大熊貓主食竹、糞便及血清中的短鏈脂肪酸的測定及分析

吳海蘭 李才武 李 果 潘 欣 鄧雯文張貴權(quán) 何永果 黃 炎 張和民 鄒立扣

(1.成都理工大學(xué)旅游與城鄉(xiāng)規(guī)劃學(xué)院，成都，610059；2.中國大熊貓保護研究中心大熊貓國家公園珍稀動物保護生物學(xué)國家林業(yè)和草原局重點實驗室，都江堰，611830；3.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)資源學(xué)院，成都，611130)

大熊貓(Ailuropodamelanoleuca)在長期進化過程中已特化出以竹類為食的特點，它們雖有著草食性哺乳動物的進食特點，但仍保留著典型肉食性動物的消化系統(tǒng)，其本身不能產(chǎn)生纖維素酶，也不具有編碼纖維素酶的相關(guān)基因[1]。因此，消化竹子的木質(zhì)纖維素的功能需依賴其腸道微生物來完成。短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是由腸道微生物發(fā)酵膳食纖維、碳水化合物和其他植物營養(yǎng)素在腸道中形成的碳原子數(shù)為1—6個的飽和脂肪酸，主要包含甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、異丁酸和異己酸等[2]。研究表明，SCFAs不僅能促進宿主對營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，還能降低腸道pH值，抑制致病菌的定植，促進結(jié)腸上皮細胞增殖，維持腸道完整性和調(diào)節(jié)腸道免疫等功能[3-4]。SCFAs的種類、數(shù)量主要取決于腸道內(nèi)菌群組成、消化的時間、宿主飲食中的纖維含量以及外源攝入的SCFAs。機體內(nèi)產(chǎn)生的SCFAs一部分被吸收入血液，通過血液循環(huán)參與機體內(nèi)各組織代謝，這是機體從小腸不能直接消化的碳水化合物中獲取能量的主要途徑，僅有少部分(約占總量5%—10%)逃脫吸收隨糞便排出[5]?，F(xiàn)有關(guān)大熊貓腸道研究中更多地側(cè)重于腸道微生物菌群、纖維素酶活性等，尚有關(guān)大熊貓腸道中短鏈脂肪酸的相關(guān)研究。

目前，關(guān)于測定樣品中SCFAs含量的方法多種多樣，包括高效液相色譜(HPLC)結(jié)合紫外(UV)檢測[6]、電化學(xué)檢測(ECD)[7]、質(zhì)譜(MS)[8]或氣相色譜(GC)結(jié)合火焰離子化檢測(FID)[9]和質(zhì)譜法(MS)[10]。在這些方法中，GC/MS法是生物樣品中最常用的SCFAs測定方法，具有較高的靈敏度。SCFAs極性較強，未衍生化的SCFAs在氣相色譜柱中容易產(chǎn)生吸附作用，最好進行衍生化樣品預(yù)處理，以降低這些揮發(fā)性酸的蒸發(fā)損失，提高其準確度和分離度[11]。

本研究對提取了竹子、大熊貓血清及糞便樣本中SCFAs，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC/MS)方法對苦竹、大熊貓糞便以及血清中SCFAs進行檢測，研究發(fā)現(xiàn)苦竹不同部位SCFAs的含量存在明顯差異。大熊貓采食竹子不同部位，其所含的SCFAs的含量不同，可對腸道以及機體發(fā)育產(chǎn)生一定的生理作用。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

收集苦竹(Pleioblastusamarus)樣本共9個，包括竹葉、竹筍和竹竿各3個(每個樣本由3個樣品混合均勻)；圈養(yǎng)大熊貓新鮮糞便樣本6個，血清樣本3個。

1.2 試劑

甲酸、乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、2-甲基丁酸、戊酸、2-甲基戊酸、4-甲基戊酸、正己酸、正庚酸和磷酸氫二鈉購買于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。乙酸-d4同位素購買于劍橋同位素實驗室公司。2，3，4，5，6-五氟溴芐(PFBBr)、丙酮和正己烷購于西格瑪-奧德里奇公司。

