橡膠樹sHSP基因家族的表達譜分析

紀向云 印漢 任小青 李德軍 夏志輝

摘 ?要：小熱激蛋白（small heat shock protein， sHSP）是一類脅迫誘導蛋白，不僅參與植物發(fā)育還響應生物與非生物脅迫。本研究通過分析轉錄組數(shù)據(jù)獲得橡膠樹12個sHSP基因家族成員。生物信息學分析和表達譜分析結果表明：蛋白保守結構預測顯示12個sHSP均具有α-晶體蛋白保守結構域;二級結構預測結果顯示，12個sHSP均由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和大量的隨機卷曲組成。通過RT-PCR技術分析，結果發(fā)現(xiàn)這12個sHSP家族基因在橡膠樹不同組織和葉片不同發(fā)育時期中表達有明顯差異，HbsHSP15.8、HbsHSP16.2、HbsHSP17.3、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.5、HbsHSP22.6和HbsHSP23.9在膠乳中高表達，HbsHSP17.4在樹皮中高表達，HbsHSP17.5a在樹莖中高表達，HbsHSP25.8則在樹葉中表達量最高。乙烯利處理后，12個sHSP家族基因的表達總體呈下降趨勢。在不同死皮等級橡膠樹中12個sHSP家族基因的表達也具有明顯差異，與健康樹相比，HbsHSP15.8、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5a、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP22.6、HbsHSP23.9和HbsHSP25.8在死皮樹中的表達量呈下降趨勢;HbsHSP16.2、HbsHSP17.3和HbsHSP22.5的表達量呈上升趨勢。因此推測橡膠樹sHSP家族基因可能參與橡膠樹生物與非生物逆境脅迫響應，以及可能在乙烯作用途徑中發(fā)揮作用。

關鍵詞：橡膠樹;小熱激蛋白;表達譜分析;脅迫響應

中圖分類號：Q813.3 ? ? ?文獻標識碼：A

Abstract： Small heat shock protein （sHSP） is a type of stress-inducing protein that not only participates in plant development but also responds to biotic and abiotic stresses. In this study， 12 sHSP gene family members of Hevea brasiliensis were obtained by analyzing transcriptome data. The results of bioinformatics analysis and expression profile analysis showed that all 12 sHSPs had α-crystallin conserved domains. The secondary structure prediction results showed that the 12 sHSPs were all composed of α-helix， β-turn， extended strand and a great quantity of random coils. RT-PCR analysis showed the expression of the 12 sHSP family genes in different tissues and developmental stages were significantly different， HbsHSP15.8， HbsHSP16.2， HbsHSP17.3， HbsHSP17.4， HbsHSP17.5b， HbsHSP18.2， HbsHSP18.3， HbsHSP22.5， HbsHSP22.6 and HbsHSP23.9 were highly expressed in latex， HbsHSP17.4 was highly expressed in bark， HbsHSP17.5a was highly expressed in tree stems， and HbsHSP25.8 was highly expressed in leaves. After ethephon treatment， the expression of the 12 sHSPs family genes showed an overall downward trend. The expression of the 12 sHSPs family genes in H. brasiliensis of different tapping panel dryness grades was also significantly different. The expression levels of HbsHSP15.8， HbsHSP17.4， HbsHSP17.5a， HbsHSP17.5b， HbsHSP18.2， HbsHSP18.3， HbsHSP22.6， HbsHSP23.9 and HbsHSP25.8 in diseased trees were significantly lower than that in healthy trees. The expression levels of HbsHSP16.2， HbsHSP17.3 and HbsHSP22.5 were significantly higher than that of healthy trees. It indicates that the sHSP family genes of H. brasiliensis may be involved in the response of rubber tree to biotic and abiotic stresses， and they may play an important role in ethylene pathway.

