VEGF-C與Gas6在膽管癌中的表達(dá)及臨床意義

朱宇 吳涯昆 龔程 龐武 田銀生

膽管癌屬于臨床常見惡性腫瘤，因解剖組織結(jié)構(gòu)關(guān)系復(fù)雜、缺乏特異性腫瘤標(biāo)志物導(dǎo)致早期診斷困難，隨著病情進(jìn)展，易發(fā)生縱向跳躍式轉(zhuǎn)移與橫向浸潤轉(zhuǎn)移，對(duì)預(yù)后產(chǎn)生嚴(yán)重不利影響［1-2］。因此，探索影響膽管癌腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的病理因子意義重大。血管內(nèi)皮生長因子C（Vascular endothelial growth factor C，C）是一種血管生長因子，參與血管生成過程，能加快細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移，促使病情惡化［3］。生長停滯特異性基因6（Growth arrest specific gene 6，Gas6）是生長停滯特異性基因家族重要成員，也是維生素K 依賴性生長促進(jìn)因子，能結(jié)合相應(yīng)配體，通過特定信號(hào)通路參與腫瘤血管生成、分化、轉(zhuǎn)移、凋亡等過程［4］。既往雖有研究分析兩者在膽管癌中的相關(guān)機(jī)制，但關(guān)于兩者之間關(guān)系及對(duì)生存狀況的影響尚未見報(bào)道。為此，本研究嘗試分析VEGF-C 與Gas6 在膽管癌中的表達(dá)及臨床意義，旨在為臨床提供數(shù)據(jù)支持。報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年5月至2019年8月122 例膽管癌患者作為研究對(duì)象，其中男82 例，女40 例，平均（57.74±6.21）歲，腫瘤直徑2.0～5.0 cm，平均（3.72±0.36）cm，腫瘤部位：中下段膽管50 例，肝門及肝內(nèi)膽管72 例，臨床分期：Ⅰ期15 例，Ⅱ期36例，Ⅲ期40 例，Ⅳ期31 例，動(dòng)靜脈受侵39 例，未受侵83 例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移78 例，未轉(zhuǎn)移44 例。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批通過。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①均經(jīng)手術(shù)病理檢查證實(shí)為膽管癌；②臨床分期Ⅰ～Ⅳ期；③術(shù)前均未接受放化療等相關(guān)抗腫瘤治療；④臨床資料完整；⑤患者及家屬均知情本研究，簽訂知情承諾書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他腫瘤者；②伴有感染性、炎癥性疾病者；③血液系統(tǒng)異常者；④屬于復(fù)治或腫瘤復(fù)發(fā)患者；⑤術(shù)前接受抗腫瘤治療者。

1.2 方法

1.2.1 VEGF-C、Gas6 檢測(cè)方法

采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)癌組織、癌旁正常組織（距癌組織切緣0.5 cm 左右，經(jīng)病理檢查證實(shí)為非癌組織）中VEGF-C、Gas6 表達(dá)情況，將石蠟包埋組織采用組織切片機(jī)連續(xù)切開（厚度為4 μm），對(duì)石蠟切片行脫臘、水化處理，高溫修復(fù)5 min，過氧化氫溶液（3%）室溫孵育，共10 min；PBS 沖洗5 min，滴加山羊血清，室溫放置30 min，滴加兔抗人VEGF-C、Gas6 多抗，濕盒內(nèi)4℃過夜。PBS 沖洗，滴加二抗，于常溫條件下反應(yīng)15 min，DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，封固。采用PBS 替代一抗作為陰性對(duì)照組，已知陽性片作為陽性對(duì)照。

1.2.2 VEGF-C、Gas6 結(jié)果判讀

Gas6 在胞漿及胞核中可見棕黃色顆粒為陽性，VEGF-C 在胞漿中可見棕黃色顆粒為陽性。由2 名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師共同閱片。采用半定量積分判定閱片結(jié)果。采用H-Score 評(píng)分系統(tǒng)判定結(jié)果，陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)與染色強(qiáng)度2 項(xiàng)積分相乘，＜4分判定為陰性，≥4 分為陽性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，用χ2檢驗(yàn)，Kaplan-Meier 曲線進(jìn)行生存分析，采用Log-rank 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清VEGF-C、Gas6 陽性表達(dá)率比較

癌組織中VEGF-C、Gas6 陽性表達(dá)率高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。VEGF-C、Gas6 免疫組化。見圖1。

表1 兩組血清VEGF-C、Gas6 陽性表達(dá)率比較［n（%）］Table 1 Comparison of Positive expression rates of VEGF-C and Gas6 of 2 groups［n（%）］

