中華蜜蜂NPC1蛋白AcNPC1的原核表達、多克隆抗體制備及功能鑒定

劉永梅, 史紅霞, 李 顏, 馬振剛, 王林玲, 許金山, 周澤揚, 黨曉群

(重慶師范大學(xué), 重慶市動物生物學(xué)重點實驗室, 重慶市媒介昆蟲重點實驗室, 重慶 401331)

NPC1蛋白是一類廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物體內(nèi)的參與膽固醇運輸?shù)谋Ｊ氐鞍?。人類C型尼曼匹克病(Niemann-Pick disease type C, NPC)是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病(占克斌等, 2007)，其中約有95%的NPC患者是由NPC1突變引起膽固醇代謝障礙所致(Carsteaetal., 1997)。NPC1基因位于人類18號染色體上，是一個由1 278個氨基酸組成13次跨膜蛋白，屬于疏水性膜蛋白(Ericksonetal., 2008)，NPC1蛋白在核內(nèi)體內(nèi)腔形成3個腔內(nèi)結(jié)構(gòu)域：分別為A結(jié)構(gòu)域(NPC1-A)、C結(jié)構(gòu)域(NPC1-C)和I結(jié)構(gòu)域(NPC1-I)(Scott and Ioannou, 2004)；NPC1-C是三者中最大的結(jié)構(gòu)域，該區(qū)域主要功能是與NPC2發(fā)生相互作用(Lietal., 2016)，共同調(diào)控膽固醇的外流，將膽固醇運輸出核內(nèi)體和溶酶體，以便維持細胞內(nèi)的酯類動態(tài)穩(wěn)定，同時該區(qū)域也能夠在蛋白酶作用下與埃博拉病毒的GP蛋白進行互作(Zhaoetal., 2016)，介導(dǎo)病毒感染宿主細胞，由于不同物種間NPC1-C的序列差異性(如第503位的苯丙氨酸)影響了埃博拉病毒對不同種細胞的侵染能力(Neufeldetal., 1999)。

有研究表明果蠅Drosophia基因組編碼兩個NPC1同系物，分別命名為NPC1a和NPC1b，與人類NPC1蛋白的同源性分別為42%和35%(Fluegeletal., 2006)。研究人員利用果蠅NPC1a突變體分析，發(fā)現(xiàn)NPC1a突變體無法合成蛻化類固醇，突變體1齡幼蟲期延長且無法蛻皮進入2齡幼蟲，甚至死亡，NPC1a突變體幼蟲死亡，暗示了NPC1a是生物合成蛻皮類固醇所必需的蛋白(Huangetal., 2005)；在家蠶Bombyxmori中，NPC1基因被干涉后，發(fā)現(xiàn)部分家蠶蛻皮推遲，推測該基因與家蠶蛻皮過程相關(guān)(晁會娟, 2017)。同時也有研究者利用果蠅NPC1b的突變體，發(fā)現(xiàn)該果蠅幼蟲無法吸收膽固醇，從而引起1齡幼蟲死亡(Voghtetal., 2007)。

此外，NPC1蛋白是大多數(shù)囊膜病毒侵染細胞的重要受體(Krishnanetal., 2012)，Carette等(2011)研究表明，NPC1是埃博拉病毒侵染時的受體蛋白，通過突變NPC1細胞能有效抑制埃博拉病毒的侵染，而當(dāng)細胞表達野生型NPC1后其又能恢復(fù)對病毒的易感性，說明該病毒的侵染是依賴NPC1蛋白的存在；NPC1抑制劑丙咪嗪能夠強烈抑制丙肝病毒(Hepatitis C virus, HCV)(Sainzetal., 2012)、登革熱病毒(dengue virus)(Jupatanakuletal., 2014)的增殖，暗示這些病毒的侵染可能與NPC1存在一定的相關(guān)性。

由此，NPC1是在生命體中承擔(dān)著膽固醇運輸?shù)慕巧?，同時起著多種囊膜病毒侵染的宿主橋梁。因此調(diào)查中華蜜蜂NPC1的表達以及其與CSBV病毒感染之間的關(guān)系，不僅為進一步深入了解NPC1蛋白在蜜蜂的生長發(fā)育中的重要功能奠定基礎(chǔ)，也為揭示CSBV病毒入侵過程提供新思路，為開發(fā)中囊病有效防控新靶標(biāo)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試昆蟲與病毒

