GelMA水凝膠移植修復(fù)椎間盤退變的研究進(jìn)展

胡一村，叢夢(mèng)雪，藺茂強(qiáng)，張芮浩，陳祥義，于得臣，周海宇

1蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，蘭州730030；2甘肅省骨關(guān)節(jié)疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科

下腰痛是一組以下背部、腰骶部和臀部疼痛為主要癥狀的疾病，伴或不伴下肢放射痛。近年來(lái)，下腰痛的發(fā)病率逐年上升，已成為影響人類健康的重要疾病之一。椎間盤退變（IVDD）是導(dǎo)致中老年人下腰痛和殘疾的主要原因。作為一種增齡相關(guān)性疾病，IVDD的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡可能是誘發(fā)IVDD的主要原因［1-2］。因此，抑制炎癥反應(yīng)或椎間盤（IVD）細(xì)胞凋亡是治療IVDD的有效措施。當(dāng)出現(xiàn)終板炎、脊髓壓迫相關(guān)癥狀時(shí)，保守治療效果往往不明顯，大多數(shù)患者最終會(huì)選擇外科手術(shù)治療，如髓核摘除術(shù)、腰椎椎體間融合術(shù)等［3］。但外科手術(shù)有時(shí)會(huì)引起炎癥反應(yīng)、骨不融合等并發(fā)癥，這些并發(fā)癥一直是臨床醫(yī)生面臨的難題［4］。甲基丙烯酸酐化明膠（Gel MA）水凝膠是一種光敏性的生物水凝膠材料，具有良好的生物相容性、機(jī)械性能可調(diào)節(jié)性、光固化性能和生物學(xué)活性等。作為新一代生物組織工程材料，GelMA水凝膠成為生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用研究的熱點(diǎn)，特別是在骨科領(lǐng)域中作為移植材料備受關(guān)注。GelMA水凝膠通過(guò)攜載干細(xì)胞、生長(zhǎng)因子、藥物等，在促進(jìn)骨融合［5］、消除IVD炎癥反應(yīng)［6］和促進(jìn)髓核（NP）組織再生［7］等方面發(fā)揮重要作用，為IVDD外科治療奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。本文結(jié)合文獻(xiàn)就GelMA水凝膠移植修復(fù)IVDD的研究進(jìn)展作一綜述。

1 GelMA水凝膠概述

1.1 GelMA水凝膠生物合成 GelMA水凝膠是明膠與甲基丙烯酸酐（MA）在50℃磷酸鹽緩沖液中聚合形成的交聯(lián)網(wǎng)狀混合物，屬于光敏性的生物材料。明膠是膠原蛋白的水解產(chǎn)物，屬于細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，含有許多促進(jìn)細(xì)胞黏附的精氨酸—甘氨酸—天冬氨酸序列以及適合的基質(zhì)金屬蛋白酶靶序列［8］。由于MA的引入，使明膠在紫外光和光固化劑存在的情況下快速聚合，這種聚合反應(yīng)可以在室溫、中性pH、水環(huán)境等溫和條件下進(jìn)行，并可控制反應(yīng)時(shí)間［9］。GelMA水凝膠生物合成材料來(lái)源廣泛，無(wú)免疫原性，制備技術(shù)成熟以及獨(dú)特的光固化特性，被認(rèn)為是攜帶靶因子治療臨床疾病的首選載體。

1.2 GelMA水凝膠生物學(xué)特征 Gel MA水凝膠具有良好的細(xì)胞生存和小分子物質(zhì)附著微環(huán)境，這種微環(huán)境有利于增加細(xì)胞間信號(hào)傳遞，促進(jìn)細(xì)胞增殖和維持細(xì)胞定向分化［10］。在特殊光源照射下，GelMA水凝膠被賦予了機(jī)械性能可調(diào)節(jié)性，通過(guò)擠壓式、3D打印等方法和基于已成熟的生物印刷、自組裝和微流體技術(shù)對(duì)其微加工，生成具有可受控結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體，為細(xì)胞增殖和組織再生提供了3D微環(huán)境［11］。目前，GelMA水凝膠被廣泛用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究，如細(xì)胞增殖、分化和遷移等［12］。

