GeneXpert 技術(shù)對(duì)耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因分析

王 維， 王 林， 樊清清， 趙 亞

（1.西安市兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710003； 2.西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，西安 710002；3.西安市第一醫(yī)院藥劑科，西安 710002）

腸桿菌科細(xì)菌是醫(yī)院感染性疾病的主要致病菌，在免疫缺陷患者中易引起嚴(yán)重感染[1]。碳青霉烯類藥物如亞胺培南、美羅培南、厄他培南因其抗菌譜廣、抗菌作用強(qiáng)，已成為治療腸桿菌感染最強(qiáng)效β-內(nèi)酰胺類藥物。但近年來，長(zhǎng)期、大量、不規(guī)范使用該類抗生素導(dǎo)致對(duì)其耐藥的腸桿菌科細(xì)菌數(shù)量增加，使臨床抗感染治療面臨嚴(yán)峻的考驗(yàn)[2]。腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥復(fù)雜，其中最重要是產(chǎn)碳青霉烯酶，按照Ambler 分類法，編碼碳青霉烯酶的耐藥基因主要分為A、B、D 三類，其中最流行的碳青霉烯類型包括KPC、NDM、IMP-1、VIM、OXA-48 等[3-6]。

GeneXpert 分子檢測(cè)平臺(tái)是一種半巢式實(shí)時(shí)熒光PCR 體外檢測(cè)系統(tǒng)，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)細(xì)菌培養(yǎng)法及傳統(tǒng)PCR 方法檢測(cè)周期長(zhǎng)、靈敏度差等缺陷[7]，且結(jié)果的穩(wěn)定性好，已廣泛應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的利福平耐藥基因、耐甲氧西林金黃葡萄球菌（MRSA）、耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE）耐藥基因等的檢測(cè)[8]。本文采用GeneXpert 技術(shù)方法，分析西安市第一醫(yī)院CRE 細(xì)菌耐藥基因表型，為指導(dǎo)臨床合理用藥以及預(yù)防和控制CRE的感染和暴發(fā)流行提供參考。

1 資料與方法

1.1 材料

菌株取自2017年3月至2019年3月西安市第一醫(yī)院微生物室從不同病區(qū)各種臨床標(biāo)本中培養(yǎng)出的耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌、大腸埃希菌等CRE 共70 株，剔除同一患者重復(fù)菌株；GeneXpert 微生物快速檢測(cè)系統(tǒng)、Xpert Carba-R試劑盒（美國(guó)賽沛公司）；全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)VITEK2 Compact、比濁儀、藥敏板卡AST-GN09、AST-N335（法國(guó)梅里埃生物制品有限公司）；血瓊脂培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基（鄭州安圖生物工程股份有限公司）；基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國(guó)布魯克公司）；生物安全柜、細(xì)菌培養(yǎng)箱（上海力康公司）。

1.2 方法

1.2.1 菌種鑒定及藥敏 采用基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀對(duì)收集的菌株進(jìn)行鑒定復(fù)核。采用Vitek 2-Compact 全自動(dòng)微生物鑒定及藥敏分析系統(tǒng)進(jìn)行藥敏MIC 法實(shí)驗(yàn)，藥敏結(jié)果采用CLSI2018 標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判斷，質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

1.2.2 GeneXpert 法檢測(cè)耐藥基因 將已復(fù)蘇培養(yǎng)的菌株配制成0.5 麥?zhǔn)蠁挝痪鷳乙?，?0 μL加至試劑盒樣本處理液中，經(jīng)漩渦震蕩后，吸取約1.7 mL 混合液沿管壁加入試劑盒內(nèi)，啟動(dòng)檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

藥敏結(jié)果采用Whonet 5.6 軟件進(jìn)行分析。其他數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)數(shù)資料采用率或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 菌株分布

70 株分離菌株以肺炎克雷伯菌最為多見，共分離出26 株，占37.14%；其次是大腸埃希菌15株，占21.43%；弗氏枸櫞酸桿菌7 株，占10.00%；陰溝腸桿菌和產(chǎn)酸克雷伯菌各6 株，各占8.57%；其他菌株10 株，占14.28%。

2.2 標(biāo)本分布

標(biāo)本來源以痰液為主，共有41 株，占58.57%；其次為尿液和血液，均有13 株，占18.57%；膽汁3株，占4.28%。

2.3 科室分布

CRE 菌株康復(fù)重癥醫(yī)學(xué)科分離最多，共有20株，占28.57%；其次為神經(jīng)外科和呼吸內(nèi)科各13株，各占18.57%；泌尿外科10 株，占14.28%；消化內(nèi)科5 株，占7.14%；其他科室9 株，占12.86%。

2.4 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

藥敏結(jié)果提示CRE 對(duì)大部分β-內(nèi)酰胺類藥物呈現(xiàn)高度耐藥性，耐藥率＞80%，對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、妥布霉素耐藥率分別為63%、63%、63%、66.7%，對(duì)阿米卡星有較好的敏感性，敏感率為56.0%，未分離到粘菌素耐藥的菌株。見表1。

