呼出氣冷凝液、血清和組織中miRNA34a檢測對非小細(xì)胞肺癌患者的價值探討

陶國華 孫蘋蘋 陳金亮 陳建榮★

肺癌是人類危害最大的惡性腫瘤，其發(fā)病率和死亡率在世界上高居榜首。2019年國家癌癥中心報告：2015年數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果肺癌位居我國惡性腫瘤發(fā)病首位，占城市和農(nóng)村惡性腫瘤死亡第一位［1］。肺癌根據(jù)病理類型可分為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）和小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）兩大類，肺癌中80%～85%是非小細(xì)胞肺癌［2-3］。微小核糖核酸（MicroRNA，miRNA）是一類非編碼小分子RNA，miRNA 作為一類重要的參與基因表達(dá)調(diào)控的分子，代表了一種新的基因表達(dá)調(diào)控模式，它在細(xì)胞中調(diào)節(jié)約30%的蛋白編碼基因，在致病過程中起著重要作用［4］。迄今為止，活檢是肺癌患者診斷參考標(biāo)準(zhǔn)。不幸的是組織活檢是一個有限制的過程，如難以進(jìn)入不同的腫瘤部位，具有侵襲性和患者依從性低等缺陷［5］。呼出氣冷凝液（exhaled breath condensates，EBC）是一種檢測呼吸道生化成分的新技術(shù)。EBC 來自幾乎所有的呼吸細(xì)胞類型，包括結(jié)構(gòu)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。EBC 作為呼吸道氣道內(nèi)襯液體含有多種生物分子，如DNA，RNA，蛋白質(zhì)，代謝物和揮發(fā)性化合物。它作為一種新的非侵入性采集的樣品，正逐漸受重視。目前為止，對于腫瘤組織和血液中miRNAs 的研究報道較多，而EBC 中的相關(guān)研究較少。本研究將探討NSCLC 患者EBC中miRNA34a 的相對表達(dá)水平和血清中CEA、CYFRA21-1 的含量，其表達(dá)量與臨床的相關(guān)性，并評價其在NSCLC 中的應(yīng)用價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年6月至2017年12月在本院呼吸科和胸外科接受治療并經(jīng)病理證實(shí)為非小細(xì)胞肺癌的50 例患者為研究對象，男性27 例，女性23例，年齡42～83 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均符合《原發(fā)性肺癌診療規(guī)范（2018年版）》NSCLC 診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］；②所有患者手術(shù)前均未進(jìn)行過放療、化療、免疫治療及靶向治療③所有患者知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在手術(shù)禁忌癥者；②除NSCLC 外存在其他惡性腫瘤者；③存在原發(fā)性肝腎、功能障礙者；④臨床病例資料不完整或缺乏準(zhǔn)確性者。對照組為到本院體檢的健康人群50 例，其中男性28 例，女性22 例，年齡34～78歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：①無家族腫瘤史；②無腦心肝腎和消化系統(tǒng)等重要臟器疾病。③體檢者知情同意本研究并簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在肺部結(jié)節(jié)者；②有高血壓、糖尿病史者。肺癌組和對照組在年齡、性別及吸煙史方面比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 兩組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data between 2 groups（±s）

表1 兩組一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general data between 2 groups（±s）

資料年齡（歲）性別（男/女）吸煙史(有/無)NSCLC 組（n=50）63.46±10.96 27/23 18/32對照組（n=50）62.36±7.57 28/22 15/35 t/χ2值0.584 0.199 1.489 P 值0.551 0.837 0.236

1.2 主要儀器和試劑

采用miRNA 提取分離試劑盒（批號：R6529）、增強(qiáng)型miRNA cDNA 第一鏈合成試劑盒（批號：R6519）、增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（批號R6510），試劑均購于北京天根生化科技有限公司。使用的主要儀器有熒光定量PCR 儀（ABI，StepOne Plus）、微量分光光度計OneDrop 1000+（松下電器中國有限公司上海分公司）、EcoScreen 冷凝器和Master Screen 簡易冷凝器（德國EricJaeger Company）。德國羅氏602全自動化學(xué)發(fā)光分析儀。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集

