蔡志文,肖小平,王雪亮,邵永紅,周 潔
1)深圳大學(xué)物理與光電工程學(xué)院,光電器件與系統(tǒng)教育部/廣東省重點實驗室,廣東深圳 518060; 2)湖南省計量檢測研究院,湖南長沙 410014
免疫傳感器是一種利用抗體和抗原之間親和作用,實現(xiàn)目標(biāo)分析物特異性檢測的裝置.在免疫傳感器的制備中,由于抗體作為識別元件提供了抗體和抗原相互作用的特異性位點,抗體的固定效果對抗原檢測至關(guān)重要.共價法是最常見的固定方法,但其通常比較耗時,且會導(dǎo)致抗體的隨機固定[1].彼此接近的抗體會引起空間位阻效應(yīng),進(jìn)而影響抗體對抗原的結(jié)合能力.利用抗體結(jié)合蛋白對抗體的特異性吸附可實現(xiàn)抗體的定點固定.葡萄球菌蛋白A(簡稱蛋白A)和鏈球菌蛋白G(簡稱蛋白G)可以特異性地與抗體的可結(jié)晶(fragment, Fc)段結(jié)合[2].然而,目前鮮有評估和比較兩者與抗體結(jié)合效率的文章.
研究分子間相互作用的一般方法包括放射免疫分析法和酶聯(lián)免疫分析法[3]等,但這些方法通常需要標(biāo)記,具有數(shù)據(jù)分析復(fù)雜、不能實時監(jiān)測反應(yīng)過程的缺點.動力學(xué)分析法可實時監(jiān)測分子間的結(jié)合和解離過程,表面等離子共振(surface plasmon resonance, SPR)傳感技術(shù)無需對分析物進(jìn)行標(biāo)記,可實現(xiàn)高通量的生物分子間相互作用研究.自1990年Biacore公司開發(fā)出首臺商品化的SPR檢測儀器,SPR傳感已成為研究分子間相互作用的重要工具[4-5].SPR傳感檢測分為強度型、相位型、角度型及波長型方法.強度型SPR傳感器的檢測裝置結(jié)構(gòu)簡單,但是動態(tài)范圍一般只能達(dá)到 ~10-5RIU[6],靈敏度低;相位型SPR傳感器具有較高靈敏度[7],但其動態(tài)范圍較小(~10-4RIU);角度型SPR傳感器具有較高的靈敏度(~10-7RIU)和動態(tài)范圍[8],但是檢測設(shè)備相對復(fù)雜和昂貴[9-11];波長型SPR傳感器與強度型相比,其靈敏度更高,能夠達(dá)到~10-6RIU[12-13],且動態(tài)范圍更大[14].波長型SPR檢測設(shè)備的成本與角度型相比較低,因此,更適用于研究分子間的相互作用.本研究利用自行研制的波長型SPR生物傳感設(shè)備,結(jié)合動力學(xué)分析法研究蛋白A、蛋白G與免疫球蛋白(immunoglobulin G, IgG)的相互作用.實驗測得IgG與蛋白A和蛋白G特異性結(jié)合的動力學(xué)常數(shù)(結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)),比較了兩者與IgG的結(jié)合能力.研究結(jié)果可為抗體固定方法優(yōu)化提供必要科學(xué)參考.
重組蛋白A購于上海市普欣生物科技有限公司,重組蛋白G購于生工生物工程(上海)股份有限公司,IgG(人種屬)購自北京索萊寶科技有限公司,1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(1-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride,EDC)、N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)和2-嗎啉乙磺酸-水合物(2-morpholineethanesulfonicacidhydrate,MES)均購自上海麥克林生化有限公司,巰基十一酸(mercaptoundecanoicacid,11-MUA)和牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)購自上海阿拉丁生化科技有限公司,磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersaline,PBS)購于上海雙螺旋生物科技有限公司.
SPR成像(SPRimaging,SPRi)傳感實驗裝置如圖1所示.鹵素?zé)艄庠串a(chǎn)生寬譜光經(jīng)過透鏡組L1和L2耦合進(jìn)入液芯光纖,光纖出射光經(jīng)過透鏡L3準(zhǔn)直后進(jìn)入聲光濾波器(acousticopticaltunablefilter,AOTF).AOTF會對寬譜光進(jìn)行調(diào)制,濾波輸出窄帶光.經(jīng)AOTF出射的窄帶光經(jīng)柱面鏡CL1和CL2準(zhǔn)直擴束為橢圓型光斑傾斜入射到棱鏡,以匹配棱鏡的空間色散,提高光能利用率.光線經(jīng)過棱鏡耦合后入射到傳感金膜,入射光在金膜表面激發(fā)SPR現(xiàn)象.最后反射光經(jīng)過透鏡組L4和L5成像至電荷耦合元件(charge-coupleddevice,CCD)相機的傳感面.AOTF和CCD由LabVIEW軟件控制,在AOTF切換1次波長后,CCD進(jìn)行多次曝光得到多幅傳感面強度圖,平均后得到該波長下的傳感面強度圖.AOTF掃描1個波長周期后,獲得一系列不同波長下對應(yīng)的傳感面強度圖像.由于芯片不同點位的金膜厚度并不完全一致,在實際檢測時,首先選取大小為30×20pixel的感興趣區(qū)域,以減小不同金膜厚度所引起的誤差.對該區(qū)域像素點在每個掃描波長下的強度值進(jìn)行平均,從而得到該區(qū)域的SPR光譜曲線,通過多項式擬合得到該區(qū)域的共振波長.金膜表面發(fā)生分子結(jié)合時會引起金膜與溶液界面的折射率變化,導(dǎo)致共振波長發(fā)生移動,由此監(jiān)測分子間的相互作用過程.