1.3 短鏈脂肪酸提取和衍生

樣本用液氮研磨成粉末，稱取50 mg左右的竹筍(或竹葉或糞便或100 mg的竹竿)，加入170 μL水、30 μL的0.5M的Na2HPO4溶液、100 μL的100 μg/mL乙酸-d4內(nèi)標溶液和600 μL的PFBBr丙酮溶液。60℃水浴反應(yīng)40 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入200 μL的正己烷。3 000 g離心15 min，移取上層正己烷相進行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

取100 μL解凍的血清樣本，加入70 μL水、30 μL的0.5 M的Na2HPO4溶液、100 μL的100 μg/mL乙酸-d4內(nèi)標溶液和600 μL的PFBBr丙酮溶液。60℃水浴反應(yīng)40 min。反應(yīng)結(jié)束后，加入200 μL的正己烷。3 000 g離心15 min，移取上層正己烷相進行氣相色譜-質(zhì)譜分析。

1.4 標準曲線制備

制備1 mg/mL的水溶液的12種短鏈脂肪酸混標，梯度稀釋得到0.001—0.500 mg/mL混標溶液。取20 μL梯度稀釋的混標、加入150 μL水、30 μL的0.5 M的Na2HPO4溶液、100 μL的100 mg/mL乙酸-d4內(nèi)標溶液和600 μL的PFBBr丙酮溶液。余下步驟同樣本制備。

1.5 氣相色譜-質(zhì)譜檢測分析

采用美國安捷倫公司的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(型號7890A/5975C)和德國MACHEREY-NAGEL公司 OPTIMA WAXplus?熔融硅毛細管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)對衍生的樣本進行短鏈脂肪酸定量檢測分析。載氣為高純(純度大于99.999%)氦氣，流速1 mL/min。采用梯度升溫程序?qū)颖具M行分離分析。梯度升溫程序為：起始爐溫為60℃并維持2 min，以20℃/min升到100℃，以2℃/min升到110℃，以10℃/min升到160℃，繼續(xù)以20℃/min升到240℃并維持2 min。樣本以無分流模式進樣1 μL，溶劑延遲時間設(shè)定為9 min。進樣口、傳輸線和電子碰撞(EI)電離源溫度分別設(shè)定為250℃、250℃和230℃。EI能量設(shè)定為70電子伏。采用選擇離子模式對數(shù)據(jù)進行采集。

2 結(jié)果與分析

2.1 SCFAs色譜圖

將樣品按照上述色譜條件下進行測定，確定各種酸的保留時間以及定量離子質(zhì)荷比，結(jié)果如表1所示。樣品中12個短鏈脂肪酸分別是甲酸、乙酸、異丁酸、丙酸、2-甲基丁酸、丁酸、異戊酸、2-甲基戊酸、戊酸、己酸、庚酸、4-甲基戊酸。SCFAs總離子流圖譜如圖1所示，能夠同時分離12種不同的SCFAs，且在圖譜中分離良好，內(nèi)標物乙酸-d4與其他目標峰位相近且分離度良好，互相之間無干擾，適合SCFAs 的分離和鑒定。

2.2 定量分析方法學(xué)考察

將12種SCFAs配制成不同級別的混合標準溶液，以標準品濃度x(μg/mL)為橫坐標，以對照品與內(nèi)標物的峰面積之比為縱坐標繪制標準曲線，通過繪制所得的曲線進而得到線性相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表2所示。各標準品峰面積與濃度線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均達到0.999，相對標準偏差為5.12%—8.82%(n=6)。

表1 12種短鏈脂肪酸的保留時間Tab.1 Retention times of 12 short-chain fatty acids

表2 12種短鏈脂肪酸的線性回歸方程，相關(guān)系數(shù)，線性范圍和相對標準偏差Tab.2 Linear regression equation，correlation coefficient，linear range and relative standard deviation of 12 kinds of short-chain fatty acids