表1 70 株CRE 菌株藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果（%）

2.5 CRE 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

GeneXpert 方法檢測(cè)5 種耐藥基因結(jié)果顯示，攜帶碳青霉烯酶共57 株，占81.42%；其中，攜帶KPC 酶36 株，占51.43%；攜帶NDM 酶33 株，占47.14%；攜帶IMP-1 酶4 株，占5.71%；未攜帶可檢測(cè)碳青霉烯酶13 株，占18.57%。攜帶單一KPC酶22 株，占31.43%；攜帶單一NDM酶20 株，占28.57%；攜帶單一IMP-1 酶1 株，占1.43%；同時(shí)攜帶KPC和NDM 酶11 株，占14.28%；同時(shí)攜帶KPC 和IMP-1 酶1 株，占1.43%；同時(shí)攜帶IMP-1、KPC 和NDM酶2 株，占2.86%；其余型耐藥基因未檢出。質(zhì)控菌株ATCC25922 未檢出耐藥基因。見表2。

表2 70 株CRE 菌株耐藥基因檢出情況

2.6 檢出耐藥基因數(shù)與患者預(yù)后分析結(jié)果

患者不同預(yù)后情況中，CRE 菌株耐藥基因檢出情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 CRE 菌株耐藥基因檢出情況與患者預(yù)后分析［例（%）］

3 討論

腸桿菌科細(xì)菌是院內(nèi)感染的重要病原菌，可通過多種途徑進(jìn)行傳播，碳青霉烯類抗菌藥具有較好的通透性和廣譜抗菌活性，是目前治療革蘭陰性桿菌效果較好的抗菌藥物。但是隨著該類藥物在臨床上的廣泛，CRE 菌株的檢出率呈逐年快速上升趨勢(shì)[9]。本文結(jié)果顯示，西安市第一醫(yī)院2017年3月至2019年3月共分離出70 株CRE，CRE 菌株以肺炎克雷伯菌為主，其次是大腸埃希菌，弗勞地枸櫞酸桿菌、陰溝腸桿菌、產(chǎn)酸克雷伯菌所占比例較低，與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[10-11]。本文資料中CRE 菌株標(biāo)本來源多樣，以呼吸、泌尿系統(tǒng)來源最多，與Zhang[10]等報(bào)道相似，符合腸桿菌科細(xì)菌的感染分布特點(diǎn)[12]。標(biāo)本主要來源于康復(fù)重癥醫(yī)學(xué)科、神經(jīng)外科、呼吸內(nèi)科等重癥科室，此類科室患者病情嚴(yán)重，接受侵入性操作較多，免疫力較低下，加之長(zhǎng)期應(yīng)用抗生素治療增加耐藥菌株感染的機(jī)會(huì)，因此提示臨床應(yīng)合理使用抗生素，避免重復(fù)給藥等行為的發(fā)生。

藥敏結(jié)果顯示，CRE 菌株對(duì)大多數(shù)抗菌藥物耐藥嚴(yán)重，特別是對(duì)β-內(nèi)酰胺類藥物呈現(xiàn)高度耐藥，耐藥率＞80%，對(duì)亞胺培南和美羅培南的耐藥率均為92.6%；對(duì)環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、復(fù)方新諾明、妥布霉素的耐藥率分別為63%、63%、63%、66.7%；對(duì)阿米卡星敏感性尚可，敏感率為56.0%，該結(jié)果與2017 CHINET 中國(guó)耐藥性監(jiān)測(cè)結(jié)果一致[13]，當(dāng)藥物缺乏或病情相對(duì)較輕時(shí)，可考慮應(yīng)用阿米卡星等藥物。多黏菌素被認(rèn)為是治療CRE最有效的抗菌藥物，目前未發(fā)現(xiàn)分離到多粘菌素耐藥菌株的報(bào)道?？咕幬锏穆?lián)合應(yīng)用（如多粘菌素類或阿米卡星聯(lián)合碳青霉烯類等）的療效均優(yōu)于單藥治療[14-15]。

腸桿菌科細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)生碳青霉烯酶，碳青霉烯酶可按β-內(nèi)酰胺酶家族Ambler 分類分為A、B、D 類。A 類最具有代表意義的酶型是KPC，也是最具有臨床意義的酶型。B 類主要包括NDM、IMP-1、VIM等。D 類主要為OXA-48[3-6]。本研究選取5種最常見基因（KPC、NDM、IMP-1、VIM、OXA-48）應(yīng)用GeneXpert 技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示70 株CRE菌株檢測(cè)出碳青霉烯酶基因57 株，陽(yáng)性率為81.42%。其中KPC 型36 株、NDM 型33 株、IMP-1型4 株，未檢出VIM 和OXA-48 型，提示腸桿菌科細(xì)菌產(chǎn)碳青霉烯酶的主要耐藥基因?yàn)镵PC 和NDM，與文獻(xiàn)[16]報(bào)道以NDM 型為主的結(jié)果存在差異，其原因可能與菌株來源及地理?xiàng)l件等因素有關(guān)[17]。經(jīng)臨床回訪，是否檢出耐藥基因、檢出耐藥基因數(shù)量、是否為單一耐藥基因?qū)颊卟∏檗D(zhuǎn)歸無顯著性差異。

綜上所述，CRE 菌株由于具有復(fù)雜的耐藥機(jī)制，常表現(xiàn)為對(duì)多種抗菌藥物耐藥嚴(yán)重，本文基于GeneXpert 技術(shù)的快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)對(duì)CRE 的基因分型和耐藥特征進(jìn)行分析，為全面了解醫(yī)院CRE 菌株的耐藥現(xiàn)狀及耐藥機(jī)制提供了依據(jù)。為防止耐藥菌株的產(chǎn)生，臨床需根據(jù)藥敏結(jié)果合理使用抗菌藥物，同時(shí)要做好隔離防護(hù)和手衛(wèi)生，以防止耐藥株傳播流行[18-19]。