為防止共振波長超出掃描范圍,將系統(tǒng)的波長掃描范圍設(shè)定為600~700nm.系統(tǒng)中AOTF作為分光器件,最小光譜分辨率為0.1nm,即掃描步長最小可達(dá)0.1nm.在掃描步長分別為0.1、1.0和10.0nm情況下,系統(tǒng)對同種樣品的均方根噪聲分別為0.007、0.007和0.013nm.因此,可認(rèn)為掃描步長為0.1nm和1.0nm時的噪聲水平基本一致,為提高系統(tǒng)的時間分辨率,實驗選取掃描步長為1.0nm.
對待測樣品的折射率進(jìn)行估計,通過理論模擬計算出最佳的入射波長以及入射角.如本次實驗樣品的背景液為PBS(折射率為1.3347RIU)時,對應(yīng)的最佳入射波長和入射角分別為662nm和71.1°.檢測過程中首先固定最佳入射波長,在預(yù)估的最佳入射角附近調(diào)整入射角度,并對待測位點的強度值進(jìn)行監(jiān)測,當(dāng)待測位點的強度值最低時,認(rèn)為此時的入射角為最佳入射角,然后固定該角度,對入射波長進(jìn)行掃描.
圖1 實驗裝置光路圖Fig.1 Light path diagram of experimental device
SPRi系統(tǒng)中使用的棱鏡由折射率為1.515的BK7玻璃制成.傳感芯片通過磁控濺射法制備,首先,在18mm×18mm的BK7玻璃基板上濺射2nm厚的Cr黏合層;然后,濺射48nm厚的金傳感層,實驗中使用折射率匹配油將傳感芯片與棱鏡耦合.
實驗中使用4通道流通池.流通池的模具由Solidworks制圖設(shè)計,使用計算機數(shù)控(computernumericalcontrol,CNC)方法加工而成.將配好的聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane,PDMS)膠倒入模具中,在150℃恒溫箱中固化15min.流通池尺寸為18mm×18mm,與傳感器芯片的尺寸匹配.每個通道的體積約為3μL(高度0.2mm;寬度1mm;長度14mm).
首先,將金膜放置在等離子體清洗機內(nèi)清洗10min以增加金膜的親水性,取出冷卻后置于10mL的11-MUA乙醇溶液中浸泡過夜制備自組裝膜.利用無水乙醇和純水清洗金膜表面,氮氣吹干.將修飾好的金膜置于棱鏡之上,在金膜表面固定多通道流通池.將PBS緩沖液流入流通池,待SPR信號穩(wěn)定后,再通入含有0.2mol/LEDC和0.1mol/LNHS的MES溶液(0.1mol/L,pH=5.5),活化金膜表面的羧基.接著通入含有100μg/mL的蛋白A或蛋白G的醋酸鈉溶液(0.1mol/L,pH=4.5),抗體結(jié)合蛋白分子通過共價結(jié)合固定在芯片表面.最后通入質(zhì)量濃度為1%的BSA溶液封閉未結(jié)合的NHS酯基.通入每種試劑前都要先通入PBS緩沖液對通道進(jìn)行沖洗直至SPR共振波長穩(wěn)定,以清洗掉金膜表面上的非特異性結(jié)合的蛋白分子.以上實驗都在室溫(20~25℃)下進(jìn)行,液體進(jìn)樣速度為10μL/min.
抗體結(jié)合蛋白固定后,在通道中通入PBS緩沖液直至信號穩(wěn)定.將IgG用PBS溶液稀釋成2個濃度組,第1組的質(zhì)量濃度分別為1、2、4及8μg/mL;第2組的質(zhì)量濃度分別為8、15、18及25μg/mL.兩組質(zhì)量濃度梯度的IgG溶液分別通入固定了蛋白A和蛋白G的通道,IgG溶液在金膜表面與蛋白A和蛋白G發(fā)生結(jié)合反應(yīng).反應(yīng)結(jié)束后通入PBS溶液進(jìn)行解離.SPR傳感器實時監(jiān)測共振波長的變化,通過對共振波長變化曲線進(jìn)行處理可得到相關(guān)動力學(xué)信息.
