒光定量PCR方法分析DlTRF2-like基因在‘四季蜜’龍眼不同組織及乙烯利和多效唑處理后不同時期的表達，為深入探索DlTRF2-like基因在龍眼成花過程中的作用機制提供參考依據(jù)。

1 ? 材料與方法

1.1 ?材料

在廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院龍眼園基地采集‘四季蜜’龍眼的根、莖、葉片、葉柄、花芽、果肉、果皮和種子等8個不同組織的樣品，‘四季蜜’龍眼噴施乙烯利和多效唑[15]后0、1、8、15、22（開花）、29、36、43 d等8個不同時期的葉片，以清水處理為對照。采樣后擦拭葉片表面灰塵后，迅速置于液氮中速凍備用，各處理3次重復(fù)。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 ?樣品總RNA用多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN）提取，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取質(zhì)量，cDNA第一鏈的合成使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒Prime ScriptTM RT Reagent Kit（Takara），隨后將產(chǎn)物置于–20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ?‘四季蜜’龍眼DlTRF2-like基因的克隆 ?根據(jù)已公布的龍眼基因組信息，設(shè)計DlTRF2-like基因引物kl-DlTRF2-like F、kl-DlTRF2-like R1、kl-DlTRF2-like R2（表1），以合成的cDNA第一鏈為模板，采用Prime star Max Premix 2X高保真酶（Takara）進行ORF全長擴增。經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確的條帶使用試劑盒Gel Extraction Kit（Takara）回收，回收產(chǎn)物連接到pMD18-T載體后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，隨機挑選陽性克隆菌液測序，獲得DlTRF2-like基因的序列信息[16]。

1.2.3 ?DlTRF2-like蛋白的生物信息學(xué)分析 ?利用NCBI-CDS在線軟件預(yù)測蛋白保守結(jié)構(gòu)域，使用軟件MEGA 5.0鄰近相接法（neighbour joining）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，DNAMAN V6軟件進行同源基因的多重序列比對。通過在線軟件（http：//www. soft-berry.com/berry.phtml？topic=index&group= programs &subgroup=proloc）對DlTRF2-like進行亞細(xì)胞定位預(yù)測。

1.2.4 ?龍眼DlTRF2-like基因的表達分析 ?DlTRF2- like基因的相對表達量，采用SYBR Premix Ex Taq（TaKaRa）在LightCycler 480實時熒光定量PCR儀（roche， switzerland）檢測。反應(yīng)程序如下95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán);循環(huán)結(jié)束后95 ℃ 5 s，60 ℃ 1 min進行溶解，50 ℃冷卻30 s。以ActinF、ActinR為內(nèi)參基因，3次重復(fù)，相對表達量的計算采用2–ΔΔCT法[17]。

2 ? 結(jié)果與分析

2.1 ?DlTRF2-like基因的序列分析及和多重序列比對

‘四季蜜’龍眼DlTRF2-like基因ORF長度為909 bp（圖1），編碼的蛋白含有302個氨基酸殘基（圖2）。蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析表明，DlTRF2-like蛋白屬于SANT-TRF/Myb-related超家族，在多肽鏈的N端存在Myb-related結(jié)合位點（圖3），且存在含有SANT/MYB-like家族的端粒重復(fù)結(jié)合因子DNA結(jié)合域SANT_TRF，通過在線軟件預(yù)測DlTRF2-like蛋白定位在細(xì)胞核。

使用軟件DNAMAN V6對龍眼DlTRF2-like和其他物種同源基因進行多重氨基酸序列比對（圖4），發(fā)現(xiàn)龍眼DlTRF2-like中含有MYB- related基因家族典型保守序列LKDKWRN，確定該序列為MYB-related基因家族中的一員。

2.2 ?構(gòu)建龍眼DlTRF2-like蛋白質(zhì)進化樹

將龍眼DlTRF2-like蛋白與NCBI中相似度較高的14種植物進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建與分析[阿月渾子（Pistacia vera）PvTRF2-like（XP_ 031272926.1）、柑橘（Citrus sinensis）CsTRF2（XP_006466449.1）、克萊門柚（Citrus clementina） CcTRF2（XP_006426109.1）、橡膠樹（Hevea brasiliensis）HbTRF2-like（XP_021682630.1）、美洲櫟（Quercus lobata）QlTRF2（XP_030975007.1）、雷蒙德氏棉（Gossypium raimondii）GrTRF2-like（XP_012491976.1）、棗（Ziziphus jujuba）ZjTRF2- like（XP_015890310.1）、栓皮櫧（Quercus suber）QsTRF2（XP_023919472.1）、陸地棉（Gossypium hirsutum）GhTRF2-like（XP_016697329.1）、可可（Theobroma cacao）TcTRF2（XP_007047553.1）、木薯（Manihot esculenta）MeTRF2-like（XP_ 021630908.1）、核桃（Juglans regia）JrTRF2-like（XP_035539599.1）、甜櫻桃（Prunus avium）PaTRF2（XP_021805532.1）、榴蓮（Durio zibethinus）DzTRF2-like（XP_022740061.1）。發(fā)現(xiàn)龍眼DlTRF2-like蛋白與阿月渾子PvTRF2- like的親緣關(guān)系最接近，其次是柑橘CsTRF2和克萊門柚CcTRF2，它們的功能可能更為相似（圖5）。

