Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌和利福平耐藥的臨床應(yīng)用

張建平 李紅燕 王大望 劉莎莉 馬艷俠

結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（M.tuberculosiscomplex，MTB）共包括人型、牛型、非洲型和田鼠型，對(duì)大多數(shù)抗結(jié)核藥物的自然耐受性相近，臨床上結(jié)核病的病原菌多為人型結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌。結(jié)核病是一種嚴(yán)重危害人民健康的慢性傳染病，我國(guó)是結(jié)核病高負(fù)荷國(guó)家，耐藥情況嚴(yán)重，在結(jié)核病防控工作中結(jié)核菌檢查對(duì)于發(fā)現(xiàn)傳染源、確定診斷和化療方案、考核療效、評(píng)價(jià)防治效果具有重要意義［1］。結(jié)核菌的實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)技術(shù)涵蓋病原學(xué)檢測(cè)、免疫學(xué)檢測(cè)、分子生物學(xué)檢測(cè)及生物化學(xué)檢測(cè)。包括痰涂片鏡檢、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、結(jié)核抗體、γ-干擾素釋放試驗(yàn)/T-Sport，分枝桿菌核酸檢測(cè)（TB-NTM-PCR）等［2］。痰涂片鏡檢陽(yáng)性率低，傳統(tǒng)的羅氏培養(yǎng)法及藥敏試驗(yàn)檢出結(jié)果時(shí)間長(zhǎng)，不能滿足臨床需要，而肺外標(biāo)本采用傳統(tǒng)方法診斷較為困難，涂陰培陰的結(jié)核患者占73.6%，因此迫切需要能快速、準(zhǔn)確檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌及其耐藥性的診斷技術(shù)。近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分枝桿菌核酸PCR、實(shí)時(shí)熒光RNA 恒溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)（SAT）、Xpert 結(jié)核分枝桿菌/利福平快速分子鑒定（Mycobaeterium tuberculosis/Rifampicin，MTB/RIF）、線性探針、基因芯片等新的檢驗(yàn)方法也不斷應(yīng)用于臨床［3］。本研究對(duì)肺結(jié)核病患者的痰標(biāo)本分別采用直接涂片抗酸染色（Z-N 法）、結(jié)核桿菌MGIT 液體培養(yǎng)、Xpert MTB/RIF方法進(jìn)行檢測(cè)，現(xiàn)分析報(bào)告如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2018年1月至2018年9月在本院傳染病院住院的確診肺結(jié)核病患者116 例，納入標(biāo)準(zhǔn)：參照WS 288-2017 肺結(jié)核診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］，依據(jù)臨床表現(xiàn)、胸部影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查。其中結(jié)核桿菌MGIT液體培養(yǎng)陽(yáng)性72 例，男51 例，女21 例，年齡16～90歲，平均年齡50.6 歲，男女性別比2.43∶1。培養(yǎng)陰性44 例，男31 例，女13 例，年齡21～88 歲，平均年齡49.5 歲，男女性別比2.38∶1。排除標(biāo)準(zhǔn)：影像學(xué)及實(shí)驗(yàn)室檢查均排除非結(jié)核分枝桿菌肺病及其它肺部疾病。實(shí)驗(yàn)采用研究對(duì)象的痰標(biāo)本，研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，免于簽署患者知情同意書(shū)。

1.2 標(biāo)本采集

收集3 份痰標(biāo)本（當(dāng)日即時(shí)痰、夜間痰和次日晨痰）。患者用清水漱口后，深吸氣2～3 次，每次用力呼出，從肺部深處咳出第2、3 口痰液收集于樣本容器，擰緊盒蓋送檢。對(duì)當(dāng)日不能檢測(cè)的痰標(biāo)本置于4℃冰箱保存，不超過(guò)12 h，要求標(biāo)本量一般3～5 mL，標(biāo)本采集前均未使用抗結(jié)核藥物治療［4］。

1.3 儀器與試劑

采用全自動(dòng)醫(yī)用PCR 分析系統(tǒng)（美國(guó)Cepheid公司，型號(hào)：GeneXpert）、全自動(dòng)分支桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)儀（美國(guó)BD 公司，型號(hào)：BACTEC MGITTM320）、生物顯微鏡（德國(guó)Leica 公司，型號(hào)：MD1000）。Xpert MTB/RIF 檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Cepheid 公司）、BBLTMMGITTM培養(yǎng)管（美國(guó)BD 公司）、分枝桿菌聯(lián)合藥敏試劑盒（美國(guó)BD 公司）、抗酸染色試劑盒（珠海貝索公司）。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 直接涂片抗酸染色

