PTEN、Ki-67 在兒童非霍奇金淋巴瘤中的表達(dá)和意義

黃寧波， 高文衛(wèi)， 梁 軍， 朱 萌， 趙 仁

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，銀川 750004）

淋巴瘤是免疫系統(tǒng)惡性腫瘤之一，兒童淋巴瘤以非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）最為常見，具有惡性程度高、臨床分期晚、全身播散廣、侵襲性強(qiáng)、結(jié)外侵犯多、耐藥性強(qiáng)等特點(diǎn)。近年來，隨著傳統(tǒng)化療方案的不斷完善和造血干細(xì)胞移植技術(shù)的逐漸成熟，以及多種腫瘤靶向藥物的應(yīng)用，兒童NHL 在得到正確的分子分型之后，其5年無事件存活率提高至70%～90%[1]。造成患兒治療失敗、進(jìn)展和復(fù)發(fā)最主要的原因是化療耐藥和藥物耐受，因此尋找新的化療藥物和分子靶點(diǎn)是改善CHL 患兒預(yù)后、開展個體化治療的關(guān)鍵因素。研究發(fā)現(xiàn)，第10 染色體同源丟失性磷酸酶-張力蛋白酶（phosphatase and tensin homolog deleted in chromosome 10，PTEN）基因在多種腫瘤如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、成人淋巴瘤中均存在失表達(dá)或缺失，能調(diào)控多種信號通路發(fā)揮促凋亡、影響腫瘤血管生成、抑制增殖等抑癌作用[2-3]。Ki-67 屬于核抗原，凡進(jìn)入增殖周期的細(xì)胞都具有此DNA 復(fù)制時(shí)所需的蛋白，故被臨床作為評估腫瘤細(xì)胞增殖活性的良好指標(biāo)之一[4]。本研究采用免疫組織化學(xué)（SP 法）檢測PTEN、Ki-67 在兒童NHL 中的表達(dá)情況，并結(jié)合患兒的臨床病理特征進(jìn)行相關(guān)性分析，旨在了解二者與兒童NHL 發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，為臨床NHL 的診斷、預(yù)后判斷及靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年2月至2017年12月在寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院接受手術(shù)切除并經(jīng)病理確診的42例NHL 患兒為觀察組，其中男性28例，女性14例，年齡1～14 歲，平均年齡（7.79±1.22）歲，≤7歲者16例，＞7 歲者26例；細(xì)胞類型：T 細(xì)胞型23例（間變大細(xì)胞型8例，T 淋巴母細(xì)胞型7例，未分型8例），B 細(xì)胞型19例（B 淋巴母細(xì)胞型4例，Burkitt 細(xì)胞型9例，彌漫性大B 細(xì)胞型4例，未分型2例）；血清乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）水平：正常（80～250 U·L-1）14例，增高（＞250 U·L-1）28例。臨床分期：Ⅰ～Ⅱ期7例，Ⅲ～Ⅳ期35例。另選取同期接受手術(shù)切除治療的淋巴結(jié)反應(yīng)性增生（lymph node reactive hyperplasia，RH）患兒42例為對照組，其中男性30例，女性12例；年齡1～14 歲，平均年齡（7.73±1.18）歲。兩組患兒均為首次進(jìn)行手術(shù)治療，且術(shù)前未接受化學(xué)及放射治療。兩組患兒年齡、性別差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。本研究經(jīng)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 臨床病理資料

