腸道菌群紊亂在大鼠非酒精性脂肪肝中的作用機制

耿妍 魯曉嵐 耿燕 史海濤

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明確肝損傷因素外所致的，以彌漫性肝細胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征［1］。隨著“全球肥胖”的流行，NAFLD 在中國及歐美發(fā)達國家的患病率逐年升高，該病目前已被公認為是成人及兒童慢性肝臟疾病的首要病因［2］。NAFLD 作為一種復(fù)雜的疾病，病理生理機制尚未完全闡明，其發(fā)生發(fā)展的主要危險因素包括肥胖、胰島素抵抗、2 型糖尿病、高脂血癥等［3］。因此，探究單純性肥胖引起NAFLD 的發(fā)病機制，對于了解從單純性肥胖（Simple Obesity，SO）進展為NAFLD 這一過程至關(guān)重要。近年來，多項研究發(fā)現(xiàn)腸道菌群作為一個新的環(huán)境因素在肥胖和NAFLD 的發(fā)生中發(fā)揮重要作用［4-5］。目前腸道菌群在肥胖轉(zhuǎn)化為NAFLD 的作用及機制研究較少，本研究將探討腸道菌群在肥胖及NAFLD的作用，以期為肥胖及NAFLD 的防治提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SD 雄性大鼠［動物合格證號：skxk（shaan）2018-001］購自西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心。內(nèi)毒素檢測試劑盒購自北京金山川科技發(fā)展有限公司。糞便總DNA 提取試劑盒購自北京艾德萊試劑有限公司。實時定量PCR 反應(yīng)試劑盒購自日本TaKaRa 公司。ELISA 試劑盒購自上海源葉生物科技有限公司。全自動生化分析儀購自日本OLYMPUS 公司。

1.2 實驗動物

8 周齡雄性SD 大鼠30 只（SPF 級），平均體重160 g 左右，分籠飼養(yǎng)于西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心（動物實驗條件符合二級標準）。高脂飼料配方：10%豬油、2%膽固醇、5%蔗糖、0.5%豬膽鹽、82.5%基礎(chǔ)飼料；普通飼料購自西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組

將30 只大鼠隨機分為對照組（NC 組）（普通飼料，n=6）、模型組（高脂飼料，n=24）。分別給予普通飼料及高脂飼料喂養(yǎng)8 周。于8 周末處死所有大鼠，行肝臟蘇木精伊紅（Hematoxylin and Eosin，HE）染色，光鏡下觀察篩選模型組中發(fā)生脂肪變的為NAFLD 組（n=12），未發(fā)生脂肪變的為SO 組（n=12）。

1.3.2 血清生化指標檢測

全自動生化分析儀檢測血清：膽固醇（Total cholesterol，TC）、甘油三酯（Triglyceride，TG）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Alanine transaminase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Aspartate Aminotransferase，AST）。

1.3.3 動態(tài)比濁法測定血清內(nèi)毒素

按照內(nèi)毒素檢測試劑盒的說明書操作。

1.3.4 肝臟組織及回腸粘膜HE 染色

分別取各組大鼠肝臟及回腸組織（距回盲瓣7～17 cm），置于4%的多聚甲醛溶液中，常規(guī)制成石蠟切片，行HE 染色。

1.3.5 腸道糞便中乳酸桿菌屬、大腸桿菌屬、雙歧桿菌屬的測定

嚴格按照北京艾德萊試劑糞便總DNA 提取試劑盒及日本TaKaRa 公司熒光實時PCR 反應(yīng)試劑盒操作。以DNA 為模板，PCR 擴增大腸桿菌屬，乳酸桿菌屬，雙歧桿菌屬，標準品為內(nèi)參。引物見表1［6］。

表1 相關(guān)引物信息Table 1 Related primer information

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學意義者兩組間比較采用LDL-t檢驗。糞便細菌定量結(jié)果數(shù)據(jù)以logx±s表示。采用Pearson相關(guān)分析和Spearman 秩相關(guān)分析自變量和因變量之間的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀況、體重及飲食變化

實驗過程中，各組大鼠均無死亡。喂養(yǎng)至第8周時，NC 組大鼠皮毛光澤，反應(yīng)靈敏。SO 組及NAFLD 組大鼠皮毛暗淡無光澤，活動減少，精神萎靡，進食量較多。喂養(yǎng)至第4、8 周時模型組大鼠體重明顯高于NC 組大鼠，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而SO 組與NAFLD 組體重比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表2。

