不同類型過敏性結(jié)膜炎患兒TSLP、TGF-β1及ECP表達(dá)及臨床意義

江靈

過敏性結(jié)膜炎（Allergic conjunctivitis，AC）是由結(jié)膜（也包括角膜）組織對(duì)外界變應(yīng)原產(chǎn)生的超敏反應(yīng)，主要由Ⅰ型和Ⅳ型超敏反應(yīng)介導(dǎo)。當(dāng)變應(yīng)原首次接觸機(jī)體，機(jī)體接受刺激產(chǎn)生以IgE 為主的抗體［1］。當(dāng)變應(yīng)原再次接觸后，已致敏的肥大細(xì)胞表面IgE 與變應(yīng)原結(jié)合，引起肥大細(xì)胞脫顆粒并釋放大量介質(zhì)。除了肥大細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞、T 淋巴細(xì)胞等多種血液和免疫細(xì)胞參與AC 的發(fā)病過程。常見的AC 有三種不同類型：季節(jié)性過敏性結(jié)膜炎（seasonal allergic conjunctivitis，SAC）、常年性過敏性結(jié)膜炎（perennial allergic conjunctivitis，PAC）和春季角結(jié)膜炎（vernal keratoconjunctivitis，VKC）。胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）是一種上皮細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，在超敏反應(yīng)局部表達(dá)增加［2］。人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）一種是激素樣多肽，在炎癥、細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)等方面起重要作用［3］。嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（eosinophil cationic protein，ECP）是嗜酸性粒細(xì)胞分泌的毒性顆粒蛋白，在炎癥和過敏性疾病的致病過程中發(fā)揮重要功能［4］。目前臨床上AC 的實(shí)驗(yàn)室檢查主要以淚液IgE 定量分析、結(jié)膜分泌物涂片和刮片檢查為主，但均存在敏感性和特異性不高的問題。因此，尋找新的可替代的評(píng)價(jià)分子尤為重要。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年1月由本院眼科收治的診斷為過敏性結(jié)膜炎兒童患者60 例，根據(jù)過敏性結(jié)膜炎分型不同分為3 組：季節(jié)性過敏性結(jié)膜炎組（SAC 組）19 例、常年性過敏性結(jié)膜炎組（PAC組）18 例和春季角結(jié)膜炎組（VKC 組）23 例。另外選擇年齡相似的健康兒童20 例作為正常對(duì)照組。本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)審批通過，所有受試者及其監(jiān)護(hù)人均知情并簽署知情同意書。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合上述過敏性結(jié)膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［1］；②年齡未滿14 周歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：①有蕁麻疹、濕疹、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等全身變態(tài)反應(yīng)性疾病史者；②有其他角膜、結(jié)膜、鞏膜疾病史者；③有隱形眼鏡配戴史者；④眼部有手術(shù)病史者；⑤近半年眼部有用藥史者。

1.2 研究方法

1.2.1 淚液中細(xì)胞因子的檢測(cè)

受試患者取坐位，微仰頭并向鼻上注視，研究者使用10 μL 醫(yī)用一次性自吸式微量吸管在下瞼顳側(cè)瞼緣處采集淚液，雙眼各取5 μL，共計(jì)10 μL。EP 管分裝儲(chǔ)存在-80℃低溫冰箱中，待全部樣本采集完畢后行進(jìn)一步分析。淚液中TSLP、TGF-β1 及ECP 細(xì)胞因子的測(cè)定采用liquichip 液相芯片技術(shù)，檢測(cè)操作由天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司完成。

1.2.2 血清中細(xì)胞因子的檢測(cè)

受試患者空腹抽取外周靜脈血5 mL 于肝素抗凝管內(nèi)，室溫靜置1 h 后以3 000 r/min 轉(zhuǎn)速離心5 min，取上清液分裝至EP 管并儲(chǔ)存在-80℃低溫冰箱中，待全部樣本采集完畢后行進(jìn)一步分析。血清TSLP、TGF-β1 及ECP 細(xì)胞因子的檢測(cè)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）技術(shù)，TSLP 和TGF-β1 檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢云克隆科技股份有限公司，ECP 檢測(cè)試劑盒由上海西唐生物科技有限公司。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測(cè)結(jié)膜上皮細(xì)胞中細(xì)胞因子表達(dá)