使用真空管采集各研究對象靜脈全血5 mL，1 000×g 離心10 min，分離血清樣本（≥500 μL），使用無核酸酶（RNase）離心管進(jìn)行分離，置于-70℃保存?zhèn)溆?。NSCLC 患者在入院的第一天行外周血標(biāo)本采集。對照組則在體檢期間進(jìn)行外周血標(biāo)本采集。抽取患者和健康人群術(shù)前靜脈血5 mL 于促凝管內(nèi)，1 000 ×g 離心5 min 后取上清放入無RNase 離心管，保存于-70℃冰箱備用。用EcoScreen 冷凝器或者M(jìn)aster Screen 簡易冷凝器預(yù)冷15 min，囑受試者漱口、戴鼻夾，經(jīng)咬嘴平靜呼吸20 min 后取出收集管，待標(biāo)本融化后可得到2～4 mL 液體即EBC，隨即放入無RNase 的離心管中，保存于-70℃冰箱備用。

1.3.2 總RNA 的提取

采用北京天根生化科技有限公司生產(chǎn)的組織、血液miRNA 提取分離試劑盒對組織、血液和EBC 樣本進(jìn)行RNA 的提取。

1.3.3 RNA 含量和純度測定

按照微量分光光度計OneDrop 1000+操作手冊，對提取的miRNAs 進(jìn)行濃度及純度進(jìn)行測定。RNA 樣品濃度采用郎伯比爾定律進(jìn)行計算，采用OD260/OD280比值評價RNA 樣品純度。

1.3.4 參照基因的選擇

本研究選擇在組織細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)、且應(yīng)用最多的U6 作為NSCLC 患者組織中的參照基因，選cel-miR-39 作為血清和EBC 中目的基因檢測時的參照基因。反應(yīng)體系：cDNA 2 μL，miRNA 熒光定量檢測試劑10 μL，引物終濃度200 mM，反應(yīng)體積為20 μL。反應(yīng)條件：預(yù)變性：94℃，2 min，94℃，20 s；64℃，34 s，40 個循環(huán)。引物序列見表2。

表2 miRNA34a 和參照基因引物序列Table 2 miRNA34 and reference gene primer sequence

1.3.5 CEA、CYFRA21-1 的檢測

采用化學(xué)發(fā)光法，按照羅氏602 全自動化學(xué)發(fā)光分析儀測定試劑盒說明書檢測，CEA 參考范圍：＜5 μg/L。CYFRA211 參考范圍：＜3.5 μg/L。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS Statistics 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理。計量資料以（±s）表示，計量資料先做正態(tài)性檢驗(yàn)（K-S 檢驗(yàn)），若數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，組間比較采用t檢驗(yàn)；若不符合正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本的非參數(shù)檢驗(yàn)（Mann-Whitney 法）。計數(shù)資料用n（%）表示，兩組比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織、血清和EBC 中miRNA34a 的表達(dá)水平情況

肺癌組織中miRNA34a 的相對表達(dá)水平低于癌旁組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。非小細(xì)胞肺癌組血清和EBC 中miRNA34a 的相對表達(dá)水平均低于健康對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 組織、血清和EBC 中miRNA34a 的表達(dá)水平（±s）Table 3 Expression levels of miRNA34a in tissue，serum and EBC（±s）

表3 組織、血清和EBC 中miRNA34a 的表達(dá)水平（±s）Table 3 Expression levels of miRNA34a in tissue，serum and EBC（±s）

樣本類型肺癌組織癌旁組織血清EBC n 健康對照組t 值P 值30 30 50 50 miRNA34a 相對表達(dá)水平NSCLC 組0.898±0.957 1.527±1.282 0.795±1.179 0.724±1.157 1.477±1.262 1.355±1.042 5.312 6.496 6.222 0.00 0.00 0.00

2.2 不同病理類型和不同TNM 分期miRNA34a 表達(dá)水平

Ⅲ～Ⅳ期NSCLC 患者組織、血清、EBC 中miRNA34a 表達(dá)水平均低于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；鱗癌患者EBC 和血清中miRNA34a 相對表達(dá)量雖低于腺癌患者，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表4。

2.3 兩組血清miR34a、CEA、CYFRA21-1 水平比較

K-S 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，各組的miRNA34a、CEA、CYFRA21-1 的數(shù)據(jù)均呈偏態(tài)分布（P＜0.05）。Mann-Whitney U 檢驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組比較，NSCLC組的血清miRNA34a 表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而CEA、CYFRA21-1 水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表4 不同病理類型和不同TNM 分期miRNA34a 表達(dá)水平（±s）Table 4 Expression levels of miRNA34a in different pathological types and TNM stages（±s）

表4 不同病理類型和不同TNM 分期miRNA34a 表達(dá)水平（±s）Table 4 Expression levels of miRNA34a in different pathological types and TNM stages（±s）

