基于TCGA數(shù)據(jù)集分析CDCA5在肺腺癌中的臨床意義與分子機(jī)制

王萍 黃奔 范維 柳家翠 程慶元 段怡萍 陳梁玥 馬甜甜 喻明霞★

肺癌是常見的惡性腫瘤之一，研究表明，超過半數(shù)的肺癌患者在中晚期才被確診［1］。肺癌主要包括兩種組織性類型：小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌是非小細(xì)胞肺癌中診斷最多的組織學(xué)亞型［2］。盡管在研究發(fā)病機(jī)制和治療方法方面取得了一定的進(jìn)展，肺腺癌仍然是最具侵襲性和最迅速致命的類型，其5年生存率低于20%［3］。細(xì)胞分裂周期相關(guān)5（cell division cycle associated 5，CDCA5）是在細(xì)胞分裂周期中姐妹染色單體結(jié)合和分離所必需的主要調(diào)節(jié)因子［4］。CDCA5保證了減數(shù)分裂細(xì)胞和有絲分裂細(xì)胞中染色體的精確分離，在DNA 修復(fù)中起著重要的作用［5］。研究發(fā)現(xiàn)，CDCA5與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。CDCA5被證實在乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌等癌癥中異常表達(dá)，且與癌癥患者的預(yù)后相關(guān)［6-8］。然而，關(guān)于CDCA5在肺腺癌中的表達(dá)、臨床意義、預(yù)后以及分子機(jī)制目前尚無研究報道。因此，本研究通過數(shù)據(jù)挖掘癌癥基因組圖譜（the Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，分析CDCA5在肺腺癌中的表達(dá)，探究CDCA5在肺腺癌中的表達(dá)與患者臨床病理特征的聯(lián)系，結(jié)合患者的生存資料分析其預(yù)后價值，探索其在肺腺癌中的分子作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)資料的下載與處理

在TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//portal.gdc.cancer.gov/）上下載535 例肺腺癌樣本和59 例正常肺組織樣本RNA 測序數(shù)據(jù)（HTSeq-FPKM，level 3）。使用R 3.6.1 軟件將基因表達(dá)數(shù)據(jù)歸一化處理，再進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)化用于后續(xù)分析。利用R 3.6.1 軟件提取肺腺癌樣本和正常肺組織樣本中CDCA5mRNA 的表達(dá)量用于分析比較表達(dá)水平差異。此外，在TCGA數(shù)據(jù)庫中下載肺腺癌患者的臨床資料，包括患者的年齡、性別、生存時間、生存狀態(tài)、T 分期、N 分期、M 分期、stage 分期。刪除生存時間缺失和上述任何一項臨床特征不明確的患者數(shù)據(jù)。

1.2 CDCA5 表達(dá)與患者臨床特征和預(yù)后的相關(guān)性分析

根據(jù)CDCA5在肺腺癌患者中表達(dá)水平的中位值，將肺腺癌患者劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。使用IBM SPSS Statistics 25.0 統(tǒng)計軟件分析CDCA5表達(dá)與患者的年齡、性別、T 分期、N 分期、M 分期、stage 分期的聯(lián)系。使用GEPIA 在線數(shù)據(jù)庫（http：//gepia.cancer-pku.cn/）和OncoLnc 在線數(shù)據(jù)庫（http：//www.oncolnc.org/）分析CDCA5與患者總體生存率（overall survival，OS）的關(guān)系，使用Kaplan Meier-plotter 在線數(shù)據(jù)庫（https：//kmplot.com/analysis/）分析CDCA5與患者總體生存率（overall survival，OS）和進(jìn)展后生存率（post progression survival，PPS）的關(guān)系。根據(jù)TCGA-LUAD 數(shù)據(jù)集中肺腺癌患者的生存數(shù)據(jù)，結(jié)合CDCA5的表達(dá)量，使用單因素和多因素cox 回歸分析CDCA5在肺腺癌患者中的預(yù)后價值。

1.3 基因富集分析

使用GSEA 4.0.2 軟件進(jìn)行基因富集分析。以MsigDB（Molecular Signature Database）數(shù)據(jù)庫中的c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt 數(shù)據(jù)集作為功能基因集。采用缺省加權(quán)富集統(tǒng)計的方法，隨機(jī)組合次數(shù)設(shè)1 000 次。以P＜0.05 和錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）小于0.05 的基因集作為顯著富集的基因集。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用Mann-Whitney U 檢驗分析CDCA5在肺腺癌樣本和肺正常組織樣本中的表達(dá)差異；使用卡方檢驗分析CDCA5表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性；生存分析使用log rank 檢驗；cox 比例風(fēng)險回歸模型用于評價CDCA5的預(yù)后意義。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CDCA5 在肺腺癌組織中表達(dá)顯著上調(diào)

在TCGA-LUAD 數(shù)據(jù)集中，肺腺癌組織的CDCA5表達(dá)水平顯著高于正常組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1A）。在57 對配對的肺腺癌組織和癌旁組織中分析發(fā)現(xiàn)，CDCA5在肺腺癌組織中顯著上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖1B）。在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中，共有483 例肺腺癌組織樣本、347 例正常肺組織樣本，結(jié)果也顯示CDCA5在肺腺癌組織中顯著上調(diào)表達(dá)（P＜0.05）。圖1C。

圖1 CDCA5 在肺腺癌組織和正常肺組織樣本中的表達(dá)差異分析Figure 1 Differential analysis of CDCA5 expression in lung adenocarcinoma and normal lung tissue samples