GelMA水凝膠保留了明膠出色的生物相容性和生物學(xué)活性，并且具有更高的溶解性和更低的抗原性。更重要的是，明膠與MA的聚合賦予了GelMA水凝膠光交聯(lián)特性，它可以生成甲基丙烯酰骨架，通過(guò)機(jī)械微調(diào)生成速率、酸堿度以及光照時(shí)間等方式來(lái)滿足移植治療不同疾病的需求［13］。GelMA水凝膠還可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）產(chǎn)生更多的ECM、蛋白多糖、膠原蛋白Ⅱ和氨基聚糖等，保障了細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖所需的營(yíng)養(yǎng)供給，從而促進(jìn)了組織修復(fù)。此外，GelMA水凝膠與天然ECM非常類似，這有利于不同類型細(xì)胞在凝膠支架內(nèi)黏附、擴(kuò)散和增殖［14］?？傊?，GelMA水凝膠的生物學(xué)特征為移植治療IVDD奠定了生物學(xué)基礎(chǔ)。

2 GelMA水凝膠在IVDD移植修復(fù)中的作用

近年來(lái)，組織工程移植研究發(fā)展迅速，但單純靶細(xì)胞或小分子蛋白移植存在移植物丟失或被免疫系統(tǒng)清除的可能，這是單純靶因子移植的最大障礙［15］。而GelMA水凝膠可搭載干細(xì)胞、骨形態(tài)發(fā)生蛋白或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子等，能夠保證移植分子的穩(wěn)定性，最大程度發(fā)揮移植物誘導(dǎo)成骨分化、消除炎癥反應(yīng)等作用，在一定程度上解決了既往移植療法的瓶頸［16］。此外，GelMA水凝膠還可直接充當(dāng)填充劑用于IVD支架的構(gòu)建和骨缺損治療。

2.1 負(fù)載生長(zhǎng)因子，促進(jìn)骨融合 既往研究表明，MSCs具有向骨、軟骨等細(xì)胞分化的潛能，并且細(xì)胞獲取簡(jiǎn)單、免疫原性低，被認(rèn)為是促進(jìn)骨融合最佳的種子細(xì)胞［17］。有研究報(bào)道，低水平TGF-β可通過(guò)直接刺激骨祖細(xì)胞分化為成骨細(xì)胞，還可通過(guò)形成細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，從而調(diào)控成骨細(xì)胞增殖，促進(jìn)骨形成［18］。而GelMA水凝膠能夠增強(qiáng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化的能力。據(jù)報(bào)道，相較于14-3-3ε蛋白，GelMA水凝膠誘導(dǎo)人MSCs向成骨細(xì)胞分化更具優(yōu)勢(shì)［19］。SUN等［20］在大鼠顱骨缺損模型中亦發(fā)現(xiàn)，GelMA水凝膠能夠誘導(dǎo)MSCs向成骨細(xì)胞分化。盡管GelMA水凝膠在人MSCs向成骨細(xì)胞分化中的具體機(jī)制尚不清楚，但GelMA水凝膠作為細(xì)胞因子載體負(fù)載MSCs，為手術(shù)治療IVDD提供了理論依據(jù)。

2.2 負(fù)載藥物，抑制炎癥反應(yīng) 眾所周知，IVDD屬于炎癥相關(guān)性疾病，而炎癥微環(huán)境是其發(fā)生、發(fā)展的重要因素［21］。有研究報(bào)道，在IVD切除術(shù)后，IVD內(nèi)炎癥反應(yīng)可持續(xù)14 d，且炎癥微環(huán)境改變與炎癥周期呈正相關(guān)［22］。因此，準(zhǔn)確把握炎癥反應(yīng)時(shí)間、控制炎癥微環(huán)境有利于患者術(shù)后恢復(fù)。目前，消除炎癥反應(yīng)的主要方法是口服或靜脈注射抗炎藥物，但I(xiàn)VD無(wú)血管組織，口服或靜脈注射抗炎藥物的療效甚微，并且合并胃潰瘍或高血壓的IVDD患者藥物口服還可造成胃腸道或心血管損害［23］。因此，迫切需要一種靶向輸送抗炎藥物的載體。

