AN融合抗原制備及其加強(qiáng)BCG免疫效果的研究

高笑笑，項(xiàng)智灝，陳福增，張 鷺，劉 軍

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，遺傳工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200438)

結(jié)核病(Tuberculosis)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)引起的傳染性疾病，是世界人口十大死亡原因之一.在將近1/4感染結(jié)核分枝桿菌的人群中，我國感染人數(shù)占世界感染人口總數(shù)的8.4%，位居世界第三，僅次于印度與印度尼西亞[1].缺乏有效的預(yù)防性疫苗、快速的診斷方法和耐藥菌株以及結(jié)核/HIV共感染的持續(xù)出現(xiàn)是目前結(jié)核病控制中存在的主要問題.當(dāng)前國際上唯一批準(zhǔn)使用的用于預(yù)防結(jié)核病的疫苗仍然是卡介苗(Bacillus-Calmette-Guerin，BCG)，它主要誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞分泌Th1型細(xì)胞因子，能有效預(yù)防嬰兒時(shí)期的結(jié)核性腦膜炎和播散性結(jié)核(約80%保護(hù)率)，但對(duì)肺結(jié)核的保護(hù)效果有限，且其保護(hù)效果隨時(shí)間推移逐漸減弱甚至消失，在成年人群中呈現(xiàn)較大波動(dòng)(0～80%保護(hù)率)[2-4].造成BCG保護(hù)效果不足的可能原因之一是BCG基因組中RD1基因片段的缺失.RD1是致病性分枝桿菌基因組中一個(gè)9.5kb的片段，包含分枝桿菌ESX-Ⅰ分泌系統(tǒng)的組成基因，BCG中RD1的缺失導(dǎo)致其無法合成ESX-Ⅰ分泌系統(tǒng)抗原Esat-6(也稱EsxA)和Cfp-10(也稱EsxB)，這些重要抗原的丟失可能導(dǎo)致BCG無法提供長期有效的抗結(jié)核免疫保護(hù)[5].因此，利用結(jié)核分枝桿菌中的特異性抗原如Esat-6和Cfp-10等構(gòu)建亞單位疫苗來加強(qiáng)BCG免疫功能是新型抗結(jié)核疫苗研究中的一個(gè)重要思路.

亞單位疫苗的形式包括蛋白、DNA或病毒載體疫苗，在結(jié)核病的預(yù)防和治療兩個(gè)層面發(fā)揮作用；自上世紀(jì)90年代起始，亞單位疫苗的研究取得了較大進(jìn)展，現(xiàn)已經(jīng)有多株候選疫苗在臨床初期取得了較好的試驗(yàn)結(jié)果，其中包括含有Esat-6抗原的H1和H56[6-7]，但迄今還未有通過臨床Ⅲ期評(píng)估的疫苗.如何評(píng)估候選抗原的有效性，是亞單位疫苗研究中面臨的一個(gè)關(guān)鍵問題.IFN-γ是宿主防御結(jié)核分枝桿菌感染的重要細(xì)胞因子[8-9]，抗原特異性CD4+T細(xì)胞一直被認(rèn)為是IFN-γ的主要產(chǎn)生者.因此，能否刺激抗原特異性CD4+T細(xì)胞IFN-γ的分泌水平上升是篩選、評(píng)估結(jié)核病候選疫苗的重要思路，據(jù)此發(fā)現(xiàn)的抗原包括Ag85、Esat-6、PPE18等.但是病毒載體疫苗MVA85A在臨床Ⅱb試驗(yàn)中的失敗提示我們需要對(duì)現(xiàn)有的抗原篩選策略進(jìn)行反思，避免過于單一的篩選標(biāo)準(zhǔn)[10].