對(duì)3 份痰標(biāo)本采用萋尼染色法（Z-N 法），參照WS 288-2017 肺結(jié)核診斷、《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃。痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè)》進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量控制，涂片陽(yáng)性結(jié)果定義為至少兩份標(biāo)本判斷為陽(yáng)性［4-5］。

1.4.2 MGIT 液體培養(yǎng)

對(duì)3 份混合痰標(biāo)本用2% N-乙酰-L-半胱氨酸-NaOH 進(jìn)行處理，將處理后的標(biāo)本接種于含營(yíng)養(yǎng)添加劑及抑制劑的MGIT 液體培養(yǎng)管，放入BACTEC MGITTM320 儀器自動(dòng)檢測(cè)，通過(guò)分析熒光強(qiáng)度判斷是否有結(jié)核MTB 生長(zhǎng)，一般快速7～14 d 培養(yǎng)陽(yáng)性，培養(yǎng)周期設(shè)定42 d。

1.4.3 MGIT 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)

使用MGIT 陽(yáng)性1 天的懸浮培養(yǎng)液，按照藥敏試劑盒接種程序操作，4～13 d 內(nèi)通過(guò)分離菌株在含藥培養(yǎng)管和生長(zhǎng)對(duì)照管的對(duì)比確定藥物敏感性結(jié)果。

1.4.4 Xpert MTB/RIF 技術(shù)

取1 mL 混合痰標(biāo)本加入2 mL 樣本處理液，按照操作規(guī)程將處理后的樣本加入檢測(cè)盒，置于GeneXpert 檢測(cè)模塊自動(dòng)檢測(cè)。該技術(shù)采用巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR，針對(duì)結(jié)核分枝桿菌rpoB基因81 bp 利福平耐藥核心區(qū)（rifampin resistance determining region，RRDR）設(shè)計(jì)引物、探針，檢測(cè)其是否突變。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用Pearson 卡方檢驗(yàn)，采用McNemar 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3 種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較

3 種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 3 種檢測(cè)方法陽(yáng)性率比較［n（%）］Table 1 Comparison of positive rate of 3 methods［n（%）］

2.2 MGIT 液體培養(yǎng)與Xpert MTB 結(jié)果比較

MGIT 液體培養(yǎng)與Xpert MTB 結(jié)果比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。以臨床確診為診斷標(biāo)準(zhǔn)，Xpert 法靈敏度90.3%，特異度77.3%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值86.7%，陰性預(yù)測(cè)值82.9%，Youden 指數(shù)0.676，總符合率85.3%。見(jiàn)表2。

表2 MGIT 液體培養(yǎng)與Xpert MTB 結(jié)果比較［n（%）］Table 2 MGIT liquid culture and XPERT MTB results comparison［n（%）］

2.3 Xpert MTB 與Z-N 法結(jié)果比較

Xpert MTB 與Z-N 法結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 Xpert MTB 與Z-N 法結(jié)果比較［n（%）］Table 3 Xpert MTB and Z-N results comparison［n（%）］

2.4 Xpert MTB/RIF rpoB 基因檢測(cè)結(jié)果

75 例Xpert MTB/RIFrpoB基因檢測(cè)結(jié)果分析，66 例Xpert MTB/RIFrpoB基因未檢出突變，即未檢測(cè)到RIF 耐藥，與MGIT 聯(lián)合藥敏試驗(yàn)利福平敏感結(jié)果一致，9 例Xpert MTB/RIFrpoB基因突變被檢出，為RIF 耐藥，而藥敏試驗(yàn)為利福平敏感，總符合率88.0%（66/75）。見(jiàn)表4。

表4 Xpert 利福平rpoB 基因檢測(cè)結(jié)果［n（%）］Table 4 The results of Xpert rpoB gene［n（%）］