2.3 ?DlTRF2-like基因的表達分析

2.3.1 ?DlTRF2-like基因‘四季蜜’龍眼不同組織中的表達 ?實時熒光定量PCR結(jié)果表明（圖6），DlTRF2-like基因在‘四季蜜’龍眼不同組織中的表達存在顯著性差異，DlTRF2-like基因在花芽中的表達量最高，是根中表達量的8倍;其次是葉柄，表達量約為根中的6倍;然后是葉片，表達量是根中的3.3倍，DlTRF2-like基因在莖、果肉、果皮和種子的表達量與根相近，說明DlTRF2-like基因主要在‘四季蜜’龍眼的葉片和花芽中發(fā)揮重要功能。

2.3.2 ?噴施乙烯利和多效唑的葉片中DlTRF2- like基因的表達情況 ?噴施乙烯利和多效唑后DlTRF2-like基因的表達量與對照存在較大差異（圖7），噴施乙烯利和多效唑后的表達量明顯高于同時期的清水對照，說明噴施乙烯利和多效唑可以誘導(dǎo)DlTRF2-like基因在‘四季蜜’龍眼葉片中的表達。噴施乙烯利和多效唑后15 d，DlTRF2-like基因表達量最高，其次是43 d。DlTRF2-like基因在開花前的0、1、8 d表達量相近，在15 d表達量迅速上升至3倍，噴施乙烯利和多效唑后22 d開花，而清水對照未開花，且22 d表達量下降至1倍水平，說明DlTRF2-like基因在臨近開花時起重要作用。43 d末花期表達量增高原因暫時不明確。

3 ?討論

本研究獲得了龍眼DlTRF2-like基因，DlTRF2-like屬于TRF-like亞家族，全長909 bp，編碼302個氨基酸，含有一個Myb-related保守結(jié)構(gòu)域LKDKWRN。亞細(xì)胞定位預(yù)測顯示DlTRF2-like蛋白定位于細(xì)胞核中。NCBI比對發(fā)現(xiàn)龍眼DlTRF2-like與阿月渾子PvTRF2-like的親緣關(guān)系最接近，其次是柑橘CsTRF2和克萊門柚CcTRF2，目前暫無阿月渾子PvTRF2-like、柑橘CsTRF2和克萊門柚CcTRF2功能相關(guān)報道，龍眼DlTRF2-like基因功能有待進一步分析。

PcG（polycomb group）介導(dǎo)的表觀修飾在動植物的發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。擬南芥PcG與PWO1（pwwp domain interactor of polycombs1）相互作用調(diào)控開花和發(fā)育[18]。在擬南芥中TRB可以結(jié)合telobox基序，并與PcG的核心催化酶CLF（curly leaf）和SWN（swinger）相互作用，招募PRC2介導(dǎo)靶基因的表觀修飾[13]。

多效唑和乙烯利具有抑制果樹營養(yǎng)生長和促進成花的作用[19-20]。在龍眼栽培中，乙烯利有明顯的促花和增加開花數(shù)的作用，高濃度乙烯利（CEPA）能在冬季有效地調(diào)控龍眼冬梢促進花芽分化，低濃度乙烯利在龍眼花序迅速分花期（2月下旬）使用能使多年不開花的成年樹開花結(jié)果[21]。熱帶生態(tài)型龍眼‘四季蜜’是一個易于調(diào)控成花的龍眼品種，噴施多效唑和乙烯利具有調(diào)控其成花的作用，且使用濃度范圍較廣，多種濃度組合以及不同施用次數(shù)都能促進開花[15]。本研究分析了‘四季蜜’龍眼不同組織中DlTRF2-like基因表達，結(jié)果顯示它在花芽中表達量最高，其次是葉柄、葉片。有研究發(fā)現(xiàn)MdFT基因在蘋果花、葉片和幼果中的表達均高于種子等其他組織[22]，桑樹MaFT基因在成熟葉的表達高于花、果實、嫩葉、腋芽頂芽等組織[23]。而FT基因在植物花形成過程中起關(guān)鍵作用[24]，故推測龍眼DlTRF2- like基因可能在‘四季蜜’龍眼花芽中發(fā)揮重要作用。根據(jù)定量結(jié)果，DlTRF2-like基因在噴施乙烯利和多效唑的表達量明顯高于在清水對照中的表達量，說明該基因可能參與乙烯利和多效唑促進龍眼成花調(diào)控，促進花芽分化。但該基因具體作用機制尚不明確，有待進一步研究證明。

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責(zé)任編輯：沈德發(fā)