在結(jié)核分枝桿菌中總共存在5套ESX分泌系統(tǒng)：ESX-Ⅰ～ESX-Ⅴ，分別與分枝桿菌的生長和毒力相關(guān)[11-12].結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞后，主要存在于宿主吞噬體中，并通過抑制吞噬溶酶體成熟維持其在吞噬體中的生存[13].通過ESX-1依賴的破膜作用，結(jié)核分枝桿菌也可以將抗原釋放進(jìn)入胞質(zhì)溶膠，細(xì)菌本身可能隨后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[13].ESX-1系統(tǒng)在細(xì)菌中負(fù)責(zé)原型ESX蛋白的分泌，即6kDa早期分泌抗原靶標(biāo)(Esat-6)和10kDa培養(yǎng)濾液蛋白(Cfp-10).這兩種蛋白質(zhì)形成1∶1異源二聚體復(fù)合物，是參與宿主-病原體相互作用的結(jié)核分枝桿菌最重要的蛋白質(zhì)之一[12].它們能夠誘導(dǎo)強(qiáng)烈的T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，是代表致病性結(jié)核分枝桿菌的關(guān)鍵毒力因子.結(jié)核分枝桿菌ESX-Ⅱ～ESX-Ⅴ分泌系統(tǒng)分泌的主要蛋白都屬于Esat-6和Cfp-10家族，在分泌時(shí)彼此依賴，并且通過特定的途徑分泌至胞外，協(xié)同影響細(xì)菌生理.

迄今為止，已經(jīng)有多個(gè)臨床試驗(yàn)證實(shí)了Esat-6作為疫苗組成抗原的有效性[6-7,14]，如過表達(dá)Esat-6的重組BCG能夠比親本BCG誘導(dǎo)更強(qiáng)的IFN-γ應(yīng)答.但單一抗原有限的表位數(shù)量限制了細(xì)胞或體液免疫保護(hù)作用的強(qiáng)度和范圍.因此，本研究以Esat-6為核心，與ESX-Ⅱ～ESX-Ⅴ系統(tǒng)中Esat-6同源蛋白EsxC，EsxH，EsxT，EsxN構(gòu)建融合抗原AN，避免單一抗原的局限，并進(jìn)一步探索其是否能夠作為多價(jià)亞單位疫苗加強(qiáng)現(xiàn)有BCG的免疫保護(hù)效果.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BCG-Japan(本實(shí)驗(yàn)室保存)；rBCG∶∶AN(本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存)；E.coliTrans 5α感受態(tài)菌株(北京全式金生物技術(shù)有價(jià)限公司)；E.coliBL21感受態(tài)菌株(北京全式金生物技術(shù)有限公司)；pET-28a(+)表達(dá)質(zhì)粒(Novagen)；Ni-NTA His Bind Resin(Novagen)；佐劑二甲基三十六烷基銨(DDA)和聚肌胞苷酸(polyI：C)購自上海源葉生物技術(shù)有限公司；流式細(xì)胞檢測(cè)相關(guān)試劑(BD)；淋巴細(xì)胞分離液(Dakewee).5～6周齡雌性BALB/C小鼠(SPF級(jí))、C57BL/6小鼠(SPF級(jí))均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司.

1.1.2 主要儀器

瓊脂糖凝膠電泳儀EPS600(天能儀器公司)、紫外凝膠成像系統(tǒng)(UVP)、超聲破碎儀(新芝儀器)、垂直電泳儀(BIO-RAD)、酶標(biāo)儀(BioTek)、流式細(xì)胞儀(Beckman Gallios)、PCR儀ProFlex TM PCR System(AB Applied Biosystems).

1.2 方法

1.2.1 融合抗原AN表位分析

結(jié)核分枝桿菌抗原主要通過組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅰ類和Ⅱ類分子識(shí)別并呈遞給T細(xì)胞，抗原中的T細(xì)胞表位是能被T細(xì)胞受體特異識(shí)別的片段，是引起宿主免疫應(yīng)答的基本功能單位，在疫苗設(shè)計(jì)、疾病預(yù)防和治療中都具有重要意義.我們應(yīng)用NetMHCcons 1.1 Server(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCcons/)[15]和NetMHCII 2.3 Server(http：∥www.cbs.dtu.dk/ services/NetMHCII/)[16-18]在線網(wǎng)站對(duì)融合抗原AN的表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，綜合分析其作為亞單位疫苗的優(yōu)勢(shì)潛力.