2.2 肝臟病理變化

光鏡下可見NC 組大鼠肝細胞呈條索狀排列，圍繞中央靜脈呈放射狀，核圓、大、居中。SO 組大鼠肝細胞排列整齊，無脂滴及炎癥細胞浸潤。NAFLD 組大鼠肝細胞排列整齊，可見散在小泡性脂滴浸潤，無明顯炎癥細胞及壞死。見圖1。

表2 各組大鼠體重變化（±s，g）Table 2 Weight change in each group（±s，g）

表2 各組大鼠體重變化（±s，g）Table 2 Weight change in each group（±s，g）

注：與NC 組比較，aP＜0.05。

分組NC 組SO 組NAFLD 組F 值P 值0 w 體重241.75±11.56 246.90±12.30 245.51±13.54 44.352 0.912 2 w 體重345.25±12.84 387.95±22.32 397.83±16.92 46.368 0.819 4 w 體重392.25±16.93 454.95±24.84a 463.21±11.85a 48.305 0.033 8 w 體重451.75±13.25 508.77±26.29a 514.75±16.23a 50.023 0.025

圖1 各組大鼠肝臟病理改變（HE，×400）Figure 1 Pathological changes of liver of rats in each group（HE，×400）

2.3 各組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、內(nèi)毒素、血脂比較

SO 組及NAFLD 組大鼠血清ET、TG 水平顯著高于NC 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SO組TC 水平顯著高于NC 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NAFLD 組ET 水平顯著高于SO 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。3 組間ALT、AST 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。NAFLD 組與余兩組TC 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），NAFLD 與SO 組TG 水平比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠腸道菌群的變化

模型組腸道糞便大腸桿菌屬數(shù)量顯著高于NC 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NAFLD 組大腸桿菌屬數(shù)量顯著高于SO 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。模型組雙歧桿菌屬、乳酸桿菌屬數(shù)量顯著低于NC 組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。NAFLD 組雙歧桿菌屬數(shù)量顯著低于SO組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。SO 組與NAFLD 組乳酸桿菌數(shù)量相比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表4。

2.5 腸道病理改變

光鏡下可見NC 組小腸粘膜表面微絨毛排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰。SO 組小腸上皮細胞腫脹，細胞游離面微絨毛短小，排列紊亂，黏膜層可見少許炎性細胞浸潤，伴灶性糜爛。NAFLD 組小腸粘膜上皮細胞腫脹，結(jié)構(gòu)明顯紊亂，細胞游離面微絨毛短小，黏膜層可見大量炎性細胞浸潤，伴灶性糜爛。見圖2。

表3 三組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、內(nèi)毒素、血脂的比較（±s）Table 3 Comparison of serum transaminase and endotoxin of 3 group（±s）

表3 三組大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶、內(nèi)毒素、血脂的比較（±s）Table 3 Comparison of serum transaminase and endotoxin of 3 group（±s）

注：與NC 組比較，aP＜0.05，與SO 組比較，bP＜0.05。

分組NC 組SO 組NAFLD F 值P 值A(chǔ)LT（IU/L）48.50±12.39 48.33±13.45 50.58±12.63 1.012 1.351 AST（IU/L）146.67±16.77 154.67±12.37 156.75±13.19 0.534 1.026 ET（pg/mL）4.21±1.80 10.95±4.79a 15.43±4.64ab 26.321 0.001 TC 1.44±0.45 2.07±0.48a 1.85±0.44 0.931 0.005 TG 1.14±0.54 2.04±0.33a 2.34±0.49a 1.021 0.002

表4 各組大鼠腸道菌群結(jié)果比較（±s）Table 4 The results of intestinal flora in rats were compared（±s）

表4 各組大鼠腸道菌群結(jié)果比較（±s）Table 4 The results of intestinal flora in rats were compared（±s）

注：與NC 組比較，aP＜0.05，與SO 組比較，bP＜0.05。

分組NC 組SO 組NAFLD 組F 值P 值大腸桿菌屬8.41±0.96 8.99±0.49a 9.54±0.69ab 15.362 0.000雙歧桿菌屬9.23±0.65 8.65±0.33a 8.36±0.57ab 19.821 0.000乳酸桿菌屬8.38±0.72 7.76±0.47a 7.33±0.49a 18.365 0.021

