二代測(cè)序技術(shù)在急性髓系白血病患者預(yù)后中的應(yīng)用價(jià)值

牛曉娜 葛菲 郭宏崗 陳香麗 郭建民

急性髓系白血?。ˋcute myeloid leukemia，AML）是成人中最常見急性白血病類型，以中老年人居多。AML 發(fā)病過程中，每個(gè)群體不同時(shí)間段里經(jīng)歷不同的遺傳學(xué)改變，致使染色體核型、基因突變類型及臨床特征有很大異質(zhì)性，而這些異質(zhì)性是預(yù)后差異的基礎(chǔ)［1-2］?，F(xiàn)階段，臨床已將AML患者分子生物學(xué)層面納入危險(xiǎn)度分層系統(tǒng)，分為預(yù)后良好、預(yù)后中等、預(yù)后不良。隨著高通量基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了AML 相關(guān)基因突變及其在疾病發(fā)生中的機(jī)制，并已明確了一些特殊類型的突變或融合基因用于指導(dǎo)治療方案的制定［3-4］。本研究嘗試分析二代測(cè)序（Next-generation sequencing，NGS）技術(shù)下AML 患者基因突變情況，并探討具體基因突變類型對(duì)預(yù)后及生存狀況的影響。報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2016年1月至2018年6月確診的298例AML 患者作為研究對(duì)象，男186 例，女112 例，年齡≥45 歲120 例，年齡＜45 歲178 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合AML 診斷標(biāo)準(zhǔn)［5］；②經(jīng)骨髓和外周血細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查、流式免疫分型、骨髓活檢、染色體核型分析等檢查確診；③患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：治療相關(guān)性白血病、MDS 或MPN 轉(zhuǎn)化白血病等繼發(fā)白血病患者。研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批同意。

1.2 方法

1.2.1 檢測(cè)方法

抽取患者骨髓液4～6 mL，EDTA 抗凝，分離并收集骨髓單個(gè)核細(xì)胞，柱式抽提試劑盒提取DNA，采用AML/MDS-NGS 芯片（上海源奇生物醫(yī)藥科技有限公司）進(jìn)行基因突變檢測(cè)，涵蓋ASXL1、NPM1、

FLT3、KIT、DNMT3A、CEBPA、IDH、EZH2、TET2、RUNX1、TP53、SF3B1、PHF6、SRSF2、RAS、U2AF1、JAK等基因的熱點(diǎn)突變區(qū)域，測(cè)序深度3 000×。

1.2.2 治療方法

年齡≤60 歲者，予IA3+7 方案（去甲氧柔紅霉素8～12 mg/m2×3 d+阿糖胞苷100 mg/m2×7 d）誘導(dǎo)化療；年齡＞60 歲者，予DA3+7 方案或CAG（阿克拉霉素10～14 mg/m2×4 d+阿糖胞苷10 mg/m2，2 次/d×14 d+集落刺激因子300 μg/d）等預(yù)激方案誘導(dǎo)化療。完全緩解（CR）后進(jìn)入鞏固階段，予中、大劑量阿糖胞苷單藥至少4 個(gè)療程。

1.3 觀察指標(biāo)

①AML 基因突變頻率及分布情況。②根據(jù)《成人急性髓系白血?。ǚ羌毙栽缬琢＜?xì)胞白血?。┲袊?guó)診療指南（2017年版）》［6］中預(yù)后危險(xiǎn)度分級(jí)分為預(yù)后良好組、預(yù)后中等組、預(yù)后不良組，對(duì)比3 組臨床資料、基因突變頻率、主要基因突變類型。③基因突變與預(yù)后的關(guān)系。④伴或不伴基因突變對(duì)無病生存期、總生存期的影響。⑤不同基因突變類型對(duì)中位無病生存期的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用（±s）表示，組間比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。預(yù)后影響因素分析應(yīng)用Logistic 回歸分析；Kaplan-Meier 生存曲線分析伴基因突變、NPM1、FLT3-ITD、DNMT3A、TET2 突變陽性與患者生存期的關(guān)系，采用Log-Rank 檢驗(yàn)；P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML 基因突變頻率及分布情況

298 例AML 患者中位突變數(shù)目為兩個(gè)（0～6），其中256 例可檢測(cè)到基因突變，占85.91%；≥3 種基因突變71 例，占23.83%。突變頻率最高的前5 個(gè)基因分別為NPM1、FLT3-ITD、CEBPA、DNMT3A、TET2。見圖1。

圖1 AML 基因突變頻率及分布情況Figure 1 Frequency and distribution of AML gene mutations

2.2 3 組臨床資料、基因突變頻率

3 組初診骨髓原始細(xì)胞、附加染色體異常、伴基因突變、NPM1、FLT3-ITD、CEBPA、DNMT3A、TET2突變陽性比例比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 基因突變與預(yù)后不良的關(guān)系

將初診骨髓原始細(xì)胞、附加染色體異常等其他因素控制后，伴基因突變、FLT3-ITD、DNMT3A、TET2突變陽性仍與預(yù)后不良顯著相關(guān)（P＜0.05）；CEBPA突變陽性與預(yù)后不良無關(guān)。見表2。

表2 基因突變與預(yù)后不良的關(guān)系Table 2 Relationship between gene mutation and poor prognosis

2.4 基因突變對(duì)無病生存期、總生存期的影響

隨訪兩年，脫落8 例。伴基因突變的AML 患者中位無病生存期11.87 個(gè)月短于不伴基因突變的AML 患者15.07 個(gè)月（χ2=5.168，P=0.023）。見圖2。