1.2.2 目的抗原編碼基因片段克隆

EsxA、EsxC、EsxH、EsxT、EsxN分別是結(jié)核分枝桿菌ESX-Ⅰ～ESX-Ⅴ分泌系統(tǒng)的效應(yīng)蛋白，前期的研究已經(jīng)證實(shí)，EsxA(Esat-6)能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞強(qiáng)烈的免疫反應(yīng).為避免單一抗原的局限，將5個(gè)基因順序連接構(gòu)建融合抗原AN：EsxA-EsxC-EsxH-EsxT-EsxN，具體方法如下：

從https：∥mycobrowser.epfl.ch/中獲取結(jié)核分枝桿菌H37Rv的基因組信息，設(shè)計(jì)引物分別對(duì)EsxA(Rv3875)、EsxC(Rv3890c)、EsxH(Rv0288)、EsxT(Rv3444c)、EsxN(Rv1793)編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：32μL水，5×buffer10μL，DNA Polymerase 1μL，上下游引物各1μL，4μL dNTPs，2μL H37Rv基因組模板.用AxyPerpTM DNA Gel Extraction Kit試劑盒回收PCR反應(yīng)產(chǎn)物.回收后的5個(gè)DNA片段利用融合PCR的方法順序連接.為了保證每個(gè)抗原表位的天然構(gòu)象，最大程度提供天然抗原的免疫原性，通過一段9個(gè)氨基酸的柔性Linker序列(GGACTAGTACCCCGAGGATCAACAGGA)[19]將5個(gè)抗原組分順次連接，得到片段長度為1557bp的融合序列AN.PCR擴(kuò)增AN片段，并在片段兩端引入合適酶切位點(diǎn)，通過酶切連接將AN片段連至載體pET-28(a)，轉(zhuǎn)化克隆菌株E.coliTrans 5α，經(jīng)抗性篩選后進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證.

表1 融合片段AN擴(kuò)增所需引物設(shè)計(jì)Tab.1 Primers designed for AN amplification

1.2.3 AN抗原的原核表達(dá)

將測(cè)序驗(yàn)證成功的含有AN片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21表達(dá)菌株中，抗性篩選陽性克隆后接種于LB培養(yǎng)基中(含卡那霉素50μg/mL).過夜活化后按照0.1%進(jìn)行轉(zhuǎn)接，220r/min，37℃搖床培養(yǎng)，待OD600值為0.6～0.8時(shí)加入IPTG至終濃度為0.5mmol/L誘導(dǎo)表達(dá)4h，收集菌體超聲裂解，離心后將上清、沉淀分別制樣，通過10%SDS-PAGE凝膠電泳分析表達(dá)水平.

擴(kuò)大培養(yǎng)至1L LB培養(yǎng)體系，IPTG誘導(dǎo)目標(biāo)抗原表達(dá)4h，12000r/min，1min離心收菌，冰浴超聲裂菌，收集包涵體.包涵體溶于8mol/L脲-PBS中，溶解蛋白用Ni-NTA親和層析柱進(jìn)行純化，Bradford法定量.并利用anti-His單克隆抗體通過Western-blot對(duì)純化的目的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證.

1.2.4 AN融合抗原免疫原性分析

6周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，每組5只.分別為PBS組、Ag85A組、AN免疫組.其中Ag85A作為陽性對(duì)照組，PBS組為陰性對(duì)照.

100μL純化后的AN蛋白(10μg)或Ag85A(10μg)分別與100μL弗氏完全佐劑混合，皮下免疫小鼠，200μL/只.在0、2、4周對(duì)小鼠共免疫3次，第2、4周時(shí)用等體積的相應(yīng)抗原與弗氏不完全佐劑混合后免疫.陰性對(duì)照組注射等體積無菌PBS.