Keywords： Hevea brasiliensis; small heat shock protein; expression profiles analysis; stress response

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.12.007

熱激蛋白（heat shock protein， HSP）又稱熱休克蛋白，是指生物體遭受物理、化學和生物等脅迫刺激后，大量表達或者新合成的一類高度保守的蛋白質。HSP廣泛存在于各種生物體內，在結構上高度保守，根據(jù)分子量大小將HSP分為HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、sHSP家族[1]。小熱激蛋白（small heat shock protein， sHSP）是植物中含量最豐富的熱激蛋白，分子量約為12～ 42 kDa，多數(shù)為15～27 kDa。植物sHSP由核內多基因家族編碼，并且其sHSP的數(shù)量因植物種類而異。如擬南芥有19個sHSP[2]，水稻有23個sHSP[3]，楊樹有36個sHSP[4]，辣椒有35個sHSP[5]，番茄有42個sHSP[6]。

在正常生長情況下，植物組織中sHSP基因家族表達量非常低，而一旦熱激或其它逆境脅迫誘導刺激，sHSP基因家族的表達量迅速增加，同時生物體對逆境脅迫的耐受能力也會提高。水稻多重應激反應基因3（multiple stress-responsive gene 3， OsMSR3）是一個sHSP基因，其表達在提高擬南芥對金屬離子鎘脅迫的耐受性的同時也增加了抗氧化相關基因的表達[7];在擬南芥中過表達茶樹CsHSP17.2，可顯著提高轉基因擬南芥在熱激脅迫下的存活率[8];甘蔗sHSP通過硅脅迫可誘導甘蔗抗旱性提高[9]。sHSP家族能夠行使各種不同的功能，核心在于其具有分子伴侶活性。豌豆中線粒體sHSP22表現(xiàn)為一種保持酶，可與其他蛋白質共沉淀，以幫助緩解在熱脅迫適應過程中其他分子伴侶的分解和重折疊[10]。此外，sHSP具有調節(jié)植物發(fā)育的功能，如VvHSP20s參與了葡萄漿果的發(fā)育[11];而SlHSP17.7和糖可相互作用以調節(jié)番茄果實的發(fā)育，并影響番茄的品質[12]。因此，植物sHSP是一類具有多樣化功能的小分子蛋白。

巴西橡膠樹又名三葉橡膠，多年生常綠落葉大喬木，原產于拉丁美洲的亞馬遜流域。由于病害、臺風、干旱和低溫等逆境脅迫，使得橡膠樹干膠產量嚴重下降。因此，研究橡膠樹抗逆機制具有十分重要的意義。鑒于sHSP基因家族在植物抵抗逆境脅迫響應中的重要作用，及其在進化和功能上的高度保守，推測sHSP基因家族可能在橡膠樹抗逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。以往有關植物sHSP家族基因的研究主要集中在擬南芥、水稻、番茄和楊樹等植物中，關于多年生熱帶植物中的sHSP研究鮮有報道。目前，在橡膠樹中，sHSP基因家族成員是否響應生物或非生物脅迫還未見系統(tǒng)報道。本研究系統(tǒng)研究橡膠樹sHSP家族中12個sHSP基因家族成員的生物信息學和表達模式，為深入研究sHSP家族基因在橡膠樹抗逆鏡脅迫中的功能奠定基礎。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

巴西橡膠樹（Hevea brasiliensis）‘熱研7-33-97’品系幼樹購自于中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所，乙烯利處理參照Hao等[13]的方法，處理濃度為1%，以不做任何處理的幼樹為對照，采集處理后0、4、8、24、48、72 h樹皮;本研究中橡膠樹不同組織材料均取自‘熱研7-33-97’健康樹，以上樣品分別設置至少3個生物學重復。以‘熱研8-79’健康樹、2～3級和4～5級死皮樹為材料提取樹皮的RNA，由中國熱帶農業(yè)科學院橡膠研究所李德軍研究員贈予。RNA提取試劑盒購自百泰克;反轉錄試劑盒和熒光定量試劑盒均購自天根公司;所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;其余試劑藥品購于索萊寶公司;熒光定量PCR儀器為瑞士Roche公司的LightCycler? 96。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總RNA提取及cDNA第一鏈合成 ?按照通用植物總RNA提取試劑盒（RP3001）提取橡膠樹不同組織總RNA，對總RNA進行定量和電泳檢測，樣品cDNA第一鏈合成按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（KR118）說明書進行。