圖2 基因突變對(duì)中位無病生存期的影響Figure 2 The effect of gene mutations on median diseasefree survival

2.5 不同基因突變類型對(duì)中位無病生存期的影響

Kaplan-Meier 曲線分析，NPM1突變陽性的AML 患者中位生存期14.71 個(gè)月長(zhǎng)于陰性患者11.63 個(gè)月，F(xiàn)LT3-ITD、DNMT3A、TET2突變陽性的AML 患者中位無病生存期11.06 個(gè)月、11.24 個(gè)月、11.32 個(gè)月短于FLT3-ITD、DNMT3A、TET2突變陰性的AML 患者15.73 個(gè)月、14.86 個(gè)月、14.19 個(gè)月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.223、6.277、5.341、7.552，P=0.022、0.012、0.021、0.006）。見圖3。

圖3 不同基因突變類型對(duì)中位無病生存期的影響Figure 3 The effect of different gene mutation types on median disease-free survival

3 討論

NGS 技術(shù)在大型綜合基因組分析的應(yīng)用極大提高了臨床對(duì)AML 發(fā)生、發(fā)展機(jī)制的認(rèn)識(shí)，重現(xiàn)性基因突變的不斷發(fā)現(xiàn)打開了相關(guān)機(jī)制研究的思路。2016年WHO 對(duì)AML 分類再次做了更新［7］，NPM1、CEBPA、RUNX1等突變均已被納入AML 診斷參考，為AML 做進(jìn)一步的精細(xì)分層。

現(xiàn)階段，采用NGS 技術(shù)探索AML 患者基因突變譜的大樣本數(shù)據(jù)有限，美國(guó)癌癥基因譜研究網(wǎng)絡(luò)報(bào)道病例數(shù)為200 例，歐洲多中心數(shù)據(jù)共納入1 540例患者，國(guó)內(nèi)多個(gè)研究中心，包括蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院、上海7 家綜合性醫(yī)院等［8-11］也發(fā)表了各自數(shù)據(jù)。雖然各中心檢測(cè)的目標(biāo)基因略有不同，但都基本覆蓋了NPM1、FLT3、IDH、DNMT3A、TET2、TP53、RUNX1、RAS、WT1、CEBPA等AML 常見基因。本研究與美國(guó)多中心數(shù)據(jù)22%相近，高于上海7 家綜合性醫(yī)院報(bào)道的數(shù)據(jù)13%。從基因突變結(jié)果看，AML 伴NPM1突變患者占11.62%，與國(guó)內(nèi)其他中心數(shù)據(jù)相似，但明顯低于美國(guó)人群（27%）與歐洲人群（28%）。產(chǎn)生差異的原因尚不明確，是否與患者種族、生活方式、生活環(huán)境等有關(guān)還期待更多數(shù)據(jù)支持。伴DNMT3A突變的患者占10.15%，蘇醫(yī)一附院6%，上海7 家綜合性醫(yī)院9%，均低于美國(guó)數(shù)據(jù)（26%）。研究證實(shí)，DNMT3A突變與診斷時(shí)的高白細(xì)胞、老年和不良預(yù)后有關(guān)［12］。上海7 家綜合性醫(yī)院對(duì)入組患者進(jìn)行年齡分層后發(fā)現(xiàn)，50 歲以上患者DNMT3A突變頻率是50 歲以下患者的3倍以上。蘇醫(yī)一附院患者中位年齡42 歲，而美國(guó)患者中位年齡55 歲。故推測(cè)各中心患者中位年齡可能是數(shù)據(jù)差異的原因之一。

NPMl突變?cè)诔扇薃ML 中的中位年齡偏高，血小板、白細(xì)胞數(shù)目較高，且與CD34 和CDll7 低表達(dá)相關(guān)［13］。研究顯示，NPMl突變預(yù)示化療后易達(dá)到CR［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，NPM1突變陽性者預(yù)后好。FLT3-ITD突變的AML 患者外周血骨髓原始細(xì)胞比例、白細(xì)胞數(shù)較高，CR 率和總生存率偏都偏低，復(fù)發(fā)率偏高［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)LT3-ITD基因突變是預(yù)后不良因素。DNMT3A基因貫穿造血干細(xì)胞自我更新、分化和抑癌基因失活、原癌基因激活的過程，該基因突變?cè)贏ML 發(fā)病機(jī)制中起著舉足輕重的作用。Meta 分析顯示，DNMT3A基因突變是AML 患者第一療程緩解率和總體生存率的危險(xiǎn)因素［16］。本研究結(jié)果提示，DNMT3A突變陽性提示預(yù)后不良。目前，TET2基因突變?cè)谠u(píng)估疾病預(yù)后方面尚無統(tǒng)一結(jié)論。本研究數(shù)據(jù)顯示，TET2突變陽性者生存期短，與李佳佳等［17］研究一致，但TET2基因突變易發(fā)生在年齡偏大的患者中，而年齡不同治療方案不一，故預(yù)后可能受到年齡及治療方案影響，可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)偏移，仍需擴(kuò)大樣本數(shù)排除影響因素進(jìn)行進(jìn)一步分析。

綜上可知，不同預(yù)后AML 患者基因突變頻率存在差異，伴基因突變及FLT3-ITD、DNMT3A、TET2突變陽性者生存期短，預(yù)后差，而NPM1突變陽性者與之相反。