最后一次免疫后4周頸椎脫臼處死小鼠，取小鼠脾臟于200目(約75μm)細(xì)胞篩網(wǎng)上研磨，用淋巴細(xì)胞分離液(Dakewee)分離脾淋巴細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用RPIM1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度后鋪于24孔板上，每孔1.0×106個(gè)細(xì)胞，用5μg/mL純化后的相應(yīng)抗原刺激細(xì)胞，PBS組用5μg/mL結(jié)核菌素(PPD)刺激細(xì)胞.在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h；加入Brefeldin A孵育4h阻斷高爾基體，然后用1μL CD3和CD4熒光抗體(BD)進(jìn)行細(xì)胞表面染色；固定細(xì)胞并破膜，再分別用1μL TNF-α，IFN-γ和IL-2抗體進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色；用Gallios流式細(xì)胞儀(Beckman)檢測(cè)多功能CD4+T細(xì)胞所占比例.

1.2.5 AN候選亞單位疫苗的配制

選用佐劑DDA、polyI∶C和融合抗原AN構(gòu)建亞單位疫苗[20-21].DDA用注射用水配制成2.5mg/mL母液，80℃水浴10min，冷卻至室溫；將polyI∶C用生理鹽水溶解至5.0mg/mL；融合蛋白AN用PBS稀釋至0.1mg/mL后推濾；將DAA 100μL(250μg)，polyI∶C 50μL(50μg)，AN蛋白溶液150μL(15μg)充分混合乳化，制成亞單位疫苗，皮下免疫小鼠(200μL/只).

1.2.6 BALB/c小鼠免疫保護(hù)實(shí)驗(yàn)

參考姜雯雯等[21]的亞單位疫苗加強(qiáng)免疫方案，將6～8周BALB/c小鼠隨機(jī)分為5組：BCG-Japan免疫組，rBCG∶∶AN免疫組，AN亞單位加強(qiáng)組1(BCG-Japan+AN)，AN亞單位加強(qiáng)組2(rBCG∶∶AN+AN)；陰性對(duì)照組(PBS).首先用BCG-Japan及rBCG：AN菌株對(duì)小鼠進(jìn)行皮下免疫，初次免疫劑量為100μL 1.0×104/μL的菌體；陰性對(duì)照組注射等體積無菌PBS.初次免疫8周后，用AN亞單位疫苗對(duì)AN亞單位加強(qiáng)組1(BCG-Japan+AN)，AN亞單位加強(qiáng)組2(rBCG∶∶AN+AN)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，同樣采用皮下免疫方式，免疫劑量200μL/只；BCG-Japan免疫組和rBCG∶∶AN免疫組不做處理.加強(qiáng)免疫4周后用BCG-Pasteur尾靜脈攻毒小鼠，攻毒劑量為每鼠100μL 1.0×105/μL的菌體，攻毒3周后取小鼠脾臟計(jì)算載菌量，評(píng)估AN對(duì)BCG加強(qiáng)免疫保護(hù)效果.

2 結(jié) 果

2.1 AN融合抗原T細(xì)胞表位分析

抗結(jié)核免疫反應(yīng)主要依賴于宿主細(xì)胞免疫，因此抗原一級(jí)結(jié)構(gòu)中T細(xì)胞表位的分布決定其免疫原性的強(qiáng)弱，利用NetMHCcons 1.1 Server(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCcons/)和NetMHCII 2.3 Server(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCII/)分析，結(jié)果見圖1.AN在2個(gè)數(shù)據(jù)庫中的19個(gè)亞型中共有213個(gè)MHC-Ⅰ型受體(包括HLA-A和HLA-B受體)強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)(圖1(a))，119個(gè)MHC-Ⅱ型受體(HLA-DRB受體)強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)(圖1(c))，而單獨(dú)的Esat-6蛋白僅有不到30個(gè)T細(xì)胞受體強(qiáng)結(jié)合位點(diǎn)(圖1(e)).AN能夠提供更多的T細(xì)胞表位，進(jìn)一步說明其作為亞單位疫苗的潛力.

