生物滯留池微生物種群的硝化反硝化功能研究
——以深圳市為例

李笑玥，秦華鵬，王 凡，銀翼翔

1)北京大學(xué)深圳研究生院環(huán)境與能源學(xué)院，城市人居環(huán)境科學(xué)與技術(shù)重點實驗室，廣東深圳 518055；2)中山大學(xué)大氣科學(xué)學(xué)院，廣東珠海519082

生物滯留池是利用工程土壤、微生物和植被的物理、化學(xué)和生物特性調(diào)控地表徑流水質(zhì)水量的綠色基礎(chǔ)設(shè)施．生物滯留池作為海綿城市建設(shè)的核心設(shè)施之一，對徑流污染物凈化效果顯著[1]．但該設(shè)施對溶解態(tài)氮素污染物的處理效率存在較大波動，常出現(xiàn)硝態(tài)氮(NO3-N)等氮素淋失的現(xiàn)象[2-3]．主要原因是進(jìn)入生物滯留池的部分徑流氮素未能通過反硝化作用被永久去除，造成硝態(tài)氮在池內(nèi)累積并隨后續(xù)的降雨徑流淋出[4-5]．微生物對生物滯留池中氮去除起到重要作用，掌握微生物種群及其氮轉(zhuǎn)化功能的特征，有助于揭示生物滯留池氮去除機理，并為評估和提高系統(tǒng)氮去除功能提供依據(jù)．

近年來，應(yīng)用分子生物學(xué)手段，如實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction, qPCR)和16S核糖體核糖核酸(ribosomal ribonucleic acid, rRNA)基因高通量測序等，探索微生物功能群多樣性及數(shù)量在土壤氮循環(huán)，成為評價生物滯留池硝化反硝化能力的切入點．在生物滯留設(shè)施中，氨氧化、硝化和反硝化反應(yīng)需要微生物體內(nèi)的特異性生物酶來催化，其中，部分關(guān)鍵酶的編碼基因已被探明，例如，編碼氨氧化細(xì)菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)氨單加氧酶的基因amoA-AOB、 編碼氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA)氨單加氧酶的基因amoA-AOA、 以及反硝化基因nirS、nirK和nosZ等多種氮轉(zhuǎn)化功能基因在環(huán)境樣本的調(diào)查標(biāo)記中十分普遍．WAN等[6-7]搭建模擬裝置研究了微生物數(shù)量與生物滯留柱填料結(jié)構(gòu)的關(guān)系，但該研究使用的裝置中沒有植物覆蓋；MORSE等[8-10]在實驗室建造結(jié)構(gòu)相同的模擬裝置，討論了生物滯留池中植物與微生物多樣性的相互作用．CHEN等[11]采用qPCR的方法研究了美國堪薩斯州某個生物滯留系統(tǒng)土壤中的16S rRNA基因以及4種硝化與反硝化基因的豐度，發(fā)現(xiàn)其功能基因豐度與深度、淹沒時間正相關(guān)；WALLER等[12]調(diào)查了美國大西洋中部沿岸州(馬里蘭州、北卡羅蘭州和弗吉尼亞州)23個生物滯留池中2種反硝化功能基因豐度．后兩項研究主要探討了生物滯留池中的氮轉(zhuǎn)化功能基因，缺乏對微生物種群多樣性的分析．綜合來看，目前對于生物滯留池中微生物的探究主要以實驗室模擬為主，對實際運行條件下生物滯留池微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)與氮轉(zhuǎn)化功能的研究較少，特別是缺乏屬水平上氮轉(zhuǎn)化功能菌的深入分析[14]．