2.2 CDCA5 與肺腺癌患者臨床病理特征的聯(lián)系

相關(guān)性分析顯示CDCA5在肺腺癌患者中的表達(dá)與Stage 分期（P=0.003）和淋巴結(jié)浸潤（P=0.016）有關(guān)。見表1。

表1 CDCA5 表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性分析［n（%）］Table 1 Correlation analysis of clinical characteristics between CDCA5 expression and patients［n（%）］

2.3 CDCA5 高表達(dá)提示患者預(yù)后不良

在GEPIA 數(shù)據(jù)庫中，CDCA5的表達(dá)水平與患者的總體生存率相關(guān)，高表達(dá)提示預(yù)后不良（P=0.006）（圖2A）；OncoLnc 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示CDCA5的表達(dá)也與患者的總體生存率相關(guān)（P=0.003）（圖2B）；Kaplan Meier-plotter 數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果表明高表達(dá)的CDCA5 與肺腺癌患者的總體生存率（HR=2.04，95%CI：1.72～2.42，P＜0.05）（圖2C）和進(jìn)展后生存率（HR=1.67，95%CI：1.08～2.58，P=0.020）正相關(guān)（圖2D）。

圖2 CDCA5 與肺腺癌患者預(yù)后的相關(guān)性分析Figure 2 Prognosis analysis between CDCA5 expression and lung adenocarcinoma

在TCGA-LUAD 數(shù)據(jù)集中，單因素cox 回歸分析結(jié)果顯示，Stage 分期、T 分期、N 分期和CDCA5均可以作為肺腺癌潛在的預(yù)后因素（P＜0.001）。而多因素cox 回歸分析結(jié)果提示，只有Stage 分期（HR=1.90，95%CI：1.18～3.04，P=0.010）和CDCA5表達(dá)（HR=1.28，95%CI：1.06～1.54，P=0.010）可以作為肺腺癌的獨立預(yù)后因素。見表2。

表2 單因素和多因素cox 回歸分析Table 2 Univariate and multivariate cox regression analysis

2.4 GESA 富集分析結(jié)果

GSEA 分析結(jié)果顯示，CDCA5主要參與了22 條信號途徑（P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05）。其中包括了細(xì)胞周期、DNA 復(fù)制、錯配修復(fù)、同源重復(fù)、RNA 降解和P53 信號通路等和致癌相關(guān)的途徑。見表3、圖4。

表3 GSEA 富集分析結(jié)果Table 3 Results of GSEA enrichment analysis

圖4 CDCA5 基因高表達(dá)樣本相關(guān)富集基因集Figure 4 High expression of CDCA5 gene in samples correlated with enrichment of gene sets

3 討論

細(xì)胞分裂周期相關(guān)（cell division cycle-associated，CDCA）蛋白家族由8 個成員組成（CDCA1-8）。其中CDCA5基因位于染色體11q13.1，它在間期細(xì)胞的細(xì)胞核中表達(dá)，在有絲分裂中從染色質(zhì)中分散，并與內(nèi)聚蛋白復(fù)合物相互作用［4，9-11］。在培養(yǎng)的細(xì)胞中，敲除CDCA5會導(dǎo)致有絲分裂停滯和姐妹染色單體粘聚失?。?2］。CDCA5是姐妹染色單體粘聚和分離的主要調(diào)節(jié)因子，主要作用是穩(wěn)定姐妹染色單體，調(diào)節(jié)有絲分裂，維持基因組的完整性和穩(wěn)定性［4］。研究表明，細(xì)胞分裂過程中的障礙會導(dǎo)致癌癥的發(fā)生［13-14］，因此CDCA5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中的作用也受到了研究者的關(guān)注［15-17］。然而，目前對CDCA5在肺腺癌中的研究鮮有報道。

Phan 等研究者［6］通過利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，CDCA5在乳腺癌組織中異常表達(dá)，高表達(dá)CDCA5的患者3年生存率低于50%。在肝細(xì)胞癌組織中，CDCA5mRNA 和蛋白表達(dá)也明顯均高于正常組織，且與患者的組織學(xué)分級、腫瘤大小和TNM 分期等顯著相關(guān)［15-18］；Kaplan-Meier 生存分析顯示，CDCA5 表達(dá)升高的患者的總體生存率較短［19］。機(jī)制分析表明，CDCA5可以通過AKT 通路促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)了腫瘤發(fā)生［20］。在胃癌中，CDCA5可以通過影響Cyclin E1的表達(dá)而影響細(xì)胞周期，在胃癌的進(jìn)展中起到關(guān)鍵作用［7］。CDCA5還可以通過激活ERK 信號通路促進(jìn)結(jié)直腸癌進(jìn)展［8］。高表達(dá)的CDCA5也與上尿路和膀胱尿路上皮癌患者的疾病特異性生存（disease free survival，DSS）和無轉(zhuǎn)移生存（metastatic free survival，MeFS）顯著相關(guān)［5］。這些研究結(jié)果都表明了CDCA5在腫瘤中扮演了重要的角色，可作為人類腫瘤的新型分子標(biāo)志物。

本研究利用GESA 分析發(fā)現(xiàn)，CDCA5在肺腺癌中參與多種分子途徑，因此沉默CDCA5的表達(dá)，阻斷CDCA5介導(dǎo)的致癌途徑或許也可成為肺腺癌的治療策略。

綜上所述，CDCA5在肺腺癌中異常表達(dá)上調(diào)，并與肺腺癌患者的惡性進(jìn)展相關(guān)，高表達(dá)的CDCA5提示患者預(yù)后不良。CDCA5可以作為肺腺癌的獨立預(yù)后因素，并且有望成為肺腺癌治療的分子策略。