1.2.2 ?橡膠樹sHSP基因家族成員的命名與生物信息學分析 ?課題組前期獲得橡膠樹轉錄組數(shù)據(jù)[14]，通過分析獲得12個橡膠樹sHSP家族基因;通過ExPASy網(wǎng)站中的在線程序ProtParam分析蛋白質的基本性質;利用NCBI中Conserved Domain Database預測蛋白保守結構域;通過SOPMA在線工具預測蛋白的二級結構。

1.2.3 ?橡膠樹sHSP基因家族的表達譜分析 ?采用羅氏LightCycler? 96的RT-PCR系統(tǒng)對12個橡膠樹sHSP基因家族的表達模式進行分析。以分別稀釋10倍的各樣品cDNA為模板，Hbβ-actin為內參，使用各sHSP基因特異性引物進行RT-PCR分析。反應總體系為20 μL，其中包括4.0 μL mix，上下游熒光定量特異性引物（10 μmol/L）各0.6 μL，cDNA模板1.0 μL。PCR反應程序：95 ℃預變性15 min;95 ℃ 10 s，58 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，共40個循環(huán)。每個樣品重復3次，采用2–ΔΔCT法計算基因的相對表達量。使用SPSS 26.0軟件對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析，用Excel 2019軟件制圖。本研究所用的引物序列見表1。

2 ?結果與分析

2.1 ?sHSP基因家族的命名與生物信息學分析

通過ExPASy網(wǎng)站中的在線程序ProtParam分析12個橡膠樹sHSP蛋白質的基本性質，并根據(jù)各個sHSP的蛋白分子量將其標準化命名如表2所示。通過NCBI中Conserved Domain Database分析，12個橡膠樹sHSP成員均在蛋白序列C端含有α-晶體蛋白結構域（α-crystallin domain， ACD），且它們全部屬于α-晶體-熱激蛋白23類超基因家族特有結構域;SOPMA二級結構預測結果見表3，12個sHSP皆由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和大量的隨機卷曲組成。以上2個特征都是典型的sHSP蛋白結構特征，是sHSP蛋白行使其功能的重要結構特征。

2.2 ?sHSP基因家族在不同組織和葉片不同發(fā)育時期表達分析

通過RT-PCR分析12個sHSP家族基因的組織表達模式，sHSP家族基因的表達量在各組織中的表達水平存在明顯差異（P<0.05）。除了HbsHSP 22.6在膠乳中高表達，在樹皮中較低表達，而在其他組織中超低表達或幾乎不表達，其他sHSP成員沒有組織特異性，大部分sHSP成員在膠乳中表達量最高，如HbsHSP15.8、HbsHSP16.2、HbsHSP17.3、HbsHSP17.4、HbsHSP17.5b、HbsHSP 18.2、HbsHSP 8.3、HbsHSP22.5和HbsHSP23.9;而HbsHSP17.4則在樹皮中表達量最高;HbsHSP 17.5a則在樹莖中表達量最高;HbsHSP25.8則在樹葉中表達量最高（圖1）。12個sHSP家族基因在橡膠樹葉片的不同發(fā)育時期的表達模式結果見圖2，每個小熱激蛋白在橡膠樹葉片的每個發(fā)育時期（古銅期、淺綠期、成熟期、衰老期）均有表達，其中，HbsHSP15.8在成熟期中顯著高表達;HbsHSP16.2、HbsHSP 7.4和HbsHSP18.2在古銅期和淺綠期2個時期表達量最高;HbsHSP23.9和HbsHSP25.8在古銅期和衰老期表達量最高;HbsHSP17.3、HbsHSP17.5a、HbsHSP18.3和Hbs HSP22.6在橡膠樹葉片古銅期表達量最高，且HbsHSP17.3和HbsHSP22.6的基因表達模式類似，表達量在葉片發(fā)育中從古銅期至衰老期呈現(xiàn)緩慢下調的趨勢，而HbsHSP17.5a和HbsHSP18.3則呈現(xiàn)顯著的下降-上升-下降的趨勢;HbsHSP17.5a和HbsHSP22.6基因在橡膠樹葉片不同發(fā)育時期的表達量無明顯變化。