健康的中華蜜蜂由重慶師范大學(xué)資源與媒介昆蟲重點實驗室提供；CSBV病毒分離于重慶酉陽某養(yǎng)蜂場。

1.2 菌株、質(zhì)粒載體和試劑

實驗所用的大腸桿菌Escherichiacoli菌株DH5α和表達菌株RosettaTM(DE3)均購于成都天泰生物技術(shù)有限公司；擴增目的基因的引物由重慶生工生物有限公司合成；制備多克隆抗體所使用的昆明雌性小鼠購于重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司；Premix Taq DNA聚合酶、pMD19-T Vector、BamHⅠ內(nèi)切酶、XbaⅠ內(nèi)切酶、2000 bp DNA Marker、5000 bp DNA Marker、Solution Ⅰ連接酶、PrintScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司；Trizol Reagent、雙色預(yù)染蛋白Marker、膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、FITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗、HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗購于重慶奧哲生物有限公司；IPTG、X-Gal、Ampicillin、瓊脂糖、異丙醇、Tris飽和酚、酵母提取物、蛋白胨、瓊脂粉購于重慶生工生物有限公司，PVDF膜購于Promega公司，ECL顯色液購于Bio-Rad公司。

1.3 AcNPC1基因序列的生物信息學(xué)分析

AcNPC1基因序列和蛋白質(zhì)序列下載于NCBI(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)；然后分別用SMART(http:∥smart.embl-heidelberg.de/smart/)、SignalP 4.1 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、NetPhos 3.1 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、NetNGlyc 1.0 (http:∥www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)和SWISS-MODEL(https:∥swissmodel.expasy.org/)對AcNPC1的蛋白質(zhì)序列特征進行預(yù)測。同時，通過NCBI的Blast比對后，下載與AcNPC1序列相似性高的序列，選用MEGA 5.0中鄰接法進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，并將bootstrap值設(shè)為1 000。

1.4 AcNPC1基因克隆及原核表達載體構(gòu)建

使用BioXM、primer5.0軟件設(shè)計中華蜜蜂AcNPC1(GenBank登錄號: XP_016906844.1)的引物(表1)。添加XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點。采用 Trizol法提取中華蜜蜂總RNA，參照Roche EvoScript Universal cDNA Master試劑盒操作說明進行反轉(zhuǎn)錄，測定濃度后放置于-20℃保存?zhèn)溆?。以中華蜜蜂cDNA為模板擴增AcNPC1基因，反應(yīng)體系: 正反向引物(0.5 μmol/L)各1 μL, cDNA模板1 μL, Premix rTaq 12 μL, ddH2O 10 μL。PCR擴增程序：95℃預(yù)變性5 min; 95℃變性40 s, 55℃退火1 min, 72℃ 1 min, 35個循環(huán); 72℃延伸10 min。通過瓊脂糖凝膠電泳分離并回收目的片段，酶切后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，菌液均勻涂布于含有0.1 mol/L氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基平板，隨機挑取單菌落經(jīng)菌液PCR和雙酶切檢測后，送公司進行核苷酸測序。對測序正確的陽性克隆菌提取質(zhì)粒，通過XbaⅠ和BamHⅠ酶切位點亞克隆至pET-30a表達載體，進行PCR和雙酶切鑒定。

(2) Logistic回歸以液化概率50%作為液化和非液化區(qū)分時模型的預(yù)測準確率為87.7%，這與其他的研究結(jié)果相近；雖然準確率為非連續(xù)變量，但該結(jié)果可作為砂土地震液化確定性分析的一個參考。

1.5 AcNPC1蛋白的原核表達和純化

將獲得陽性重組表達質(zhì)粒pET-30a-AcNPC1和pET-30a空載質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌RosettaTM(DE3)培養(yǎng)。 以220 r/min、37℃振蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，兩種菌液各取1支作為對照(37℃未誘導(dǎo)組)，余下4支試管中各加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG在37℃誘導(dǎo)培養(yǎng)7～8 h；分別收集試管中未誘導(dǎo)以及誘導(dǎo)的菌液，經(jīng)低溫超聲波破碎儀破碎菌體后，沉淀用含8 mol/L尿素的Binding Buffer緩沖液裂解，經(jīng)14 000 r/min離心10 min取上清進行SDS-PAGE電泳檢測。

用已滅菌處理的ddH2O清洗His鎳柱，并用Binding Buffer緩沖液平衡His鎳柱；將上述已過膜的上清蛋白溶液加至His鎳柱中循環(huán)上樣15～20 min；上樣完成后用Binding Buffer緩沖液沖洗柱子，再用Elution Buffer緩沖液進行洗脫，離心管收集洗脫液，每管約收集0.5 mL，每次接6個離心管；用ddH2O清洗柱子后，再使用Binding Buffer平衡鎳柱，重復(fù)以上步驟收集目的蛋白。最后通過SDS-PAGE電泳檢測純化的重組蛋白。