本研究以16S rRNA基因作為標(biāo)志基因構(gòu)建基因文庫，對深圳市已建成的代表性原位生物滯留池土壤填料中主要細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析，結(jié)合qPCR對硝化和反硝化細(xì)菌的功能基因豐度進(jìn)行研究，并通過冗余度分析等多變量統(tǒng)計分析方法研究硝化反硝化細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)、豐度與環(huán)境因子之間的相關(guān)性，探討不同生物滯留池采樣點細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的差異性，了解硝化與反硝化微生物對環(huán)境因子的響應(yīng)機制，為生物滯留池系統(tǒng)中氮轉(zhuǎn)化功能評估提供科學(xué)依據(jù)．

1 材料與方法

1.1 采樣點與樣品

深圳作為中國海綿城市建設(shè)試點城市之一，生物滯留池在深圳的海綿城市建設(shè)中應(yīng)用較為普遍，本研究以深圳典型生物滯留設(shè)施為例開展研究．研究區(qū)屬亞熱帶海洋性氣候，氣候溫和；年平均氣溫為22.4 ℃，平均年降雨量為1 933.3 mm，每年4～9月為雨季，期間降雨量占全年降水的85%．本研究依據(jù)較成熟的海綿項目所屬的主要用地類型進(jìn)行分類，主要有公園綠地、市政道路、建筑小區(qū)和模擬實驗體系4種，每種類型選擇2個設(shè)施，共選取8處生物滯留池為研究對象．設(shè)施結(jié)構(gòu)由上到下依次為植被層、種植土層(本地土、河沙和腐殖質(zhì)體積比約為5∶4∶1)、 砂層、土工布和礫石層，但土壤深度及表面植被不盡相同，見表1．

表1 生物滯留池采樣點

采樣時間集中在2月底至3月初(深圳市旱季)，各采樣點雨前干旱時間均超過2周．用手持式土壤取樣器按梅花形進(jìn)行5點取樣，取樣深度為0～15 cm(表層土壤)，每個樣點取樣3～5 g．將采取的新鮮土壤樣本剔除小石子及落葉后進(jìn)行混合，封裝于15 mL的離心管內(nèi)，存于-20 ℃冰箱備用．

1.2 脫氧核糖核酸的提取

采用MO-BIO PowerLyzer?PowerSoil?DNA— 12855試劑盒提取土壤樣品微生物脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)，每個樣品均提取3次．所獲得的DNA均用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行驗證，用超微量紫外可見分光光度計(美國Quawell Q5000)檢測質(zhì)量濃度是否達(dá)標(biāo)，同時依據(jù)光密度比值D(260)/D(280)判斷其純度．

1.3 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

本研究以廣泛應(yīng)用于原核生物分類研究中的16S rRNA基因作為標(biāo)志基因，對細(xì)菌16S rRNA基因V3、V4和V5區(qū)測序，并對深圳市已建成的代表性生物滯留池土壤填料中主要細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行分析．針對8個雨水花園樣地中提取的8個土壤樣本，首先利用通用引物擴(kuò)增樣本內(nèi)微生物的16S rRNA基因，然后純化PCR 產(chǎn)物，并上機測序．以提取到的基因組DNA為模板，選用表2所示通用引物．

表2 16S rRNA測序引物序列

PCR反應(yīng)條件為：98 ℃預(yù)變性3 min；98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，27個循環(huán)；72 ℃保溫5 min．反應(yīng)產(chǎn)物于4 ℃保存．采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，符合擴(kuò)增要求可直接用于后續(xù)分析．

委托深圳金唯智生物科技有限公司對樣品進(jìn)行Illumina MiSeq高通量測序．對有效數(shù)據(jù)在97%水平上進(jìn)行微生物操作分類單元(operational taxonomic units, OTUs)聚類，選取OTUs序列中排在第1位的序列為代表序列，并比對Silva數(shù)據(jù)庫進(jìn)行物種注釋．通過對OTUs進(jìn)行物種在門和屬等分類學(xué)水平上的群落結(jié)果統(tǒng)計分析，得出微生物群落結(jié)構(gòu)組成．