包括患兒性別、年齡、免疫分型、全身癥狀（包括發(fā)熱、消瘦、盜汗、瘙癢等）、首發(fā)部位、結(jié)外受累、LDH、臨床分期、國際預(yù)后指數(shù)（international prognostic index，IPI）等，其中IPI 用于評價(jià)患者預(yù)后，評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)如下：根據(jù)進(jìn)展性淋巴瘤發(fā)展，IPI 適用于全部類型淋巴瘤，可作為淋巴瘤治療反應(yīng)、復(fù)發(fā)、生存情況的一個預(yù)后評估因子。根據(jù)下列選項(xiàng)判斷得分，每個特點(diǎn)1 分：年齡＞60 歲，分期為Ⅲ期或Ⅳ期，≥2 個結(jié)節(jié)外病變，全身狀態(tài)評分≥2 分，血清LDH 表達(dá)升高。根據(jù)得分將患者分為4 個不同預(yù)后危險(xiǎn)程度的組群：0 或1分為低度危險(xiǎn)，2 分為低中度危險(xiǎn)，3 分為中高度危險(xiǎn)，4 或5 分為高度危險(xiǎn)[5]。將其中低度危險(xiǎn)與低中度危險(xiǎn)者合為低度危險(xiǎn)，中高度危險(xiǎn)與高度危險(xiǎn)者合為高度危險(xiǎn)。

1.3 免疫組織化學(xué)（SP 法）

采用SP 法對兩組石蠟包埋組織標(biāo)本進(jìn)行PTEN、Ki-67 染色。切片厚度4 μm，每個蠟塊切取2 張，置于電熱恒溫培養(yǎng)箱（60℃～70 ℃）烤片24 h。次日切片用二甲苯脫蠟3 次，每次15 min，無水乙醇浸泡2 次，每次10 min，并依次放入濃度為95%、80%、70%的乙醇溶液，各5 min，流水沖洗后再用磷酸鹽緩沖液（phosphatebuffered saline，PBS）液（pH=7.4）沖洗3 次，每次3 min。高壓鍋熱修復(fù)，將切片置于1 mM 檸檬酸緩沖液（pH=6.0）中，100 ℃煮沸2 min，取出后流水沖洗，再用PBS 液沖洗3 次，每次3 min。除去PBS 液，加3%的H2O2室溫下避光孵育10 min，PBS 液沖洗3 次，每次3 min。除去PBS 液，滴加一抗工作液，4 ℃過夜孵育。次日取出用PBS 液沖洗3 次，每次3 min。除去PBS 液，滴加二抗工作液，室溫孵育30 min，PBS 液沖洗3次，每次3 min。滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色劑，鏡下觀察著色后流水沖洗2 次，加蘇木素復(fù)染10～20 s，PBS 返藍(lán)后流水沖洗，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1.4 結(jié)果判斷

陰性對照采用PBS 代替一抗，并用已知陽性表達(dá)的NHL 標(biāo)本作為陽性對照。采用OLYMPUS公司的光學(xué)顯微鏡對標(biāo)本進(jìn)行觀察。PTEN 以細(xì)胞質(zhì)、胞漿或/和細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒呈現(xiàn)為陽性，Ki-67 以細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒呈現(xiàn)為陽性。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞率判斷特異性免疫反應(yīng)強(qiáng)度，陰性（-）：陽性細(xì)胞＜0.5%；弱陽性（+）：陽性細(xì)胞數(shù)5%～25%，胞漿內(nèi)淺棕黃色反應(yīng)均勻分布；中度陽性（++）：陽性細(xì)胞數(shù)25%～50%，胞漿內(nèi)均勻分布深棕黃色顆粒；強(qiáng)陽性（+++）：陽性細(xì)胞數(shù)＞50%，胞漿內(nèi)呈棕黑色反應(yīng)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)及率（%）表示，PTEN、Ki-67表達(dá)與NHL 患兒臨床病理因素的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)及Fisher 確切概率法，PTEN 與Ki-67 表達(dá)的相關(guān)性分析采用雙變量Pearson 相關(guān)性檢驗(yàn)，PTEN、Ki-67 表達(dá)檢測用于MHL 患兒的一致性分析采用交叉表Kappa 一致性檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 PTEN、Ki-67 在NHL、RH 中的表達(dá)情況