受試者雙眼用鹽酸丙美卡因滴眼液（比利時(shí)愛爾康公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20090082）點(diǎn)滴2 次行眼表面麻醉，每次間隔3 min。無(wú)菌顯微鑷夾取已消毒的硝酸纖維膜輕敷于受試者眼側(cè)、球結(jié)膜上下部10 s 后，迅速轉(zhuǎn)移至盛有350 μL 1%的β-巰基乙醇RLT 緩沖液的潔凈EP 管中，雙眼樣本采集后合并于-80℃低溫冰箱中儲(chǔ)存，待全部樣本采集完畢后行進(jìn)一步分析。待樣本收集完整后，根據(jù)試劑盒步驟要求提取結(jié)膜上皮細(xì)胞總RNA，轉(zhuǎn)錄成cDNA，行實(shí)時(shí)熒光定量PCR。檢測(cè)以β-actin 為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析TSLP、TGF-β1及ECP mRNA 相對(duì)表達(dá)量。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，58℃退火30 s，72℃延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)；72℃充分延伸5 min。

1.3 治療方法

采用0.1%鹽酸奧洛他定滴眼液（5 mL：5 mg，Alcon 公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)：H20130954）對(duì)三組不同型別的過敏性結(jié)膜炎的60 例患者進(jìn)行治療，1～2 d/12 h，局部點(diǎn)眼，連續(xù)使用兩周，如兩周仍有癥狀，繼續(xù)治療至癥狀完全消失。停藥3日后測(cè)定淚液和血清中TSLP、TGF-β1 及ECP 的水平并與治療前的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以（±s）表示，多組間差異采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料用n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組受試者一般資料

所有組別受試者年齡、性別比例、平均病程、嚴(yán)重程度等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

表1 不同組別一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general information in different groups（±s）

表1 不同組別一般資料比較（±s）Table 1 Comparison of general information in different groups（±s）

組別SAC 組PAC 組VKC 組正常對(duì)照組χ2/F 值P 值n 19 18 23 20年齡6.5±1.6 6.7±2.5 7.3±2.2 7.0±1.9 0.59 0.62男/女9/10 10/8 11/12 11/9 0.47 0.93平均病程（月）5.24±1.9 5.36±1.7 5.71±2.4-0.30 0.74輕/中/重4/9/6 4/10/4 6/12/5-1.23 0.87

2.2 各組受試者淚液和血清中TSLP、TGF-β1 和ECP 水平

三種類型過敏性結(jié)膜炎組受試者淚液和血清中TSLP 和ECP 水平明顯高于正常對(duì)照組，TGF-β1水平明顯低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VKC 組淚液TSLP，血清TSLP 和ECP 水平明顯高于其他兩組，PAC 組淚液ECP 水平明顯高于其他兩組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組受試者淚液和血清中TSLP、TGF-β1 和ECP 水平的比較（±s）Table 2 Comparison of TSLP，TGF-β1 and ECP levels in tears and serum of subjects in each group（±s）

表2 各組受試者淚液和血清中TSLP、TGF-β1 和ECP 水平的比較（±s）Table 2 Comparison of TSLP，TGF-β1 and ECP levels in tears and serum of subjects in each group（±s）

組別SAC 組PAC 組VKC 組正常對(duì)照組F 值P 值n 淚液血清19 18 23 20 TSLP（pg/mL）27.74±5.28 33.25±8.12 46.32±7.20 7.32±2.57 146.03＜0.05 TGF-β1（pg/mL）22.11±5.91 23.34±6.19 21.64±5.52 48.59±7.42 87.91＜0.05 ECP（ng/mL）31.28±4.96 42.45±8.75 33.36±6.48 3.65±1.31 154.42＜0.05 TSLP（pg/mL）17.93±2.34 19.41±2.75 24.12±3.01 4.24±1.54 243.54＜0.05 TGF-β1（pg/mL）12.57±5.45 12.24±5.19 10.21±4.73 25.36±5.42 46.09＜0.05 ECP（ng/mL）15.24±2.64 14.73±3.21 18.53±3.86 3.13±1.24 107.93＜0.05

2.3 各組受試者結(jié)膜上皮細(xì)胞中TSLP、TGF-β1和ECP mRNA 表達(dá)水平

4 組受試者結(jié)膜上皮細(xì)胞中TSLP、TGF-β1 和ECP mRNA 表達(dá)水平比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與正常對(duì)照組比較，SAC 組、PAC 組和VKC 組結(jié)膜上皮細(xì)胞中TSLP 和ECP mRNA 表達(dá)明顯增加，TGF-β1 表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VKC 組TSLP 和ECP mRNA表達(dá)水平明顯高于SAC 組和PAC 組，TGF-β1 mRNA 表達(dá)水平明顯低于另兩組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

2.4 治療前后淚液和血清中TSLP、TGF-β1 及ECP 水平變化

60 例不同組別過敏性結(jié)膜炎患者治療前后對(duì)淚液和血清中TSLP、TGF-β1 及ECP 水平進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1所示。治療后的淚液和血清中TSLP 和ECP 水平較治療前明顯減低，TGF-β1 水平較治療前明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表3 各組受試者結(jié)膜上皮細(xì)胞中TSLP、TGF-β1 和ECP mRNA 表達(dá)水平的比較（±s）Table 3 Comparison of TSLP，TGF-β1 and ECP mRNA expression levels in Conjunctival epithelial cells（±s）