1.4 qPCR功能基因定量分析

采用qPCR方法分別對氮循環(huán)過程中相關(guān)的5種功能基因amoA-AOA、amoA-AOB、nirK、nirS和nosZ進(jìn)行定量分析，qPCR均采用SYBR Green法，利用ABI 7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems, USA)儀器測定分析．

2 結(jié)果與討論

2.1 生物滯留池中門水平微生物特征分析

2.1.1 微生物多樣性和豐富度分析

DNA樣本的多樣性分析可以反映群落的微生物多樣性和豐富度，結(jié)果如表3．樣本文庫覆蓋率均大于98%，說明測序結(jié)果對樣本真實情況具有良好的代表性，可代表樣本的真實情況．

表3 生物滯留池微生物多樣性和豐富度

從多樣性來看，樣本A1、A2、C2、D1和D2的Shannon指數(shù)高于樣本B1、B2和C1，而樣本A1、A2、B1和B2的Simpson指數(shù)低于樣本C1、C2、D1和D2．一般而言，Shannon指數(shù)越高或Simpson指數(shù)越低都代表多樣性越高．綜合考慮這兩個指數(shù)可知，樣本A1多樣性最高，即樣本A1中的各物種均勻度較好；樣本C1群落多樣性最低，結(jié)合樣本C1的豐富度指數(shù)呈現(xiàn)顯著高的特點，推測樣本C1中可能存在某幾種菌為絕對優(yōu)勢菌的情況．A、B組樣本的Sobs與Chao1值明顯低于C、D組樣本的，表明在A、B組樣本中物種的豐富度較C、D組更低，這一差異可能與A、B組樣本僅稀疏種植單一植物，且總工程土壤厚度較淺有關(guān)．

選擇97%相似度的OTU，計算不同隨機抽樣下的Alpha多樣性指數(shù)，根據(jù)多樣性指數(shù)Sobs(表征實際觀測到的物種數(shù)目)，制作曲線圖(圖1)，即為稀釋曲線．觀察樣本數(shù)據(jù)的稀釋曲線趨向平坦，說明測序數(shù)據(jù)量合理，更多的數(shù)據(jù)量只會產(chǎn)生少量的新物種，可初步判定本次測序結(jié)果合理可信．

圖1 相似度為97%的稀釋曲線Fig.1 Dilution curve for microbial population structure under 97% similarity

圖2 樣品中門水平細(xì)菌(豐度>0.5%)的群落結(jié)構(gòu)及分布Fig.2 Bacterial community structure and distribution of the samples at phylum level (abundance >0.5%)

2.1.2 生物滯留池中門水平微生物組成差異分析

將相對豐度低于0.5%的門類都合并為others，得到門水平種群分類圖，8個土壤樣品在門水平上的細(xì)菌群落組成如圖2所示．由圖2可見，8個樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)組成總體相似，但各種微生物相對豐度略有差異，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門分類水平上具有較高的多樣性，經(jīng)調(diào)查，樣品A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1和D2中細(xì)菌門類檢測結(jié)果分別為37、37、38、35、34、36、34和35個．

種群分類發(fā)現(xiàn)，本研究中8個生物滯留池表層土壤內(nèi)，相對豐度>0.5%的細(xì)菌共有10個門．其中，變形菌門(Proteobacteria)、放線細(xì)菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門(Firmicutes) 6個門類是優(yōu)勢細(xì)菌菌門，其平均占比依次為29.67%、 21.53%、 12.82%、 12.73%、 10.67%和3.91%，總和占群落的93.49%～94.80%．變形菌門(Proteobacteria)在8個樣本中豐度占比最大，樣本A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1和D2的相對豐度分別為28.69%、29.69%、25.48%、27.55%、33.22%、31.12%、30.70%和30.82%，故變形菌門(Proteobacteria)是優(yōu)勢菌門．有研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門在生物滯留池[13-14]、人工濕地[15-17]和草地[18]的微生物氮磷去除中起到主要作用，其在生物滯留設(shè)施中相對豐度約為25%～68%[7-10]．另外，綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門(Firmicutes)對反硝化也有至關(guān)重要的作用[16-17]．研究發(fā)現(xiàn)，樣本D1、D2(實驗柱對照體系)與樣本B1(高污染道路生物滯留池)中綠彎菌門(Chloroflexi)較其他生物滯留池更多，樣本C1與C2(建筑小區(qū)生物滯留池)中厚壁菌門(Firmicutes)的相對豐度相對與其他6個樣本呈顯著優(yōu)勢．ZUO等[10]的實驗室模擬中，運行良好的實驗柱中厚壁菌門(Firmicutes)和綠彎菌門(Chloroflexi) 的相對豐度波動范圍分別為5%～20%和2%～11%，本研究的結(jié)果亦在該范圍中．