GelMA水凝膠可負(fù)載抗炎藥物并將其準(zhǔn)確送至炎癥部位。LIU等［6］研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)GelMA水凝膠負(fù)載阿司匹林共移植可精準(zhǔn)覆蓋術(shù)后炎癥灶，緩解局部炎癥反應(yīng)，縮短炎癥周期，維持脊柱結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。GelMA水凝膠負(fù)載抗炎藥物的優(yōu)點(diǎn)在于它能夠?qū)⑺幬镏苯铀椭裂装Y灶，從而保證局部有效藥物濃度，避免口服或靜脈注射帶來(lái)的全身不良反應(yīng)。隨著組織工程技術(shù)不斷發(fā)展和移植技術(shù)不斷成熟，GelMA水凝膠復(fù)合抗炎藥物移植治療IVDD將成為現(xiàn)實(shí)。

2.3 構(gòu)建IVD適宜微環(huán)境 無(wú)論是動(dòng)態(tài)還是靜態(tài)，IVD始終承受高水平的縱向和水平機(jī)械應(yīng)力［24］。NP在脊柱的軸向負(fù)荷中具有重要作用，它能在相鄰椎體之間均勻地分配壓力，而纖維環(huán)能夠很好地保存NP的膠體成分，從而維持NP的位置和形態(tài)，以保證整個(gè)IVD的負(fù)重和軸承作用。目前，學(xué)者們一致認(rèn)為通過(guò)早期植入類NP結(jié)構(gòu)，有助于緩沖NP承載的機(jī)械壓力，但由于IVDD導(dǎo)致IVD結(jié)構(gòu)被破壞，機(jī)械性能發(fā)生改變，移植細(xì)胞的存活率較低。而具有高含水量和流體加壓特性的GelMA水凝膠能夠方便營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和氧氣滲透，為NP細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖提供了良好的IVD微環(huán)境［25］。

NP組織作為具有特殊免疫功能的解剖區(qū)，允許MSCs增殖、分化及ECM生成。研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)改變MA比例，可有效控制GelMA水凝膠的生物學(xué)特性，達(dá)到NP細(xì)胞再生的IVD微環(huán)境［26］。已知5%GelMA水凝膠的交聯(lián)密度更低，篩孔尺寸更大，其機(jī)械和水合特性與天然NP組織類似，這一濃度的GelMA水凝膠有利于維持細(xì)胞增殖以及聚集蛋白聚糖和膠原蛋白Ⅱ表達(dá)。通過(guò)GelMA水凝膠的可注射特點(diǎn)，利用微創(chuàng)方法將干細(xì)胞輸送至IVD內(nèi)，可有效恢復(fù)NP組織功能，加速ECM合成，從而緩解IVDD的臨床癥狀。

此外，水凝膠還可抑制NP細(xì)胞變性。當(dāng)NP細(xì)胞集中在水凝膠表面生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞增殖不會(huì)發(fā)生明顯變化。XU等［26］合成了一種具有可調(diào)節(jié)機(jī)械和水合特性的光交聯(lián)GelMA水凝膠，NP細(xì)胞可與這種水凝膠有效結(jié)合，并且隨著GelMA水凝膠濃度增加，封裝的NP細(xì)胞存活、增殖和ECM沉積逐漸減少，與在水凝膠表面生長(zhǎng)的NP細(xì)胞正好相反。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，接受水凝膠和MSCs聯(lián)合注射的IVD高度指數(shù)以及組織學(xué)狀況得到顯著改善［27］。這些結(jié)果表明，水凝膠是構(gòu)建NP組織工程和修復(fù)內(nèi)源性NP細(xì)胞的有力候選者。

2.4 水凝膠3D打印仿生IVD NP組織摘除后的IVD結(jié)構(gòu)遭到破壞，生物應(yīng)力降低，相鄰椎體節(jié)段和IVD后部應(yīng)力發(fā)生改變，這會(huì)造成脊柱不穩(wěn)。基于GelMA水凝膠特殊的生物學(xué)性能，通過(guò)水凝膠3D構(gòu)建替代摘除的NP組織可能會(huì)改善上述問(wèn)題。范少勇等［28］研究證實(shí)，水凝膠可替代豬IVD的NP組織，移植水凝膠替代摘除的NP組織，IVD顯示出了良好的黏彈特性，且生物力學(xué)性能穩(wěn)定。此外，PEREZSAN VICENTE等［29］將包含造影劑的水凝膠注入牛離體模型NP腔中，在不同頻率下進(jìn)行軸向壓縮—拉伸循環(huán)測(cè)試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)水凝膠移植后的IVD顯示出了良好的生物力學(xué)性能，這為水凝膠的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