3 討論

結(jié)核桿菌耐藥表型及耐藥基因型關(guān)系的確立，為基于利福平耐藥基因rpoB突變?yōu)榘悬c(diǎn)的診斷奠定了基礎(chǔ)［6］。Xpert MTB/RIF 以5 條引物探針選擇性覆蓋結(jié)核分枝桿菌特有的序列rpoB基因81 bp 上RRDR，第6 條探針用做內(nèi)部質(zhì)量控制，以檢測(cè)標(biāo)本是否含有結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）以及利福平是否耐藥［7］。

WHO 推薦Xpert MTB/RIF 對(duì)成人疑似多重耐藥結(jié)核或HIV 相關(guān)肺結(jié)核初篩診斷，Xpert MTB/RIF 檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌靈敏度高［8］。據(jù)報(bào)道，抗酸染色法通常需5 000 CFU/mL 才能得到陽(yáng)性結(jié)果，而Xpert MTB/RIF 方法的檢測(cè)限（LoD）為131 CFU/mL，尤其在MTB DNA 低拷貝時(shí)，抗酸染色法往往是陰性結(jié)果。本研究顯示，痰直接涂片抗酸染色法的陽(yáng)性率遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于Xpert MTB 與MGIT液體培養(yǎng)陽(yáng)性率，而Xpert MTB 與MGIT 液體培養(yǎng)陽(yáng)性率接近。直接痰涂片陽(yáng)性率低，容易漏檢，也和未采用濃縮集菌法涂片、熒光染色鏡檢以及與工作人員的涂片質(zhì)量和閱片技能有一定關(guān)系［9］。

國(guó)外有報(bào)道，Xpert MTB/RIF 試驗(yàn)在痰涂片陽(yáng)性的標(biāo)本中，其敏感性接近100%，本文的研究結(jié)果與其一致［10］。文獻(xiàn)報(bào)道，傳統(tǒng)羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率為44.5%，培養(yǎng)時(shí)間約6～8 周，MGIT 液體培養(yǎng)陽(yáng)性率為62.1%，7～14 天培養(yǎng)陽(yáng)性，較羅氏培養(yǎng)陽(yáng)性率提高，且培養(yǎng)時(shí)間縮短，但對(duì)生物安全級(jí)別要求高，在基層難以開(kāi)展［11］。而Xpert MTB/RIF方法整個(gè)流程僅需2 h，手工只需處理樣本即上機(jī)自動(dòng)檢測(cè)。本文研究結(jié)果表明Xpert MTB/RIF檢測(cè)具有同液體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)接近的臨床應(yīng)用價(jià)值，提示可以用Xpert MTB/RIF 對(duì)疑似耐藥結(jié)核進(jìn)行初篩［12］。

除了痰標(biāo)本外，Xpert MTB/RIF 還可以檢測(cè)灌洗液、胸腹水、引流液、腦脊液標(biāo)本，據(jù)研究報(bào)道，陽(yáng)性率依次為灌洗液65.9%、痰樣本53.9%、胸水16.4%，特異性均較高［13］。Xpert MTB/RIF 檢出rpoB 陽(yáng)性基因型耐藥高于藥敏試驗(yàn)表型耐藥結(jié)果，大多數(shù)原因是標(biāo)本中存在異質(zhì)性利福平耐藥，與某些基因位點(diǎn)突變的低水平耐藥相關(guān)，也可能存在Xpert MTB/RIF 檢測(cè)的假耐藥，可能與沉默子突變或Xpert MTB/RIF 檢測(cè)系統(tǒng)判讀錯(cuò)誤有關(guān)，對(duì)不一致菌株應(yīng)進(jìn)行rpoB 耐藥基因核心區(qū)間測(cè)序［14］。另外，Xpert MTB/RIF 系統(tǒng)不能區(qū)分是否活性結(jié)核分枝桿菌，不能被用于監(jiān)測(cè)治療或復(fù)發(fā)［15］。綜上，Xpert MTB/RIF 是一種結(jié)核病快速診斷的新方法，具有快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、對(duì)生物安全要求不高等特點(diǎn)，可以在基層開(kāi)展，能同時(shí)檢測(cè)出結(jié)核分枝桿菌及是否對(duì)利福平耐藥，對(duì)肺結(jié)核及肺外結(jié)核病的早期診斷具有重要意義，是痰涂片鏡檢及培養(yǎng)檢查方法的有力補(bǔ)充。