2.3 ?sHSP家族基因在不同死皮等級橡膠樹中的差異表達

為了明確橡膠樹12個sHSP家族基因在不同死皮等級橡膠樹中的表達譜。本研究利用RT-PCR系統(tǒng)分析12個sHSP家族基因在健康、輕度死皮和重度死皮橡膠樹樹皮中的表達水平。統(tǒng)計分析結果表明，在橡膠樹品種‘熱研8-79’中，HbsHSP 15.8、HbsHSP 17.4、HbsHSP17.5a、HbsHSP17.5b、Hbs SP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP23.9和HbsHSP 25.8在死皮樹中的表達量與健康樹相比明顯降低，且隨著橡膠樹死皮病嚴重程度的增加呈現(xiàn)顯著下降趨勢;HbsHSP22.6基因在患輕度死皮病樹皮中的表達量與健康樹無明顯差異，而在重度死皮樹中嚴重下降;相反，HbsHSP16.2、HbsHSP17.3和Hbs HSP22.5基因在罹病樹中的表達水平與健康樹相比均有不同程度的上調，其中HbsHSP16.2只有在重度患病樹中顯著上調，HbsHSP17.3的表達模式則隨死皮病嚴重程度的增加呈現(xiàn)顯著上調的趨勢，而HbsHSP22.5雖然在患病樹中大量積累，卻與死皮病的嚴重程度無明顯相關（圖3）。橡膠樹死皮病是一種十分復雜的生物學過程，可能由多個途徑參與調控，綜上所述，推測橡膠樹sHSP家族基因可能以正調控或負調控的方式參與橡膠樹多種逆境脅迫或病害等，并在其中發(fā)揮重要作用。

2.4 ?乙烯處理對橡膠樹sHSP基因家族表達的影響

通過RT-PCR分析sHSP基因家族在乙烯處理橡膠樹中的表達模式，結果見圖4。HbsHSP15.8的表達量在1%乙烯處理4 h后明顯下降，8 h時上升，24 h時再下降，48 h到72 h逐步上升到原來的水平;HbsHSP16.2在乙烯處理后表達量顯著下降，直到48 h開始有緩慢上升的趨勢;HbsHSP17.3則在乙烯處理后，表達量在4 h和8 h顯著上升，然后在24 h顯著下調，到72 h時略有上升;Hbs HSP17.4與HbsHSP17.3總體上相似，不同的是HbsHSP17.4是在8 h時才開始顯著上升;而HbsHSP17.5a、HbsHSP17.5b、HbsHSP22.5的表達模式大致為上升-下降-上升趨勢;而HbsHSP 18.2和HbsHSP23.9從4 h開始顯著下調，HbsHSP 18.2在72 h時有上調，HbsHSP23.9則從48 h開始略有上調;HbsHSP22.6在乙烯處理后，顯著下降，隨著處理時間的推移，未有明顯上升趨勢，推測HbsHSP22.6可能受逆境脅迫影響最嚴重，使得其表達量急劇下降。HbsHSP18.3和HbsHSP 25.8呈下降-上升-下降趨勢，區(qū)別是HbsHSP18.3在8 h時表達量不僅顯著上升，并且超過了對照。上述結果表明，橡膠樹sHSP基因家族的12個成員均可能參與乙烯相關信號轉導。

3 ?討論

不同植物的同種sHSP在氨基酸組成上具有高度同源性，所有sHSP的C端都有一個保守的ACD結構域。不同的sHSP分子在結構上呈現(xiàn)復雜的多元化，其編碼的蛋白主要由3部分組成，包括不同物種間不相同的N端臂、高度保守的ACD結構域和相似的C端延伸結構，同一物種間具有相對保守性。本研究檢測了橡膠樹sHSP基因家族中12個sHSP基因成員的表達模式，結果發(fā)現(xiàn)在12個sHSP蛋白中均預測到ACD結構存在。二級結構分析顯示，12個sHSP蛋白二級結構均具有sHSP蛋白的典型特征，由α-螺旋、β-轉角、延伸鏈和大量的隨機卷曲組成。ACD保守區(qū)域和二級結構的分布與含量特征對sHSP蛋白行使功能至關重要，推測橡膠樹的這12個sHSP蛋白具有小熱激蛋白分子伴侶活性，可能參與逆境脅迫。

