動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血患者外周血miR-210與TLR4表達(dá)的相關(guān)性及臨床意義

陳明 張清秀 魏秀娥★

動(dòng)脈瘤性蛛網(wǎng)膜下腔出血（aneurysmal subarachnoid hemorrhage，aSAH）是臨床常見的腦血管意外，致殘率高、危害大。腦血管痙攣（cerebral vasospasm，CVS）是aSAH 常見的并發(fā)癥，表現(xiàn)為顱內(nèi)動(dòng)脈收縮并造成腦組織缺血，是造成aSAH 遲發(fā)性神經(jīng)功能損害及預(yù)后不良的主要原因。炎癥反應(yīng)是目前已知與aSAH 及CVS 發(fā)病機(jī)密切相關(guān)的環(huán)節(jié)，有基礎(chǔ)研究報(bào)道，抑制炎癥反應(yīng)能夠改善SAH 大鼠的CVS［1］；臨床研究報(bào)道，全身炎癥反應(yīng)指數(shù)對(duì)aSAH 患者發(fā)生CVS 具有預(yù)測價(jià)值［2-3］。但是，aSAH 及CVS 發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制尚不十分清楚。微小RNA（microRNA，miR）是一族在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)的非編碼RNA，具有廣泛的生物學(xué)作用，在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮保護(hù)或損傷作用。miR-210 是一種具有神經(jīng)保護(hù)作用的miR，王立新的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-210 能夠改善SAH 大鼠的CVS，同時(shí)抑制Toll 樣受體4（Toll like receptor 4，TLR4）的表達(dá)并減少多種炎癥細(xì)胞因子的釋放［4］。但miR-210/TLR4 周在SAH 及CVS 發(fā)病中的變化并未見報(bào)道。將檢測了外周血中miR-210 及TLR4 的表達(dá)水平并分析其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選擇2015年6月至2019年6月期間本院收治的55 例aSAH 患者作為研究組，其中男性31 例、女性24 例，年齡（51.92±10.77）歲；另取同期體檢的70 例健康志愿者作為對(duì)照組，其中男性39 例、女性31 例，年齡（48.12±12.24）歲。所有患者及家屬均已知情并同意。兩組間一般資料的比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①發(fā)病后24 h 內(nèi)入院；②符合aSAH的診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；③發(fā)病后3d 內(nèi)進(jìn)行早期手術(shù)；④留取外周血用于miR-210 及TLR4 的檢測；⑤臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①既往有腦梗死、腦出血、腦外傷病史；②合并其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病或精神性疾?。虎坌g(shù)前存在CVS；④住院期間死亡。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 外周血miR-210 及TLR4 表達(dá)的檢測

取aSAH 患者入院當(dāng)天的外周血樣本及對(duì)照組志愿者體檢當(dāng)天的外周血樣本，采用北京天根公司的試劑盒進(jìn)行miR-497 表達(dá)的檢測。首先采用全血RNA 提取試劑盒提取RNA。用miR 熒光定量PCR 檢測試劑盒檢測miR-210 的表達(dá)水平；采用熒光定量PCR 檢測試劑盒檢測TLR4 的表達(dá)水平。

1.3 血清炎癥細(xì)胞因子含量的檢測

取aSAH 患者入院當(dāng)天的血清樣本及對(duì)照組志愿者體檢當(dāng)天的血清樣本，采用酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒（上海酶聯(lián)公司）檢測白介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP9）的含量。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4 aSAH 患者CVS 及預(yù)后的評(píng)估

參照指南［5］進(jìn)行CVS 及預(yù)后評(píng)估。aSAH 患者術(shù)后第7 天時(shí)或出現(xiàn)新發(fā)局灶性神經(jīng)功能缺損癥狀時(shí)，進(jìn)行經(jīng)顱多普勒超聲檢查，大腦中動(dòng)脈血流速度≥120 cm/s 認(rèn)為發(fā)生CVS。術(shù)后6 個(gè)月時(shí)采用改了Rankin 量表（mRS）評(píng)估神經(jīng)功能，mRS 評(píng)分0～2 分為預(yù)后良好、3～6 分為預(yù)后不良。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性采用Pearson 檢驗(yàn)分析，采用ROC 曲線分析miR-210 及TLR4 預(yù)測預(yù)后及CVS 的價(jià)值。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組外周血miR-210 及TLR4 表達(dá)的比較

aSAH 組患者外周血中miR-210 的表達(dá)水平低于對(duì)照組，TLR4 的表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組外周血miR-210 及TLR4 表達(dá)的比較（±s）Table 1 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between 2 groups（±s）

表1 兩組外周血miR-210 及TLR4 表達(dá)的比較（±s）Table 1 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between 2 groups（±s）

組別aSAH 組對(duì)照組t 值P 值n 55 70 miR-210 0.79±0.25 1.00±0.28 4.361 0.000 TLR4 1.33±0.38 1.00±0.25 5.837 0.000