硝化螺菌門(Nitrospirae)是一類革蘭氏陰性菌，其中的硝化螺菌屬(Nitrospira)細(xì)菌可將亞硝酸鹽氧化成硝酸鹽，是直接與徑流污染處理相關(guān)的菌群，硝化螺菌門在樣品A1、A2、B1、B2、C1、C2、D1和D2中的相對豐度分別為0.77%、0.67%、1.27%、0.80%、1.26%、1.18%、1.38%和1.58%；樣品D2中硝化螺菌門的相對豐度最大，是樣品A1和A2的2倍．

2.2 生物滯留池中屬水平功能微生物差異分析

據(jù)文獻(xiàn)[19-21]研究，硝化桿菌屬(Nitrobacter)與硝化螺旋菌屬(Nitrospira)的細(xì)菌都具有硝化功能；亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)、 亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)和亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)具有氨氧化功能；不動桿菌屬(Acinetobacter)、 假單胞菌屬(Pseudomonas)、 芽孢桿菌屬(Bacillus)、 硫桿菌 (Thiobacillus)、 賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)、 羅思河小桿菌屬(Rhodanobacter)、 熱單胞菌屬(Thermomonas)和克氏桿菌屬(Klebsiella)等具有反硝化的作用，參與氮的轉(zhuǎn)化．因此，重點關(guān)注8個典型生物滯留池中相關(guān)功能菌屬的總相對豐度(圖3和圖4)．調(diào)查不同樣本中以上幾種硝化與反硝化功能菌屬的相對豐度，發(fā)現(xiàn)硝化細(xì)菌與反硝化細(xì)菌在不同樣本中占比不同．

圖3 生物滯留池中硝化功能菌屬的相對豐度Fig.3 The relative abundance of functional genera related with nitrifying in bioretention cells

如圖3，在生物滯留池中檢出的相對豐度大于0.1%的具有硝化相關(guān)作用的微生物主要分布在5個菌屬中，包括亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae)、硝化螺旋菌屬(Nitrospira)、 亞硝化螺旋菌屬(Nitrosospira)、 亞硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)和硝化桿菌屬(Nitrobacter)． 就硝化細(xì)菌的總量而言，各生物滯留池樣本相差不大，其相對豐度占所有菌總和的2%左右．其中，亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae)屬于β-變形菌門(β-proteobacteria)，硝化螺旋菌屬(Nitrospira)屬于硝化螺菌門(Nitrospirae)．

人工濕地是另一種處理非點源污染氮負(fù)荷的技術(shù)手段，與生物滯留池在結(jié)構(gòu)與功能方面存在一定的相似性，比較對兩者內(nèi)部關(guān)鍵硝化反硝化菌屬的研究結(jié)果[24]可知，亞硝化單胞菌(Nitrosomonas)在生物滯留池和人工濕地土壤中都是主要優(yōu)勢氨氧化細(xì)菌，但是在人工濕地中，亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)和亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)也是很常見的優(yōu)勢菌，然而這些菌屬在本次生物滯留池的研究中則完全沒有發(fā)現(xiàn)．可見生物滯留池與人工濕地等類似設(shè)施之間微生物結(jié)構(gòu)可能存在差異．