1.6 AcNPC1多克隆抗體的制備及檢測

將1.5節(jié)純化好的AcNPC1原核表達蛋白作為抗原，與等體積的弗氏完全佐劑混勻，皮下注射小鼠，第一次進行免疫時，蛋白量為0.1 mg蛋白/小鼠，之后每隔一周進行一次免疫，將重組蛋白與等體積的弗氏完全佐劑混勻，皮下注射小鼠，蛋白與第一次的免疫量一致；最后一次免疫完成后的第4天，對小鼠進行眼球采血，將采集到的血液于37℃恒溫箱中靜置1 h后，轉(zhuǎn)至4℃冰箱中放置過夜，直至血清析出，在無菌超凈臺中將血清轉(zhuǎn)移至新的離心管中，小量分裝做好標(biāo)記后，于-20℃保存待用。將多克隆抗體按1∶200(v/v)稀釋比稀釋后作為一抗，與1.5節(jié)純化、透析后獲得的AcNPC1進行免疫印跡檢測所制備抗體的特異性。為了進一步了解AcNPC1在中華蜜蜂中表達情況，首先采用玻璃珠破碎法獲取中華蜜蜂總蛋白作為抗原，并以AcNPC1鼠抗多抗作為一抗(稀釋比為1∶2 000, v/v)，HRP標(biāo)記的羊抗兔(稀釋比為1∶5 000, v/v)作為二抗進行蛋白免疫印跡分析。

1.7 AcNPC1的RNAi

為了進一步研究AcNPC1是否參與了CSBV侵染過程，利用在線siRNA預(yù)測網(wǎng)站(http:∥rnaidesigner.lifetechnologies.com)對AcNPC1的siRNA位點進行預(yù)測，設(shè)計3個干涉片段(siRNA1, siRNA2和siRNA3)(表1)，其中，siRNA1和siRNA2靶向AcNPC1基因的胞內(nèi)環(huán)2區(qū)域(1 712-1 737 bp和1 532-1 557 bp)，siRNA3靶向AcNPC1基因的5′UTR區(qū)(66-91 bp)，送至上海生物工程有限公司合成。RNAi陰性對照使用實驗室利用L4440載體表達并純化的dsGFP(502 bp)(史紅霞等, 2019)。中華蜜蜂幼蟲的飼養(yǎng)參見文獻(王倩, 2008; 史紅霞等, 2019)。siRNA的添食實驗設(shè)置A和B組，其中A組包括正常幼蟲、正常幼蟲+siRNA1、正常幼蟲+siRNA2、正常幼蟲+siRNA3處理組；B組包括感染CSBV幼蟲、感染CSBV幼蟲+siRNA1、感染CSBV幼蟲+siRNA2、感染CSBV幼蟲+siRNA3處理組;每個處理組設(shè)計3個生物學(xué)重復(fù)(添加siRNA和dsGFP量均為2.2 μg/幼蟲)。從巢脾中挑取大小適中的2日齡中華蜜蜂幼蟲>200頭，在人工培養(yǎng)箱黑暗培養(yǎng)12 h死亡和體色不正常的幼蟲移除，確保每組幼蟲數(shù)量至少20頭，A組添加20 μL/頭食物，B組添加20 μL/頭食物(含有CSBV液，2.1×109copies/μL)，12 h后，分別添加siRNA，同時添加食物20 μL。12, 24, 48和72 h后進行取樣。每組取3～4頭幼蟲，放入相應(yīng)的離心管中，-80℃冰箱保存。

1.8 RT-qPCR檢測AcNPC1基因的相對表達量

分別收集1.7節(jié)中的中華蜜蜂正常幼蟲和CSBV感染12, 24, 48和72 h的幼蟲、健康幼蟲和感染CSBV幼蟲不同siRNA干涉組、dsGFP對照組等材料，采用Trizol法提取總RNA，通過RT-qPCR檢測AcNPC1基因和CSBV VP1基因(GenBank登錄號: AF469603.1)在CSBV感染過程中的轉(zhuǎn)錄水平，引物序列見表1。RT-qPCR體系: Master Mix 2×conc 10 μL, 正反向引物(0.005 μmol/L)各1 μL, ddH2O 7 μL，將上述體系冰上混勻后，移至PCR 8聯(lián)排反應(yīng)管中，加入相應(yīng)的cDNA模板1 μL混勻。RT-qPCR反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性 5 min; 95℃變性40 s, 55℃退火1 min, 72℃延伸50 s, 30個循環(huán)；72℃終延伸10 min，12℃保存。反應(yīng)后進行溶解曲線分析。CFX96TMTouch實時定量PCR系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)記錄分析，每個樣品為3頭幼蟲混合后抽提總RNA，至少重復(fù)3次，并進行3次獨立實驗。AcActin為內(nèi)參基因。