續(xù)表2

2.3 竹子中SCFAs含量

采用該方法進一步測定苦竹、大熊貓糞便和血清樣品中的SCFAs含量，4-甲基戊酸含量在定量限以下，各樣本中難以檢測出。苦竹所有樣本中檢測到的主要SCFAs包括乙酸、甲酸、正己酸和丙酸，其平均含量分別為61.39、42.06、8.43和6.30 μg/g(圖2A)。從表3可以看出SCFAs在苦竹不同部位中的分布存在明顯差異，除竹筍中異丁酸、2-甲基丁酸、丁酸、異戊酸的含量較竹葉和竹稈高外，其余SCFAs都以竹葉中含量較高，竹稈中各SCFAs含量都較低(圖2B)。

表3 苦竹不同部位中SCFAs的含量Tab.3 Content of SCFAs in different parts of bitter bamboo

續(xù)表3

2.4 大熊貓糞便中SCFAs含量

糞便樣品中檢測到的主要SCFAs包括乙酸、甲酸、丙酸、異丁酸和丁酸，其平均含量分別為152.37、61.76、3.92、1.11和0.88 μg/g；2-甲基戊酸和戊酸含量較低(圖3)。

2.5 大熊貓血清中SCFAs含量

血清樣本中檢測到的主要SCFAs包括甲酸、乙酸、丙酸和正庚酸，其平均含量分別為7.32、4.71、3.24和0.74 μg/mL；異戊酸和戊酸含量較低(圖4)。其中甲酸含量較高，這可能與生物體腸道內(nèi)所產(chǎn)生相應(yīng)的SCFAs以及被吸收利用的比例有關(guān)。

3 討論

3.1 主食竹、糞便和血清中短鏈脂肪酸的GC/MS分析

SCFAs生理活性較強，是維持生物體腸道健康和體內(nèi)環(huán)境平衡的重要物質(zhì)，并能發(fā)揮多種腸道和系統(tǒng)性效應(yīng)。生物體內(nèi)的SCFAs含量受腸道微生物群與飲食之間的復(fù)雜相互作用影響[12-14]。近年來，越來越多的研究確定了SCFAs在腸道微生物群、飲食和宿主之間相互作用中的重要作用[15]。由于SCFAs易揮發(fā)，從而導(dǎo)致樣品定量不準確，重復(fù)性差。本文中采用將樣品進行PFBBr衍生化后提取，并通過用正己烷萃取實現(xiàn)衍生化產(chǎn)物的最佳提取效率。在上述內(nèi)容的基礎(chǔ)上，建立了對大熊貓主食竹、糞便和血清樣本中12種SCFAs檢測的GC/MS定量方法，并進行了方法學(xué)考證。結(jié)果表明12種 SCFAs的標準曲線均具有良好線性，R2均大于0.999，且相對標準偏差(RSD)低，表現(xiàn)出良好的重復(fù)性和精密度。

3.2 主食竹不同部位中SCFAs的含量差異及其生理作用

研究表明，在苦竹不同部位中主要的SCFAs含量存在差異。除竹筍中異丁酸、2-甲基丁酸、丁酸、異戊酸的含量較竹葉和竹莖高外，其余的SCFAs都以竹葉中含量最高。竹筍中丁酸可轉(zhuǎn)化為β-羥丁酸而為機體供能，2-甲基丁酸、異戊酸和異丁酸合稱為異位酸，異位酸不僅能促進機體腸胃對食物中結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解[16]，還能促進纖維降解菌群的生長，從而有利于纖維物質(zhì)的消化。除此，2-甲基丁酸可以提高食物的適口性，也有研究表明在雌性泌乳中期食物中添加異丁酸，可使產(chǎn)奶量和體重增加[17]。這表明竹筍對于大熊貓而言不僅適口性好，營養(yǎng)價值高利于消化，且在雌性泌乳撫育幼仔期，采食竹筍有利于產(chǎn)奶以及補充體能。