項目組織血清EBC n 30 50 50 miRNA34a 相對表達(dá)水平腺癌（n=24）0.502±0.421 0.969±1.351 0.424±0.554鱗癌（n=6）0.998±1.032 0.865±1.346 0.422±0.497 t 值1.958 1.465 1.462 P 值0.021 0.149 0.150 miRNA34a 相對表達(dá)水平Ⅰ～Ⅱ期（n=20）1.247±1.001 1.437±1.525 1.223±1.600Ⅲ～Ⅳ期（n=10）0.201±0.156 0.330±0.487 0.362±0.407 t 值6.324 8.721 10.574 P 值0.000 0.000 0.000

表5 兩組的血清miRNA34a、CEA、CYFRA211 含量比較［M（P25，P75）］Table 5 Content of miRNA34a，CEA and CYFRA21-1 in serum between 2 groups［M（P25，P75）］

2.4 EBC miRNA34a、CYFRA21-1 和CEA 診斷肺癌的敏感性和特異性

EBC miRNA34a、CYFRA21-1 和CEA 三者聯(lián)合診斷敏感度和特異度均高于單一診斷值，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表6。

表6 EBC miRNA34a、CYFRA21-1 和CEA 診斷肺癌敏感度、特異度Table 6 Sensitivity and specificity of EBC miRNA34a、CYFRA21-1 and CEA in diagnosis of lung cancer

3 討論

2016年世界衛(wèi)生組織公布的全球死亡病因統(tǒng)計分析結(jié)果，其中氣管癌、支氣管癌和肺癌排名第6［7］。2019年國家癌癥中心報告肺癌位居我國惡性腫瘤發(fā)病首位，在城市和農(nóng)村均占惡性腫瘤死亡第一位［1］。有研究表明對于早期非小細(xì)胞肺癌患者中位生存期遠(yuǎn)遠(yuǎn)長于晚期患者，因此提高早期非小細(xì)胞肺癌患者的檢出率至關(guān)重要。

miRNA 是一類非編碼小分子RNA，在基因表達(dá)中發(fā)揮“交通警察”的作用，調(diào)控基因表達(dá)［2］。Hu［4］等人研究發(fā)現(xiàn)有14 種miRNA 在非小細(xì)胞肺癌中顯著失調(diào)，miRNA 在轉(zhuǎn)錄后水平負(fù)調(diào)控基因表達(dá)。miRNA34a 是miRNA34 家族的一員，是一類高度保守的miRNA，miRNA34 家族與多種疾病相關(guān)。miRNA34a 有多個作用位點(diǎn)，與細(xì)胞的生長、腫瘤的轉(zhuǎn)移都有關(guān)系［4-5］。研究表明，miRNA34 在多種腫瘤中，如肺癌、大腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、尿路上皮癌和腎癌中都會有不同程度的表達(dá)下降。Kasinski［8］等人在小鼠肺癌模型中發(fā)現(xiàn)p53 基因和miRNA34a 基因的相關(guān)性，并由此推斷miRNA34a 在肺癌發(fā)生中發(fā)揮預(yù)防劑和靜止劑的作用。miRNA34a 屬于抑癌基因，可通過與癌基因（如c-myc、BCL-2、E2F3、Cyclin D1 及Cyclin E2 等）相結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周期停滯于G1 期，抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。有研究認(rèn)為，miRNA-34a 不僅是治療NSCLC 的有前途的分子靶點(diǎn)，而且還是一種有用的、新的NSCLC 的預(yù)后標(biāo)志物［9］。本研究結(jié)果顯示NSCLC 患者癌組織中miRNA34a 表達(dá)與TNM 分期相關(guān)，與其它學(xué)者的研究結(jié)果相一致［10］。單一的腫瘤標(biāo)志物檢測沒有足夠的靈敏度和特異性，因此，需要敏感、特異的標(biāo)志物組合來提高腫瘤診斷的敏感性和特異性［11］。本研究對EBC 中miRNA34a、血 清CEA 和CYFRA21-1 對NSCLC 診斷價值進(jìn)行了分析，聯(lián)合檢測可有效提高其診斷的敏感性和特異性。由于本研究樣本量較小，在將其應(yīng)用于臨床作為篩查試驗(yàn)之前，還需要進(jìn)行大規(guī)模的多中心臨床研究來驗(yàn)證其有效性。

總之，隨著對非小細(xì)胞肺癌分子生物學(xué)研究的深入，基于腫瘤標(biāo)志物的診斷及預(yù)后研究將會有著越來越多的發(fā)現(xiàn)，EBC 中的miRNA34a 檢測對NSCLC 的診斷價值值得進(jìn)一步深入研究。