2.2 重組蛋白的制備和鑒定

以結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組為模板，依次擴(kuò)增EsxA、EsxC、EsxH、EsxT、EsxN編碼基因片段，將5個(gè)片段連接后可得到長度為1557bp的AN編碼基因片段，與質(zhì)粒pET-28(a)經(jīng)雙酶切后連接，獲得重組質(zhì)粒，結(jié)果如圖2(a)所示.測(cè)序驗(yàn)證插入片段與目標(biāo)序列一致，證明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.

重組質(zhì)粒在原核表達(dá)系統(tǒng)E.coliBL21菌株中能夠穩(wěn)定表達(dá)，主要以包涵體形式存在，Ni-NTA柱親和層析純化后，獲得的重組蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE鑒定，蛋白純度>95%(圖2(b)).進(jìn)一步通過anti-His單克隆抗體對(duì)目的蛋白進(jìn)行驗(yàn)證，與蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)比較證明目的蛋白成功表達(dá)(圖2(c)).

2.3 AN特異性多功能CD4+T細(xì)胞分型分析

通過細(xì)胞表面染色CD3和CD4圈定CD4+T細(xì)胞，然后在胞內(nèi)染色TNF-α、IFN-γ和IL-2 3個(gè)細(xì)胞因子，考察CD4+T細(xì)胞的不同分型，從免疫細(xì)胞質(zhì)量的角度評(píng)估AN抗原激起的宿主細(xì)胞免疫水平.結(jié)果如圖3所示.

Ag85A是結(jié)核分枝桿菌的分泌蛋白Ag85的成分之一，另外兩種包括Ag85B和Ag85C.Ag85A能夠誘導(dǎo)細(xì)胞高水平的IFN-γ分泌，是最早進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)亞單位疫苗MVA-Ag85A的組成抗原，已有多項(xiàng)研究證實(shí)其免疫原性.在這部分研究中將其作為陽性參照抗原來比較AN融合抗原免疫原性.相比于陰性對(duì)照PBS組，AN實(shí)驗(yàn)組均能夠誘導(dǎo)顯著高比例的不同亞型CD4+T細(xì)胞.值得關(guān)注的是，AN能誘導(dǎo)出比陽性對(duì)照組Ag85A更高比例的IFN-γ+TNF-α+IL-2-雙陽性CD4+T細(xì)胞(即中央記憶細(xì)胞)，以及與Ag85A相似比例的IFN-γ+IL-2+雙陽性CD4+T細(xì)胞.在單陽性CD4+T細(xì)胞中，AN可以誘導(dǎo)高于陽性對(duì)照組Ag85A的TNF-α+IFN-γ-IL-2-CD4+T細(xì)胞.這一結(jié)果表明AN融合抗原具有良好的免疫原性，可以作為構(gòu)建亞單位疫苗的候選抗原.

2.4 AN亞單位疫苗對(duì)BCG初免的加強(qiáng)保護(hù)效果分析

BCG菌株因保存、傳代方法不同，在遺傳水平上發(fā)生了顯著變化，已有研究表明BCG菌株之間廣泛的遺傳多樣性與其毒力和保護(hù)效果的差異相關(guān).BCG-Japan菌株表面缺失了大量與分枝桿菌毒力相關(guān)的脂類PDIMs和PGLs，同時(shí)在BCG-Japan中PE/PPE家族的抗原PE19和PPE27的表達(dá)是上調(diào)的[22]，這使得BCG-Japan一方面表現(xiàn)為較弱毒力，另一方面呈現(xiàn)良好的保護(hù)效果.AN中ESAT-6代表分枝桿菌關(guān)鍵毒力因子，出于安全性和保護(hù)效果的綜合考慮，在BCG-Japan和rBCG∶∶AN免疫的基礎(chǔ)上評(píng)估AN作為亞單位疫苗的效果.

BCG初次免疫小鼠8周后，AN亞單位疫苗加強(qiáng)免疫一次，末次免疫4周后，選用高劑量BCG-Pasteur尾靜脈攻毒小鼠[19]，3周后，斷頸處死小鼠，解剖取其脾臟，計(jì)算菌落形成單位(CFU)，結(jié)果如圖4見第682頁所示.