竹葉中乙酸、甲酸、正己酸和丙酸含量較高，從苦竹中檢測出的主要SCFAs含量與在生物體內(nèi)起主要生理作用SCFAs的生成順序乙酸>丙酸>丁酸相似[18]。乙酸到達門靜脈循環(huán)，隨血液進入全身循環(huán)作為周邊組織的能源。丙酸作為糖異生前體物質(zhì)產(chǎn)生的葡萄糖能滿足動物30%—50%的能量需求，乙酸、丙酸和丁酸被腸黏膜上皮細胞吸收后均能作為其重要的能量來源[19]。Tong 等[20-21]研究表明，丙酸、丁酸等能增加腸上皮細胞密切連接蛋白ZO-1等的表達，減少促炎因子的生成，有利于黏膜炎癥的修復(fù)以增強腸黏膜的機械屏障功能?？苌萚22]研究發(fā)現(xiàn)，食物中添加丁酸鈉可以促進動物斷奶后的生長以及提高腸道消化酶活性。成年大熊貓因其腸道發(fā)育的完整性以及腸道微生物群落的豐富性[23]，竹竿是其常食部分，斷奶后的幼體和衰老個體，以竹葉為主食，竹葉中富含的乙酸、丙酸和丁酸，不僅有利于這些腸道發(fā)育不足或年老的個體對竹子中纖維素的消化，從而保證腸道功能的完整性，還能減少相關(guān)疾病的發(fā)生。目前大多研究僅停留在乙酸、丙酸、丁酸3種短鏈脂肪酸對于機體生理作用的探究，關(guān)于樣本中含量較高的甲酸以及其他短鏈脂肪酸在機體中發(fā)揮什么作用仍需進一步的探索。

3.3 短鏈脂肪酸在主食竹、糞便以及血清中相關(guān)性分析

糞便與血清中主要以甲酸和乙酸為主，腸道中產(chǎn)生的主要SCFAs在吸收進入血液循環(huán)系統(tǒng)前，大量的丙酸、丁酸會被形成腸壁的腸細胞吸收，從而用于生產(chǎn)能量。部分吸收未被消耗的SCFAs，例如乙酸則通過基底外側(cè)膜釋放到肝門靜脈，并通過肝臟進入血液到達全身循環(huán)，外周肌肉組織通過代謝這些未改變的脂肪酸以產(chǎn)生能量[24]，其余未被吸收或逃脫吸收的SCFAs則隨糞便排出。因此，糞便與血清中SCFAs的含量與機體腸道內(nèi)產(chǎn)生的SCFAs密切相關(guān)。現(xiàn)有研究表明，生物體腸道內(nèi)SCFAs的總量與外源添加SCFAs和日糧纖維的含量成正相關(guān)性[25]。竹子作為大熊貓的主食，大量的纖維素和木質(zhì)素又屬于不溶性纖維，具有高度的可發(fā)酵性，能在生物體腸道中產(chǎn)生更多的SCFAs[26]，其自身富含的SCFAs也能為機體補充相應(yīng)的SCFAs。糞便以及血清中的SCFAs濃度在一定程度上可反映腸道產(chǎn)生的SCFAs濃度，因此，竹子中的短鏈脂肪酸與糞便、血清中的短鏈脂肪酸具有一定的相關(guān)性。

4 結(jié)論

本文利用GC/MS方法，對于苦竹、大熊貓糞便及血清中的短鏈脂肪酸進行分析及測定。研究發(fā)現(xiàn)苦竹中SCFAs的含量在其不同部位存在差異，這些SCFAs對大熊貓機體產(chǎn)生一定的生理作用，能促進大熊貓腸道對竹子中的纖維素的消化以及營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，維持腸道健康等功能。研究探討了苦竹、大熊貓糞便及血清中的SCFAs存在的相關(guān)性，以上結(jié)果能為進一步研究探討大熊貓食性研究提供了數(shù)據(jù)支撐。后續(xù)需結(jié)合大熊貓腸道中產(chǎn)生的SCFAs來進一步驗證主食竹、血清以及糞便中SCFAs含量的相關(guān)性，以及腸道中SCFAs的生理作用。