現(xiàn)階段手術(shù)治療IVDD對(duì)脊柱局部應(yīng)力和活動(dòng)性能的影響不容忽視，亟需尋找IVD損傷后合適的替代材料。有研究發(fā)現(xiàn)，GelMA水凝膠可滿足特定的組織需求，如由心肌特定的ECM和祖細(xì)胞組成的生物打印“心臟補(bǔ)丁”可用于心臟疾病治療［30］。UYANIKLAR等［31］設(shè)計(jì)了一種混合的角膜基質(zhì)構(gòu)建體用于角膜移植，其療效確切。目前，GelMA水凝膠在臨床器官移植領(lǐng)域中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，通過(guò)GelMA水凝膠3D構(gòu)建椎間系統(tǒng)用于IVDD治療將成為臨床研究的熱點(diǎn)。

3 GelMA水凝膠的臨床應(yīng)用價(jià)值

目前，GelMA水凝膠不僅在整形美容、心臟疾病和眼科疾病等領(lǐng)域得到逐步應(yīng)用，其在單細(xì)胞研究、細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)、藥物和基因傳遞以及生物傳感方面亦表現(xiàn)出一定的應(yīng)用前景。首先，GelMA水凝膠支架的孔隙和對(duì)滲出液的吸收能力，使其負(fù)載特定制劑（如氧化石墨烯）可用于功能性傷口愈合，這為臨床治療慢性創(chuàng)傷提供了一種新的治療方案［32］。其次，由于GelMA水凝膠的生物相容性和機(jī)械性能可調(diào)節(jié)性以及自身存在的生物活性肽序列，使其可在2D或3D實(shí)驗(yàn)中充當(dāng)活性細(xì)胞培養(yǎng)基材料，亦可模擬動(dòng)物體內(nèi)的微環(huán)境。ANTUNES等［33］將人上皮性卵巢癌細(xì)胞封裝在GelMA水凝膠中培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，卵巢癌細(xì)胞顯示出高水平的代謝率和球狀體形態(tài)，有望節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。隨著GelMA水凝膠在臨床上進(jìn)一步應(yīng)用，將為更多疾病的治療帶來(lái)希望。

盡管GelMA水凝膠在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用價(jià)值得到學(xué)者們廣泛認(rèn)可，但亦存在諸多問(wèn)題亟需解決。第一，細(xì)胞黏附和增殖受GelMA水凝膠濃度、劑量的影響明顯，不利于多類型細(xì)胞在同一基質(zhì)中共培養(yǎng)。第二，體外純GelMA水凝膠降解速度較快，不能滿足細(xì)胞增殖時(shí)間較長(zhǎng)的要求。有學(xué)者認(rèn)為，在IVD中度退行性階段可能是水凝膠移植治療IVDD的最佳時(shí)間，但由于此時(shí)臨床癥狀較輕，臨床實(shí)施難度較大。第三，雖然GelMA水凝膠負(fù)載NP細(xì)胞作為IVD支架有助于退變IVD的修復(fù)，但當(dāng)NP和纖維環(huán)同時(shí)遭受損傷時(shí)，單一NP細(xì)胞移植效果不佳，模擬IVD內(nèi)的細(xì)胞再生和基質(zhì)結(jié)構(gòu)以及復(fù)雜結(jié)構(gòu)的功能仍然是一項(xiàng)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。最后，雖然Gel MA水凝膠已逐步用于治療心臟疾病和創(chuàng)口愈合等，但在IVD領(lǐng)域的研究主要集中于體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，其臨床應(yīng)用尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。因此，進(jìn)一步優(yōu)化GelMA水凝膠的生物學(xué)特性和制定規(guī)范的操作標(biāo)準(zhǔn)是目前亟待解決的問(wèn)題。

綜上所述，GelMA水凝膠既可作為攜帶生長(zhǎng)因子的載體，誘導(dǎo)成骨分化，促進(jìn)骨愈合，又可通過(guò)負(fù)載藥物抑制IVD炎癥反應(yīng)，減少術(shù)后并發(fā)癥的發(fā)生。同時(shí)，GelMA水凝膠還可負(fù)載IVD細(xì)胞，從而有效補(bǔ)充外科手術(shù)過(guò)程中丟失的IVD細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)成分。此外，GelMA水凝膠還能構(gòu)建IVD適宜微環(huán)境，3D打印IVD，從而形成IVD移植的組織再生支架。因此，GelMA水凝膠移植有可能成為外科治療IVDD的有效手段。