2.2 aSAH 組患者外周血miR-210 與TLR4 的相關(guān)性

aSAH 組患者外周血miR-210 的表達(dá)水平與TLR4 的表達(dá)水平具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（r=-0.469，P＜0.05）。見圖1。

圖1 aSAH 組患者外周血miR-210 與TLR4 的相關(guān)性Figure 1 Correlation between miR-210 and TLR4 in aSAH group

2.3 兩組血清炎癥因子含量的比較

aSAH 組患者血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組血清IL-6、TNF-α、MMP9 含量的比較（±s）Table 2 Comparison of serum IL-6，TNF-α and MMP9 between two groups（±s）

表2 兩組血清IL-6、TNF-α、MMP9 含量的比較（±s）Table 2 Comparison of serum IL-6，TNF-α and MMP9 between two groups（±s）

組別aSAH 組對(duì)照組t 值P 值n 55 70 IL-6（pg/mL）47.69±12.59 36.51±9.24 5.724 0.000 TNF-α（ng/mL）8.39±1.94 6.44±1.52 6.303 0.000 MMP9（ng/mL）18.82±3.65 13.04±2.26 10.867 0.000

2.4 aSAH 組患者外周血miR-210、TLR4 與血清炎癥因子的相關(guān)性

aSAH 組患者外周血miR-210 的表達(dá)水平與血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量具有負(fù)相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），外周血TLR4 的表達(dá)水平與血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量正相關(guān)關(guān)系，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 aSAH 組患者外周血miR-210、TLR4 與血清炎癥因子的相關(guān)性Table 3 Correlation between miR-210，TLR4 and serum inflammatory factors in aSAH group

2.5 aSAH 組中CVS 與非CVS 患者外周血miR-210 及TLR4 表達(dá)的比較

aSAH 組中CVS 患者外周血中miR-210 的表達(dá)水平低于非CVS 患者，TLR4 的表達(dá)水平高于非CVS 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 aSAH 組中CVS 與非CVS 患者外周血miR-210及TLR4 表達(dá)的比較Table 4 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between CVS and non CVS patients in aSAH group

2.6 外周血miR-210、TLR4 預(yù)測aSAH 患者CVS的ROC 曲線分析

外周血miR-210、TLR4 預(yù)測aSAH 患者CVS的ROC 曲線下面積分別為0.723（95%CI：0.564～0.992、P=0.008）、0.722（95%CI：0.569～0.874、P=0.008），根據(jù)約登指數(shù)最大確定最佳截?cái)嘀捣謩e為0.74、1.26。見圖2。

圖2 miR-210、TLR4 預(yù)測aSAH 患者CVS 的ROC 曲線Figure 2 ROC curve of miR-210、TLR4 predicting CVS in aSAH patients

2.7 aSAH 組中預(yù)后良好與預(yù)后不良患者外周血miR-210 及TLR4 表達(dá)的比較

aSAH 組中預(yù)后不良患者外周血中miR-210的表達(dá)水平低于預(yù)后良好患者，TLR4 的表達(dá)水平高于預(yù)后良好患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 aSAH 組中預(yù)后良好與預(yù)后不良患者外周血miR-210 及TLR4 表達(dá)的比較（±s）Table 5 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between patients with good prognosis and poor prognosis in aSAH group（±s）

表5 aSAH 組中預(yù)后良好與預(yù)后不良患者外周血miR-210 及TLR4 表達(dá)的比較（±s）Table 5 Comparison of miR-210 and TLR4 expression in peripheral blood between patients with good prognosis and poor prognosis in aSAH group（±s）

CVS 情況CVS 患者非CVS 患者t 值P 值n 20 35 miR-210 0.64±0.27 0.87±0.20 3.605 0.001 TLR4 1.58±0.37 1.19±0.30 4.257 0.000

2.8 外周血miR-210、TLR4 預(yù)測aSAH 患者預(yù)后的ROC 曲線分析

外周血miR-210、TLR4 預(yù)測aSAH 患者預(yù)后的ROC 曲線下面積分別為0.741（95%CI：0.588～0.894、P=0.003）、0.789（95%CI：0.659～0.918、P=0.001），根據(jù)約登指數(shù)最大確定最佳截?cái)嘀捣謩e為0.77、1.26。見圖3。

圖3 miR-210、TLR4 預(yù)測aSAH 患者預(yù)后的ROC 曲線Figure 4 ROC curve of miR-210、TLR4 predicting prognosis of patients with aSAH