就反硝化菌而言，在生物滯留池中檢出的相對豐度大于0.1%，具有反硝化相關(guān)作用的微生物主要分布在9個菌屬中，各樣本中平均相對豐度最高的是芽孢桿菌屬(Bacillus)， 其次是賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)與假單胞菌屬(Pseudomonas)， 如圖4．由于硝化與反硝化菌屬在自然環(huán)境中通常不具有豐度優(yōu)勢，以往研究較少．吳瀟[7]的研究注意到，假單胞菌屬(Pseudomonas)在生物滯留池的淹沒區(qū)出現(xiàn)，豐度約為1.39%，與本研究樣本C2的豐度水平接近．總體而言，本研究的原位生物滯留池中反硝化生物種類較為豐富，檢出的9種反硝化菌屬，都是在表面流人工濕地中常見的反硝化功能菌屬[17,19]．

圖4 生物滯留池中反硝化功能菌屬的相對豐度Fig.4 The relative abundance of functional genera related with denitrifying in bioretention cells

樣本C1和C2中的反硝化細(xì)菌群落的相對豐度占比明顯高于其他樣本，均超過7.5%，是取自公園和道路4個樣點中反硝化細(xì)菌相對豐度的3.3～5.1倍．樣本C1、C2、D1和D2的生物滯留池都沒有50～60 cm的工程土壤，由于反硝化細(xì)菌多為厭氧菌，更深的土壤層厚度與植物密集間種，根系叢生帶來的濕潤土壤環(huán)境將有利于在土壤團(tuán)粒中形成厭氧微環(huán)境，因此，具備以上特點的高臺生物滯留池樣本C1與下沉式生物滯留池樣本C2中反硝化功能菌屬的相對豐度更高．樣本D1和D2的生物滯留池雖然土壤深度較深，但僅有蘆葦一種植物，據(jù)此推測，生物滯留池種植植物的種類及方式(單種或間種)，或?qū)Ψ聪趸?xì)菌的相對豐度產(chǎn)生影響．樣本B1和B2中反硝化菌的相對豐度雖然較低，但所檢出的反硝化功能菌屬的種類豐富度卻優(yōu)于樣本C1、C2、D1和D2，這可能與樣本B1和B2取自位于非機隔離帶中的生物滯留池，接收到的地表沖刷徑流中污染物種類更為復(fù)雜有關(guān)．

2.3 生物滯留池中硝化反硝化功能基因分析

調(diào)查樣品中表征硝化作用的amoA-AOA與amoA-AOB基因，以及表征反硝化作用的nirK、nirS和nosZ基因，如圖5．研究表明，生物滯留池中硝化反硝化功能基因拷貝數(shù)在不同類型的生物滯留池中表現(xiàn)出明顯的空間分異．在市政道路類型的生物滯留池樣點(B組)中，硝化功能基因豐度與反硝化功能基因豐度與其他樣本相比具有顯著差異，顯著高于其他樣本，特別是氨氧化細(xì)菌中的amoA基因豐度與其他樣本中amoA基因豐度差異超過10倍．樣本B1與B2中功能基因的豐度表現(xiàn)出的特異性與其接受的徑流污染物濃度較高有關(guān)．同時，CHEN等[11]在美國所調(diào)查的生物滯留池樣本中，處在污水匯流區(qū)域、平均淹沒時間較其他采樣區(qū)域更長的位置所測到的反硝化基因nirS、nirK和nosZ的豐度更高．高污染濃度暴露的長期馴化，使得這些體系中氮轉(zhuǎn)化基因片段的累積更高．

圖5 生物滯留池表層土中硝化與反硝化功能基因拷貝數(shù)Fig.5 Gene copy numbers in soil of sampling sites related with nitrifying and denitrifying in bioretention cells