表3 各組受試者結(jié)膜上皮細(xì)胞中TSLP、TGF-β1 和ECP mRNA 表達(dá)水平的比較（±s）Table 3 Comparison of TSLP，TGF-β1 and ECP mRNA expression levels in Conjunctival epithelial cells（±s）

組別SAC 組PAC 組VKC 組正常對(duì)照組F 值P 值n 19 18 23 20 TSLP 3.60±1.54 2.57±0.68 7.21±2.87 1.00±0.00 49.42＜0.05 TGF-β1 0.68±0.20 0.65±0.19 0.47±0.13 1.00±0.00 45.53＜0.05 ECP 3.19±1.08 3.42±1.27 6.89±3.13 1.00±0.00 37.04＜0.05

3 討論

過敏性結(jié)膜炎（AC）是一種常見的眼科眼表疾病，全球約有五分之一的人曾患AC［5］。有報(bào)道顯示，美國(guó)有40%人群有AC 病史，但就醫(yī)人數(shù)僅有10%［6］。大約15%～20%的日本人曾罹患AC，我國(guó)目前缺乏AC 的大樣本流行病學(xué)數(shù)據(jù)，但又研究顯示有10%以上的人罹患此病［5］。在AC 分型方面，我國(guó)以SAC、PAC 和VKC 尤為常見，其中SAC 和PAC 占所有AC 患者的74%［5，7］。

圖1 不同類型過敏性結(jié)膜炎患兒治療前后淚液和血清中TSLP、TGF-β1 及ECP 水平變化Figure 1 Changes of TSLP，TGF-β1 and ECP levels in tears and serum of children with different types of allergic conjunctivitis before and after treatment

胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP）是近些年才被逐漸認(rèn)識(shí)的免疫活性細(xì)胞因子，主要由肺、皮膚上皮細(xì)胞，成纖維細(xì)胞，肥大細(xì)胞等多種類型細(xì)胞分泌產(chǎn)生［8］。TSLP 功能與IL-17 類似，在免疫細(xì)胞的增殖、分化、成熟、活化等過程中發(fā)揮重要作用，尤其是對(duì)樹突狀細(xì)胞（DC）的成熟、活化發(fā)揮調(diào)控功能［9］?；罨腄C 介導(dǎo)CD4+naive T 細(xì)胞向Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，分泌過敏性細(xì)胞因子IL-4、IL-5 和TNF-α，下調(diào)IL-10 和IFN-γ 的合成，這些細(xì)胞因子共同促進(jìn)IgE 合成和嗜酸性粒細(xì)胞的增殖來(lái)啟動(dòng)過敏性反應(yīng)［10-11］。嗜酸性粒細(xì)胞陽(yáng)離子蛋白（ECP）是嗜酸性粒細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白分子，ECP 的表達(dá)水平可反映嗜酸性粒細(xì)胞活化情況，ECP 可介導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放介質(zhì)，介導(dǎo)過敏性疾病的發(fā)生，在過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏性咳嗽中均有報(bào)道［4，12］。人轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）主要是由具有負(fù)調(diào)控功能的免疫細(xì)胞Treg 細(xì)胞合成分泌的一種細(xì)胞因子，其主要功能是發(fā)揮免疫抑制功能［13］。TGF-β1 可促進(jìn)Treg 細(xì)胞的活化增殖，誘導(dǎo)CD4+CD25-naive T 細(xì)胞向CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）轉(zhuǎn)化，TGF-β1 也是維持Treg 細(xì)胞免疫抑制功能的關(guān)鍵因子［14］。

liquichip 液相芯片技術(shù)是綜合激光技術(shù)、熒光微球技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)、免疫化學(xué)技術(shù)和數(shù)字信號(hào)處理技術(shù)而成的新型蛋白分子檢測(cè)技術(shù)［15］。結(jié)果提示在AC 發(fā)病過程中Treg 細(xì)胞的功能受到抑制，TSLP 和ECP 的表達(dá)與疾病嚴(yán)重程度正相關(guān)。因此，上述細(xì)胞因子有作為AC 輔助診斷標(biāo)志物的潛力，但需要更大樣本和更深入機(jī)制研究的支持。

綜上所述，通過TSLP、TGF-β1 和ECP 與過敏性結(jié)膜炎及其嚴(yán)重程度，病情進(jìn)展康復(fù)之間的相關(guān)性，為深入了解TSLP、TGF-β1 和ECP 在過敏性結(jié)膜炎發(fā)病中的具體機(jī)制提供新思路，也表明了TSLP、TGF-β1 和ECP 成為過敏性結(jié)膜炎新型輔助診斷標(biāo)志物的潛力。