2.2 VEGF-C 與膽管癌臨床特征相關(guān)性

VEGF-C 與動(dòng)靜脈受侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、Gas6 呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

圖1 VEGF-C、Gas6 免疫組化圖Figure 1 immunohistochemistry of VEGF-C

2.3 Gas6 與膽管癌臨床特征相關(guān)性

Gas6 與動(dòng)靜脈受侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、VEGF-C 呈正相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

2.4 多元線性逐步回歸分析

將年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)、病理類型等因素控制后，VEGF-C、Gas6 仍與動(dòng)靜脈受侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

2.5 膽管癌患者1年生存率

隨訪1年，失訪8 例。114 例膽管癌患者1年生存率為65.79%（75/114）。

2.6 生存分析

Kaplan-Meier 曲線分析，VEGF-C、Gas6 陽性表達(dá)患者1年生存率低于陰性表達(dá)患者（χ2=3.933、6.341，P=0.012、0.041），見圖4。

表3 Gas6 與膽管癌臨床特征相關(guān)性［n（%）］Table 3 Correlation between Gas6 and clinical features of cholangiocarcinoma［n（%）］

表4 多元線性逐步回歸分析Table 4 Multiple linear stepwise regression analysis

圖4 生存曲線Figure 4 Survival curve

3 討論

膽管癌是發(fā)生于肝外膽道至肝門區(qū)、膽管下端的惡性腫瘤，相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，其多見于50～70 歲群體，男性多于女性，發(fā)病呈現(xiàn)逐漸升高趨勢(shì)，占肝內(nèi)外膽道中的60%左右，且5年生存率較低，防治形勢(shì)較為嚴(yán)峻［5-6］。故臨床需通過探索相關(guān)因子改變?yōu)閷ふ倚滦椭委熗緩教峁┮罁?jù)，以強(qiáng)化療效，延長生存期。

VEGF-C 是血管內(nèi)皮生長因子之一，在多種惡性腫瘤血管形成中發(fā)揮重要作用，與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切［7］。馮瑤瑤等［8］報(bào)道顯示，VEGF-C 通過結(jié)合特異性受體誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞及血管生成參與宮頸癌侵襲轉(zhuǎn)移過程。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，VEGF-C 在膽管癌中呈高表達(dá)狀態(tài)，對(duì)腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生重要影響，與戚誠等［9］研究結(jié)果相符。分析原因，VEGF-C 可結(jié)合并激活血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）-3，經(jīng)由磷脂酰肌醇3 激酶（P13K）/蛋白激酶B（Akt）、絲裂原細(xì)胞外激酶（MEK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）等信號(hào)通路途徑，刺激、加快淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂及增生，從而引發(fā)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移［10］。且VEGF-C 促進(jìn)腫瘤新生血管形成過程中，隨著腫瘤細(xì)胞不斷增殖，侵襲周圍動(dòng)靜脈?？梢娤抡{(diào)VEGF-C 表達(dá)可能是控制膽管癌腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的重要環(huán)節(jié)。

Gas6 屬于多功能域構(gòu)架蛋白，在人體多種組織器官中廣泛表達(dá)，相關(guān)研究指出，Gas6 可通過結(jié)合TAM 家族成員Axl，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附、增殖、凋亡等多種功能［11］。既往有文獻(xiàn)顯示，Gas6 在卵巢癌、肺腺癌、口腔鱗癌等惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)趨勢(shì)［12］。王子偉等［13］觀點(diǎn)認(rèn)為，Gas6 可作為反映膽管癌惡性程度的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果證實(shí)，Gas6 在膽管癌中不僅呈高表達(dá)狀態(tài)，還與病理改變關(guān)系密切。主要是由于Gas6 可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子1（STAT1）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、P13K/Akt 等多種信號(hào)途徑，影響腫瘤細(xì)胞血管形成、增殖、遷移及凋亡［14］。同時(shí)，Gas6 表達(dá)水平越高，腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移可能性越大，不斷促進(jìn)疾病惡化，從而提高預(yù)后不良風(fēng)險(xiǎn)，縮短生存期。故Gas6 有望成為腫瘤標(biāo)志物，為臨床診治膽管癌提供新方向。

綜上可知，VEGF-C 與Gas6 在膽管癌組織中表達(dá)密切相關(guān)，均與動(dòng)靜脈受侵、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期顯著相關(guān)，聯(lián)合檢測(cè)有助于為臨床評(píng)估病情、預(yù)測(cè)生存狀況提供參考依據(jù)。但本研究受樣本量及檢測(cè)方法的限制，仍需進(jìn)一步明確VEGF-C與Gas6 在膽管癌中的協(xié)同作用機(jī)制。