圖2 各組大鼠小腸粘膜病理改變（HE，×400）Figure 2 Pathological changes of small intestinal mucosa of rats in each group（HE，×400）

2.6 腸道菌群與內(nèi)毒素、轉(zhuǎn)氨酶的相關(guān)性分析

Pearson 相關(guān)分析及Spearman 秩相關(guān)分析表明，大腸桿菌與ET、肝臟脂肪變程度均呈正相關(guān)（P＜0.05），乳酸桿菌、雙歧桿菌與ET、肝臟脂肪變均呈負相關(guān)（P＜0.05）。見表5。

3 討論

肥胖是導致NAFLD 的重要危險因素，有研究表明在重度肥胖人群中NAFLD 的發(fā)病率可達90%［7］。從肥胖到NAFLD 的發(fā)生發(fā)展有多種機制參與，其中腸道菌群的構(gòu)成紊亂可能是重要的組成部分。本研究通過高脂飲食的飼養(yǎng)誘導大鼠肥胖模型，觀察到高脂飲食可以誘發(fā)大鼠腸道菌群紊亂以及NAFLD 的出現(xiàn)。

陳杏云等［8］通過高脂飼料喂養(yǎng)小鼠8 周后，發(fā)現(xiàn)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，這與本實驗研究結(jié)果一致。分析高脂飲食對于腸道菌群構(gòu)成影響的機制，已有的研究結(jié)果表明，高脂飼料可以使腸道中作為菌群養(yǎng)料來源的碳水化合物的生成減少，同時高脂飲食代謝的部分產(chǎn)物可以破壞腸道菌群所在的微環(huán)境，從而影響腸道菌群的組成平衡，導致機體腸道菌群的紊亂［9］。

腸道菌群可以通過多種機制影響肥胖。首先，腸道菌群可以影響機體的能量平衡。B?ckhed等［10］的研究發(fā)現(xiàn)肥胖小鼠的腸道菌群酵解碳水化合物的能力增強，因此為宿主提供的能量增多，促進肥胖。其次，腸道菌群失調(diào)可破壞腸道上皮屏障，增加腸道的通透性，使得血清內(nèi)毒素含量增多，這種腸源性內(nèi)毒素水平的升高可以導致慢性炎癥的形成，進而導致肥胖［11］。

腸道菌群紊亂既可以通過促進肥胖間接地影響NAFLD，也可以通過多種通路直接促進NAFLD。例如，針對NAFLD 的研究表明腸道菌群通過改變腸道對膽堿和膽汁酸的代謝，產(chǎn)生丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸及禁食誘導脂肪因子等，從而影響NAFLD 的發(fā)?。?2］。另一方面，前述的血清內(nèi)毒素可經(jīng)由門靜脈進入肝臟，誘導肝細胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子、白細胞介素-1、白細胞介素-6 等炎性細胞因子，促進NAFLD 的發(fā)?。?3-14］。本研究發(fā)現(xiàn)NC 組到SO 組，再到NAFLD 組，大腸桿菌屬計數(shù)顯著增加，而優(yōu)勢菌顯著減少，腸道粘膜結(jié)構(gòu)由輕到重均有破壞，腸源性內(nèi)毒素水平逐漸增高，這與之前研究是一致的［15］。行相關(guān)性檢驗發(fā)現(xiàn)，大鼠腸道菌群失調(diào)與內(nèi)毒素及脂肪肝病變程度呈正相關(guān)。研究結(jié)果提示腸道菌群紊亂在脂肪蓄積及從SO 向NAFLD 進展過程中均發(fā)揮重要作用。

從治療的角度來說，有研究顯示雙歧桿菌可改善腸道屏障功能并降低血清內(nèi)毒素水平，從而減緩NAFLD 的進展［16］。另外，對肥胖患者采取飲食干預(yù)能夠使產(chǎn)生內(nèi)毒素的腸道菌種類比例明顯下降［17］。

表5 腸道菌群與內(nèi)毒素、肝脂肪變程度的相關(guān)性分析Table 5 Correlation analysis of intestinal flora with endotoxin and liver fat change

綜上所述，腸道菌群可通過多種途徑和機制影響NAFLD 的發(fā)病。通過優(yōu)化腸道菌群構(gòu)成，針對NAFLD 的靶向治療在動物模型中獲得一定療效，但迄今為止相關(guān)的臨床研究不足。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的進步，調(diào)節(jié)腸道菌群或可成為治療NAFLD的新方式。