已有研究結果表明，除熱激外，sHSP基因家族也在胚胎發(fā)生、種子成熟和萌發(fā)、花粉發(fā)育及果實成熟等植物生長發(fā)育的特定時期表達[15]。對高粱sHsp基因家族中的15個SbsHSP家族基因表達譜分析發(fā)現(xiàn)，SbsHsp家族基因在根和葉中大量積累[16];在豌豆中，線粒體sHSP2基因在葉子中受熱激或氧化脅迫誘導，但在種子發(fā)育過程中也強烈積累[10];葉綠體sHSP21蛋白通過和質體類核蛋白pTAC5（plastid transcriptionally active 5）相互作用，構成一個蛋白復合體，是葉綠體發(fā)育所必需的[17]。與上述研究結果一致，橡膠樹sHSP家族中的12個sHSP成員在橡膠樹不同組織和葉片發(fā)育時期表達存在差異。大多數(shù)橡膠樹sHSP基因家族成員如Hbs SP15.8、HbsHSP16.2、HbsHSP 17.3、HbsHSP 7.4、HbsHSP17.5b、HbsHSP18.2、HbsHSP18.3、HbsHSP 2.5、HbsHSP22.6和HbsHSP 23.9在膠乳中的表達量明顯高于其他組織，暗示其在膠乳中具有重要功能。

由于sHSP合成與脅迫響應相關，人們普遍認為sHSP的作用在于保護逆境中的細胞，減輕逆境脅迫對植物體的損害。在熱脅迫下，耐熱品系辣椒比熱敏品系辣椒具有更高的CaHSP16.4表達水平。在耐熱品系中沉默的CaHSP16.4會導致丙二醛含量的顯著增加和總葉綠素含量的顯著降低，而將其轉入擬南芥后，CaHSP16.4過表達系的存活率明顯高于野生型，電導滲漏率明顯降低，說明CaHSP16.4可幫助植物增強熱脅迫的耐受性[18];而Hsp17.6CⅡ的過表達賦予了擬南芥過氧化氫酶活性和對非生物脅迫的耐受性[19];前人研究表明，小麥TaHSP20基因家族在小麥脅迫調控應答中的重要性，并提出sHSP可提高小麥耐熱性的育種目標[20]。與上述報道結果一致，本研究結果表明，橡膠樹sHSP基因家族表達受乙烯和死皮病害的脅迫調控，推測sHSP基因家族參與橡膠逆境脅迫反應并在其中發(fā)揮重要作用。我國屬非傳統(tǒng)植膠區(qū)，橡膠樹生長周期內不可避免地受到臺風、低溫和季節(jié)性干旱等逆境條件影響。在此之前，研究者就關注到sHSP基因在橡膠樹抗逆鏡過程中扮演的重要角色，先后研究了HbsHSP14和HbsHSP17[21]，以及HbsHSP23.8[22]，以上2個研究都較全面的分析了橡膠樹在不同脅迫逆境下HbsHSP14、HbsHSP17和HbsHSP23.8基因的表達模式，其結果也表明HbsHSP14、HbsHSP17和HbsHSP23.8基因的表達受到高鹽、干旱、低溫、乙烯和茉莉酸處理調控，揭示了HbsHSP14、HbsHSP17和HbsHSP23.8在橡膠樹逆境脅迫應答、乙烯和茉莉酸信號途徑中可能發(fā)揮作用。乙烯是在橡膠樹中研究較為深入且應用較廣的激素，實踐證明乙烯可作為橡膠樹增產刺激劑，通過延長排膠時間提高橡膠產量。鑒于sHSP基因在進化和功能上的保守性，以及橡膠樹sHSP基因家族在逆境處理的表達模式的相對一致性，進一步揭示了sHSP在抵御橡膠樹逆境脅迫中的重要作用。

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責任編輯：黃東杰