BCG免疫組、BCG免疫AN加強(qiáng)免疫組，小鼠脾臟細(xì)菌含量均顯著低于陰性對(duì)照組(6.18lgCFU).各免疫組小鼠的脾臟計(jì)數(shù)結(jié)果(圖4)顯示，與野生型BCG免疫相比，在BCG菌株中表達(dá)AN抗原并未顯著提高疫苗保護(hù)效果，甚至在野生型BCG初次免疫后用AN加強(qiáng)免疫，僅能降低小鼠脾臟載菌量的27%(5.06lgCFU∶5.20lgCFU).但當(dāng)采用rBCG∶∶AN初次免疫-AN抗原加強(qiáng)免疫策略后，相比未加強(qiáng)組(5.20lgCFU)小鼠脾臟載菌量降至4.67lgCFU，兩組間差異顯著(t-Test，**，P<0.005).

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示了AN作為亞單位疫苗對(duì)rBCG∶∶AN的初次免疫有很好的加強(qiáng)作用.這種免疫保護(hù)效果的加強(qiáng)至少持續(xù)4周.AN亞單位疫苗所表現(xiàn)出的抗分枝桿菌保護(hù)潛能提示，用AN進(jìn)行強(qiáng)化免疫可在一定程度上彌補(bǔ)BCG保護(hù)效果的不足.

3 討 論

目前，BCG接種仍然是預(yù)防結(jié)核病的主要手段，但BCG作為抗結(jié)核疫苗其保護(hù)效果不甚理想，面對(duì)全球范圍內(nèi)仍然嚴(yán)峻的結(jié)核病現(xiàn)狀，開發(fā)有效的新型抗結(jié)核疫苗是人類共同的迫切目標(biāo).研究證實(shí)，BCG初免-亞單位疫苗加強(qiáng)的抗結(jié)核免疫策略可以提高免疫保護(hù)效果[24].但是，選擇哪些抗原作為亞單位疫苗的核心成分，一直是亞單位疫苗開發(fā)的核心問題.考慮到單個(gè)抗原免疫原性的局限，將多個(gè)抗原或抗原表位組合成融合蛋白亞單位疫苗的研究思路被廣泛接受.已進(jìn)入臨床Ⅱa實(shí)驗(yàn)的H1(Ag85B+Esat-6)、H4(Ag85B+TB10.4)和H56(Ag85B+Esat-6+Rv2660c)都是含有多抗原表位的融合蛋白，與單個(gè)抗原比較，這些融合抗原普遍能在動(dòng)物體內(nèi)激起更強(qiáng)的Th1型免疫反應(yīng)[6-7,23]，保護(hù)效果也相對(duì)更好.作為結(jié)核分枝桿菌的早期分泌抗原，ESX-Ⅰ分泌系統(tǒng)的EsxA(Esat-6)蛋白在參與宿主互作方面功能突出[24]，可以通過結(jié)核分枝桿菌抗原非依賴性記憶CD8+T細(xì)胞和NK細(xì)胞來誘導(dǎo)IL-18依賴性IFN-γ分泌[25].與ESX-Ⅰ類似的分泌系統(tǒng)在結(jié)核分枝桿菌中共有5套，即ESX-Ⅰ～ESX-Ⅴ，分泌系統(tǒng)效應(yīng)蛋白Esx之間序列多樣性與T7S系統(tǒng)功能多樣性密切相關(guān).所以，將不同分泌系統(tǒng)中的重要分泌蛋白融合在一起構(gòu)建成多抗原融合疫苗是本研究的一種新思路.我們將5套ESX分泌系統(tǒng)中的分泌蛋白EsxA、EsxC、EsxH、EsxT、EsxN融合為抗原AN，探索其免疫原性和免疫保護(hù)效果.基于Ag85A設(shè)計(jì)的亞單位疫苗在南非最早進(jìn)入臨床試驗(yàn)[10]，雖然未能顯著提高BCG初次免疫后的加強(qiáng)免疫效果，但Ag85A抗原的免疫原性已經(jīng)得到多項(xiàng)研究的證實(shí).本研究將其作為陽性參照抗原，用其來比較AN融合抗原加強(qiáng)免疫的效果.