反應(yīng)過程符合準(zhǔn)一級動力學(xué)方程[15]
(1)
其中, dR/dt為SPR信號對時間t的求導(dǎo),即固定在金膜表面的抗體蛋白分子與抗體結(jié)合形成復(fù)合物的速率;Rmax為物質(zhì)反應(yīng)飽和時的SPR信號;ka為結(jié)合速率常數(shù);kd為解離速率常數(shù);c為分析物的質(zhì)量濃度(單位:mol/L).通過對dR/dt~R進(jìn)行線性擬合,可求出斜率kac+kd; 再對(kac+kd)~c線性擬合,可求出斜率ka和截距kd. 若要求得更精確的kd,需從解離段數(shù)據(jù)中求取,解離段具有如下關(guān)系
(2)
對式(2)積分可得
ln(R0/Rt)=kd(t-t0)
(3)
其中,R0與Rt分別是t0和t時刻的SPR信號.以ln(R0/Rt)~(t-t0)作圖或線性擬合可求出斜率kd.
圖2為蛋白A和蛋白G固定過程中共振波長的實時變化曲線.自組裝金膜表面通入含有0.2mol/LEDC和0.1mol/LNHS的MES溶液時,共振波長發(fā)生劇烈變化,這是由于MES溶液與PBS溶液較大的折射率差異所引起,金膜表面羧基活化后共振波長實際增加約2nm.抗體結(jié)合蛋白共價固定在金膜表面過程中共振波長逐漸增加,PBS沖洗后蛋白A和蛋白G結(jié)合區(qū)域共振波長分別提高2.7nm和3.0nm,說明抗體結(jié)合蛋白成功固定在金膜表面.BSA封閉后,共振波長進(jìn)一步增加,表明BSA在芯片上已固定.
圖2 抗體結(jié)合蛋白固定過程的共振波長變化監(jiān)測Fig.2 Resonance wavelength monitoring of the immobilization of antibody-binding protein
圖3(a)和圖3(b)分別為蛋白A和蛋白G與IgG反應(yīng)的動力學(xué)曲線圖.由式(2)和式(4)可以求出蛋白A與IgG的ka≈1.3×105L·mol-1·s-1、kd≈2.1×10-2s-1,蛋白G與IgG的ka≈5.0×104L·mol-1·s-1、kd≈5.0×10-3s-1.就結(jié)合速率相比,蛋白A與IgG的結(jié)合速率更大,說明蛋白A與IgG結(jié)合更快,單位時間里結(jié)合形成更多的復(fù)合物,結(jié)合效率更高.就解離速率相比,蛋白G與IgG的解離速率更小,說明單位時間里解離程度小,形成的復(fù)合物相對穩(wěn)定.重組蛋白A有5個IgG的Fc區(qū)域結(jié)合位點,重組蛋白G則只有2個或3個[16-18],位點越多更容易結(jié)合,這可能是蛋白A與IgG能在單位時間里結(jié)合次數(shù)更多的原因.蛋白A與IgG的結(jié)合速率常數(shù)和解離速率常數(shù)與文獻(xiàn)[19]中的量級一致,蛋白G的結(jié)合速率常數(shù)與文獻(xiàn)[20]中量級一致.kd/ka是體現(xiàn)親和力大小的指標(biāo),比值越小則親和力越強.蛋白A與蛋白G相比kd/ka值較大,說明它對IgG的親和力較小.這可能是由于重組蛋白G已經(jīng)除去了與白蛋白的結(jié)合位點,減少了交叉反應(yīng)與非特異性結(jié)合,因此,蛋白G比蛋白A具有更強的親和力.
圖3 抗體結(jié)合蛋白與 IgG動力學(xué)反應(yīng)曲線Fig.3 Kinetic curves of the interactions between antibody-binding proteins and IgG
SPR傳感技術(shù)是一種新型生化分析技術(shù)手段,被廣泛應(yīng)用于藥物開發(fā)、環(huán)境檢測和疾病診斷等領(lǐng)域.該技術(shù)能實時監(jiān)測分子間的相互作用,如蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)、藥物-蛋白質(zhì)、核酸-蛋白質(zhì)及受體-配體等分子間的相互作用.本研究利用自研的波長型SPR生物傳感器研究蛋白A、蛋白G與免疫球蛋白IgG的相互作用,并對其進(jìn)行動力學(xué)分析計算.結(jié)果表明,該傳感器可用于研究生物分子相互作用及動力學(xué)參數(shù)測定,計算得到的動力學(xué)參數(shù)數(shù)量級與文獻(xiàn)中相似.對比蛋白A和蛋白G與IgG的結(jié)合和解離速率參數(shù)可以得出,蛋白A與IgG的結(jié)合效率更高,而蛋白G與IgG形成的復(fù)合物更穩(wěn)定,蛋白對IgG的親和力更強.本研究結(jié)果為抗體固定方法的優(yōu)化提供必要的參考和理論支撐.