PTEN 在NHL 患兒組織中，可見陽性細(xì)胞分布范圍更廣，染色著色程度更強(qiáng)；在RH 患兒組織中，雖有陽性細(xì)胞分布，但陽性細(xì)胞分布情況不及NHL 患兒組織，且染色著色強(qiáng)度相對弱。Ki-67 在NHL 患者組織中，可見細(xì)胞著色染色程度更強(qiáng)，染色范圍更廣，陽性細(xì)胞著色數(shù)目更多；在RH 患兒組織中，可見細(xì)胞著色染色程度不及NHL 患者組織，陽性細(xì)胞著色數(shù)目較少，見圖1。觀察組中PTEN 和Ki-67 在NHL 陽性表達(dá)率均高于對照組（P均＜0.05），見表1。

表1 PTEN 與Ki-67 在RH 和NHL 組織中的表達(dá)比較［例（%）］

2.2 PTEN、Ki-67 表達(dá)與NHL 患兒臨床病理因素的關(guān)系

PTEN、Ki-67 在不同水平LDH 患兒中的陽性表達(dá)率不同，PTEN 在LDH 正常者中表達(dá)率高，而Ki-67 在LDH 增高者中表達(dá)率高（P均＜0.05）；PTEN、Ki-67 在不同IPI 危象度分級患兒中的陽性表達(dá)率亦不相同，PTEN 在IPI 低度危險(xiǎn)者中表達(dá)率高，而Ki-67 在IPI 高度危險(xiǎn)者中表達(dá)率高（P均＜0.05）。不同性別、年齡、免疫分型、全身癥狀、首發(fā)部位、結(jié)外受累、臨床分期NHL 患兒PTEN、Ki-67 表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見表2。

表2 PTEN 和Ki-67 表達(dá)與NHL 患兒臨床病理因素的關(guān)系［例（%）］

2.3 NHL 組織中PTEN 與Ki-67 表達(dá)的關(guān)系

NHL 組織中26例Ki-67 陽性者，檢出PTEN陽性17例（65.38%），陰性9例（34.62%）；16例Ki-67 陰性者，檢出PTEN 陽性3例（18.75%），陰性13例（81.25%）。采用Person 相關(guān)分析，NHL 組織中PTEN 與Ki-67 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.645，P＜0.001），二者在NHL 組織中檢測的一致性好（Kappa 值=0.4325，P=0.003）。

3 討論

兒童非霍奇金淋巴瘤包括高度成熟的B 細(xì)胞淋巴瘤［伯基特淋巴瘤（BL）、彌漫性大B 細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）、原發(fā)性縱隔大B 細(xì)胞淋巴瘤（PMLBCL）、間變性大細(xì)胞淋巴瘤（ALCL）和淋巴母細(xì)胞性T 細(xì)胞淋巴瘤（LL）[6]。不同病理類型的NHL預(yù)后不盡相同?？傮w來說，新型生物制劑，如分子靶向藥物是改善NHL 患兒預(yù)后，提高長期無進(jìn)展存活率的重要因素。在不增加藥物后期效應(yīng)的情況下研究NHL 相關(guān)分子表達(dá)的異常是開展分子靶向治療的前提和基礎(chǔ)，也為更精確地個體化治療提供更理想的生物標(biāo)記物。本研究中著重探討兩個重要指標(biāo)PTEN 和Ki-67 在NHL 病理組織中的表達(dá)，以及二者的相關(guān)性和預(yù)后價(jià)值，評估其作為生物標(biāo)志物對NHL 疾病進(jìn)展預(yù)測和分子靶點(diǎn)的潛力。