結(jié)核分枝桿菌感染宿主細(xì)胞后，其抗原主要通過組織相容性復(fù)合物(MHC)Ⅰ類和Ⅱ類分子識(shí)別并呈遞給淋巴細(xì)胞.抗原T細(xì)胞表位是抗原中能被T細(xì)胞受體特異識(shí)別的線性片段，更是引起免疫應(yīng)答的基本效應(yīng)單位，在疫苗設(shè)計(jì)、疾病預(yù)防和治療中都具有重要價(jià)值.我們選擇HLA-DRB、HLA-A和HLA-B受體作為分析對(duì)象，HLA-DRB可以識(shí)別超過90%的已知結(jié)核菌抗原表位，刺激更多CD4+T細(xì)胞活化，發(fā)揮抗結(jié)核的中心反應(yīng).HLA-A和HLA-B活化CD8+T細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒效應(yīng)，有助于胞內(nèi)菌的清除.分析表明AN具有大量的T細(xì)胞表位，有較強(qiáng)的激發(fā)細(xì)胞免疫反應(yīng)的潛力.本研究利用C57BL/6小鼠脾細(xì)胞胞內(nèi)多因子檢測(cè)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證這一序列預(yù)測(cè)結(jié)果.通過ICS實(shí)驗(yàn)可以檢測(cè)單細(xì)胞內(nèi)各因子的分泌情況，進(jìn)而將CD4+T細(xì)胞進(jìn)行分群，能更靈敏、全面地了解宿主細(xì)胞免疫水平.Peter Andersen等[23]在H4+IC31的臨床實(shí)驗(yàn)中用該方法驗(yàn)證亞單位疫苗的免疫原性，檢測(cè)外周血中的T細(xì)胞反應(yīng)水平，取得了與預(yù)期相符的結(jié)果.本研究結(jié)果證明AN抗原能激起高于或接近Ag85A的Th1型細(xì)胞因子分泌，可以作為構(gòu)建亞單位疫苗的候選抗原.

利用BALB/c小鼠在BCG-Japan和rBCG∶∶AN初次免疫的基礎(chǔ)上，評(píng)估AN對(duì)于BCG初次免疫的加強(qiáng)保護(hù)效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)單次AN加強(qiáng)免疫能夠增強(qiáng)重組BCG rBCG∶∶AN的保護(hù)效果，表現(xiàn)為小鼠脾臟載菌量大幅下降.值得注意的是，本研究選擇了2株BCG疫苗株分別進(jìn)行初次免疫，一株是BCG Japan野生型菌株，AN亞單位疫苗加強(qiáng)免疫一次并不能提高其免疫保護(hù)效果；但若以增強(qiáng)表達(dá)AN抗原的重組BCG Japan菌株rBCG∶∶AN進(jìn)行初次免疫(本課題組前期構(gòu)建，能夠分泌表達(dá)AN抗原)，則AN加強(qiáng)免疫一次后，就能導(dǎo)致脾臟細(xì)菌清除率增加70.2%，證明了AN亞單位疫苗具有抗結(jié)核分枝桿菌感染的加強(qiáng)免疫能力，同時(shí)也暗示，AN抗原增強(qiáng)保護(hù)免疫的效果，與抗原使用劑量、持續(xù)表達(dá)時(shí)間、免疫次數(shù)等免疫策略相關(guān).本項(xiàng)目接下來開展的研究，將重點(diǎn)優(yōu)化AN亞單位疫苗的免疫策略，在此基礎(chǔ)上深入解析其免疫保護(hù)機(jī)制，充分發(fā)揮這一抗原的亞單位疫苗保護(hù)效果.