另外，生物滯留池池中監(jiān)測到的氨氧化細(xì)菌amoA基因的平均拷貝數(shù)高于氨氧化古菌amoA基因．MORSE等[8,11]的研究也表明，硝化功能基因amoA-AOB的豐度同常較其中的反硝化功能基因nirK、nirS和nosZ的平均豐度低1～3個數(shù)量級，這與本研究的調(diào)查結(jié)果一致．

本研究中發(fā)現(xiàn)生物滯留池中amoA-AOB基因的豐度水平最高值約為8.5×106g-1(每克風(fēng)干土壤中目的基因的拷貝數(shù))，同時也與表面流人工濕地底泥中amoA-AOB基因的豐度水平相近，低值僅為5.9×104g-1，與中國典型溫帶草原和草甸草原的豐度水平類似．對于反硝化基因豐度，生物滯留池中nosZ的豐度與中國草甸草原中nosZ的豐度比較類似，較德國半自然草原的豐度更低[18,24]．故污染負(fù)荷較低的生物滯留池硝化反硝化基因的豐度水平更接近自然生境，如污染負(fù)荷較高，則有可能更接近人工濕地沉積物．

2.4 生物滯留池中微生物群落分布與環(huán)境因子相關(guān)性分析

圖6 生物滯留池中環(huán)境因子與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)系Fig.6 Redundancy analyses for correlations between bacteria community structure and environmental factors

3 結(jié) 論

本研究采用構(gòu)建基因文庫和實時熒光定量的方法，在生物分子水平上對深圳市典型生物滯留設(shè)施的環(huán)境樣本進(jìn)行分析，調(diào)查了總細(xì)菌的多樣性與門水平分布，分析了其中硝化反硝化功能菌屬的群落結(jié)構(gòu)、功能基因豐度及其與環(huán)境因子的關(guān)系．研究得出：

1)生物滯留池中主要優(yōu)勢菌門有6種，根據(jù)相對豐度水平排序依次為變形菌門(Proteobacteria)、放線細(xì)菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、酸桿菌門(Acidobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)和厚壁菌門(Firmicutes)，其相對豐度占群落的93.49%～94.80%．其中，與氮轉(zhuǎn)化密切相關(guān)的門屬包括變形菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflex)和厚壁菌門(Firmicutes)．

2)生物滯留池微生物群落中相對豐度最高的硝化功能菌是亞硝化單胞菌科(Nitrosomonadaceae(family)_uncultured)和硝化螺旋菌屬(Nitrospira)； 相對豐度最高的反硝化功能菌是芽孢桿菌屬(Bacillus)， 其次是賴氨酸芽孢桿菌屬(Lysinibacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)．

3)生物滯留池中硝化反硝化功能基因拷貝數(shù)在不同類型的生物滯留池中表現(xiàn)出明顯的空間分異．在市政道路類型的生物滯留池樣點中硝化功能基因豐度與反硝化功能基因豐度呈現(xiàn)高值．

4)RDA分析也說明了污染負(fù)荷對反硝化功能基因分布的高解釋性，生物滯留池中反硝化菌更容易受到環(huán)境因子的影響．

綜合各生物滯留池樣地特征分析，實際運行的生物滯留池中氮轉(zhuǎn)化微生物的多樣性及功能基因的豐度受到體系結(jié)構(gòu)、植被類型與污染負(fù)荷的綜合作用．植被層選擇多種植物間種或密集種植，且設(shè)置相對較深的填料層，都能為其中的反硝化微生物提供更適宜的環(huán)境．本研究的微生物調(diào)查結(jié)果可為生物滯留池的氮去除功能評估和提高提供思路．

本研究也存在一些局限性，比如對8個實際運行的設(shè)施中微生物的調(diào)查沒有覆蓋深圳市生物滯留池設(shè)施的所有類型和運行條件，特別是沒有對深圳干濕季分明的氣候特征進(jìn)行深入探究，未考慮季節(jié)差異等動態(tài)變化．下一步將對這些方面進(jìn)行深入的研究．