3 討論

aSAH 的致殘率高，CVS 是造成aSAH 患者神經(jīng)功能損害并致殘的常見并發(fā)癥。CVS 的臨床表現(xiàn)是顱內(nèi)動(dòng)脈收縮造成受累腦組織供血減少、出現(xiàn)缺血缺氧性神經(jīng)功能損害，進(jìn)而影響aSAH 的預(yù)后［6-7］。因此，早期評(píng)估aSAH 病情、預(yù)測可能發(fā)生CVS 的高危人群并盡早進(jìn)行干預(yù)，有助于預(yù)防CVS、改善預(yù)后。但目前aSAH 及CVS 的發(fā)病機(jī)制尚不十分清楚，闡明相關(guān)發(fā)病機(jī)制不僅能夠?yàn)閷ふ倚碌牟∏樵u(píng)估標(biāo)志物提供參考，還能為發(fā)現(xiàn)新的治療手段提供靶點(diǎn)。

炎癥反應(yīng)在aSAH 及CVS 發(fā)病中的作用受到越來越多關(guān)注，炎癥反應(yīng)的激活一方面加重腦水腫、促進(jìn)神經(jīng)元氧化應(yīng)激及凋亡并造成神經(jīng)功能損害，另一方面誘導(dǎo)腦血管發(fā)生痙攣并加重神經(jīng)功能損害［8-9］。TLR4 通路是體內(nèi)參與炎癥反應(yīng)調(diào)控的重要信號(hào)通路，多項(xiàng)基礎(chǔ)研究證實(shí)TLR4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與aSAH 神經(jīng)功能損害、CVS 發(fā)生均密切相關(guān)［10-11］。miR-210 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮保護(hù)作用［12-13］。國內(nèi)一項(xiàng)基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-210 用于SAH 大鼠的治療能夠減輕神經(jīng)損害、改善CVS 并抑制TLR4 的表達(dá)［4］，表明miR-210 靶向TLR4 可能參與aSAH 及CVS 的發(fā)病。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：aSAH 患者外周血中miR-210 的表達(dá)水平降低、TLR4 的表達(dá)增加且具有負(fù)相關(guān)關(guān)系，miR-210 低表達(dá)可能削弱其抑制TLR4表達(dá)的作用并造成TLR4 表達(dá)增加，進(jìn)而參與aSAH 的發(fā)病。

TLR4 是調(diào)控炎癥反應(yīng)的重要信號(hào)通路，發(fā)生激活后通過NF-κB 途徑啟動(dòng)下游IL-6、TNF-α、MMP9 等炎癥基因的表達(dá)，引起IL-6、TNF-α、MMP9 大量釋放［14］。已有研究報(bào)道［15-16］，aSAH 患者血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量異常增加，本研究的分析結(jié)果與其一致，及aSAH 患者血清中IL-6、TNF-α、MMP9 的含量高于對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明miR-210/TLR4 軸參與aSAH 發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)的調(diào)控，miR-210 靶向TLR4 并抑制炎癥反應(yīng)。

國內(nèi)多項(xiàng)炎癥反應(yīng)與aSAH 及CVS 相關(guān)的臨床研究證實(shí)，炎癥反應(yīng)指數(shù)對(duì)aSAH 的預(yù)后及CVS 均具有預(yù)測價(jià)值［1，17］；王立新的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)則證 實(shí)了miR-210 對(duì)SAH 大鼠TLR4 表達(dá)及CVS 的抑制作用。本研究已經(jīng)證實(shí)aSAH 患者miR-210/TLR4 軸發(fā)生改變且與炎癥反應(yīng)的激活存在相關(guān)性，為了進(jìn)一步闡明miR-210/TLR4 軸在aSAH 發(fā)病中的作用，本研究對(duì)aSAH 患者CVS 及預(yù)后進(jìn)行了評(píng)估，55 例aSAH 患者中發(fā)生CVS 18 例、預(yù)后不良20 例，CVS 發(fā)生率和預(yù)后不良發(fā)生率分別為32.73%、36.36%，相應(yīng)的發(fā)生率與國內(nèi)已有研究相似。在此基礎(chǔ)上分析miR-210、TLR4 表達(dá)與CVS、預(yù)后的關(guān)系可知：發(fā)生CVS 及預(yù)后不良患者外周血中miR-210 的表達(dá)降低、TLR4 的表達(dá)增加，經(jīng)ROC 曲線分析證實(shí)miR-210、TLR4 對(duì)CVS 和預(yù)后具有預(yù)測價(jià)值。

綜上所述，aSAH 發(fā)病過程中miR-210 表達(dá)降低、TLR4 表達(dá)增加與炎癥反應(yīng)的激活、CVS 及預(yù)后不良的發(fā)生有關(guān)，miR-210/TLR4 可能在aSAH發(fā)病中起重要作用，未來miR-210、TLR4 有望成為評(píng)估aSAH 病情及預(yù)后的標(biāo)志物，過表達(dá)miR-210并抑制TLR4 介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)則有望成為治療aSAH、改善預(yù)后的新靶點(diǎn)。