PTEN 基因在腫瘤中有不同程度的突變?nèi)笔?，與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展及預(yù)后不良密切關(guān)系，其具有蛋白磷酸酶與脂質(zhì)磷酸酶兩種活性，屬抑癌基因，可經(jīng)多種途徑如MAPK、PI3K/Akt 信號通路等調(diào)控細(xì)胞的增殖分化、生長凋亡及聚集黏附等[6-7]。研究顯示，PTEN 基因主要通過：（1）激活PI3K/Akt 通路，引起細(xì)胞體積增大、腫瘤血管生成、分裂增加、凋亡阻滯等[8]；（2）抑制FAK/P130C 磷酸化，下調(diào)整合素信號傳遞，抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲、擴(kuò)散[9-10]；（3）促進(jìn)細(xì)胞自噬；（4）激活PI3K-AKT-MAM 途徑，當(dāng)PTEN 表達(dá)缺失時(shí)可造成T 細(xì)胞過度增殖，可能在NHL 的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究檢測PTEN在NHL 患兒淋巴結(jié)組織中的表達(dá)，并與同期RH 淋巴結(jié)進(jìn)行比較，顯示PTEN 的表達(dá)水平異常，兩者相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但本組標(biāo)本中PTEN 在NHL組織中的陽性表達(dá)率高于RH 組，造成這種偏差的原因可能與入組病例數(shù)、分子分型比例、檢測方法、檢測試劑等因素有關(guān)。后期仍需要擴(kuò)大樣本量，嚴(yán)格入組篩選標(biāo)準(zhǔn)，利用多重檢驗(yàn)方法等進(jìn)一步考察PTEN 的差異性表達(dá)。PTEN 表達(dá)與NHL 患兒臨床病理因素的分析顯示，NHL 中PTEN 表達(dá)與LDH 水平、IPI 危象度分級存在相關(guān)關(guān)系，提示PTEN 基因異常表達(dá)與NHL 患兒體內(nèi)腫瘤負(fù)荷、惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)、腫瘤進(jìn)展、預(yù)后不良等存在密切關(guān)系。

Ki-67 是一種與細(xì)胞分裂增殖有關(guān)的核蛋白，其表達(dá)量隨細(xì)胞周期不同而發(fā)生改變，是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞增殖標(biāo)記之一。腫瘤屬細(xì)胞周期性疾病，在其發(fā)生發(fā)展過程中，細(xì)胞周期的失控發(fā)揮著重要的作用。細(xì)胞周期是一種受到嚴(yán)格調(diào)控、有序且復(fù)雜的過程，細(xì)胞能經(jīng)G2/M 期限制點(diǎn)和G1/S 期限制點(diǎn)確保細(xì)胞的忠實(shí)復(fù)制[11-12]。在細(xì)胞癌變過程中，細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的失活，尤其是G2/M 期限制點(diǎn)和G1/S 期限制點(diǎn)出現(xiàn)突變[13-14]。Ki-67 是G2、M、G1、S 期細(xì)胞的標(biāo)志蛋白，G0 期無表達(dá)。本研究中，Ki-67 在NHL 中陽性表達(dá)率明顯升高，且與LDH 水平、IPI 危象度分級存在相關(guān)性，提示Ki-67 基因表達(dá)異常參與并可能促進(jìn)NHL 的發(fā)生和進(jìn)展，并提示預(yù)后不良。與臨床分期的比較顯示，Ki-67 在Ⅲ～Ⅳ期人群中陽性表達(dá)率為65.71%，高于Ⅰ～Ⅱ期人群的42.86%，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但不完全排除Ki-67 與腫瘤進(jìn)展的正相關(guān)。至少說明Ki-67 對兒童NHL 的分子分型、組織分級具有一定參考價(jià)值。一致性比較顯示，NHL 組織中PTEN與Ki-67 表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，二者用于NHL早期評估一致性好。

綜上所述，PTEN、Ki-67 在NHL 患兒中存在顯著異常表達(dá)，其陽性表達(dá)與NHL 患兒血LDH水平和IPI 危象度分層相關(guān)，聯(lián)合檢測PTEN、Ki-67 有助于判斷臨床治療效果、預(yù)后評估，具有作為分子標(biāo)志物和分子靶點(diǎn)的潛在可能性。