1.9 數(shù)據(jù)分析

RT-qPCR數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCt方法計算，利用SPSS19.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，干擾效率的表達比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和t檢驗進行顯著性檢驗(雙尾)，P<0.05時有顯著性差異?；蛩较抡{(diào)率按照以下公式計算：

下調(diào)率(%)=[(正?；虮磉_量-干擾后該基因表達量)/正?；虮磉_量]×100%。

2 結(jié)果

2.1 中華蜜蜂AcNPC1基因序列的特征分析

通過NCBI數(shù)據(jù)庫檢索及比對，發(fā)現(xiàn)存在3條東方蜜蜂A.cerana的NPC1基因序列，選取NPC1基因序列(GenBank登錄號: XP_016906844.1)為研究對象，命名為AcNPC1，AcNPC1由1 339個氨基酸組成，蛋白的分子量大小預(yù)測為149.79 kD，等電點為6.37，信號肽剪切位點位于第22和23個氨基酸之間，含有12個N-和8個O-糖基化位點，多個磷酸化修飾位點，推測AcNPC1可能為糖蛋白。通過序列比對發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂AcNPC1與已報道的NPC1家族成員相似，都包含信號肽、跨膜域和3個典型的功能域，分別是NTD結(jié)構(gòu)域(N-terminal domain)(第24-264位氨基酸)，SSD結(jié)構(gòu)域(sterol-sensing domain)(第615-797位氨基酸)及PTC結(jié)構(gòu)域(patched domain)(第855-1 098位氨基酸)，其中NPC1和NPC2結(jié)合的結(jié)構(gòu)域命名為C結(jié)構(gòu)域(第371-615位氨基酸)，但AcNPC1有14個跨膜域而非13個跨膜域。

以人類NPC1蛋白(3jd8.1.A)的三維結(jié)構(gòu)為模板，利用在線軟件繪制中華蜜蜂AcNPC1的三維結(jié)構(gòu)圖。軟件數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示中華蜜蜂AcNPC1蛋白與人類NPC1序列大約為46.79%的相似性。結(jié)構(gòu)域預(yù)測分析顯示中華蜜蜂AcNPC1的兩個蛋白都存在多次跨膜和3個大的膜外功能區(qū)，分別為A結(jié)構(gòu)域、C結(jié)構(gòu)域和I結(jié)構(gòu)域，3個膜外功能區(qū)相互堆積形成三維空間結(jié)構(gòu)，與人類NPC1蛋白相似，其中NTD結(jié)構(gòu)域即A結(jié)構(gòu)域位于結(jié)構(gòu)的最上方，雖然NTD結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)環(huán)2的保守性最低，但存在較為保守的半胱氨酸位點，由于半胱氨酸(Cys)之間可以形成分子內(nèi)和分子間二硫鍵，在蛋白相互作用以及蛋白正確折疊中起著重要作用，同時由于NTD結(jié)構(gòu)域處于膜外區(qū)，推測NTD結(jié)構(gòu)域在AcNPC1蛋白運輸膽固醇過程中扮演著重要角色。PTC結(jié)構(gòu)域即I結(jié)構(gòu)域和SSD結(jié)構(gòu)域分別位于下方兩側(cè)，三者形成了類似三角形的結(jié)構(gòu)C結(jié)構(gòu)域是NPC1與NPC2互作共同介導(dǎo)膽固醇的運輸，也是人NPC1與埃博拉病毒結(jié)合的區(qū)域。

為了進一步了解中華蜜蜂AcNPC1在不同物種間的進化關(guān)系，利用MEGA 5.0軟件對東方蜜蜂與其他物種的NPC1蛋白序列進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果表明，東方蜜蜂NPC1和西方蜜蜂ApismelliferaNPC1始終聚為一枝(圖1)。蜜蜂NPC1與膜翅目和雙翅目NPC1的同源性非常高，序列一致性超過50%，蜜蜂與脊椎動物的親緣關(guān)系較遠，但仍然存在41%NPC1序列一致性，屬于較高同源性；NPC1在脊椎動物和無脊椎動物中都具有較高的同源性，說明該NPC1蛋白在物種進化過程中是比較保守的。

圖1 基于氨基酸序列構(gòu)建的東方蜜蜂和其他物種NPC1蛋白的系統(tǒng)進化樹(鄰接法)

2.2 中華蜜蜂AcNPC1原核表達

PCR擴增獲得了長度約為650 bp的條帶(圖2: A)，與理論長度一致，命名為AcNPC1。將AcNPC1與pMD19-T連接，經(jīng)測序驗證正確后(圖2: B)，將AcNPC1與表達載體pET-30a連接構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pET-30a-AcNPC1，進行PCR檢測和雙酶切驗證(圖2: C)，結(jié)果表明重組表達質(zhì)粒pET-30a-AcNPC1構(gòu)建成功。

圖2 中華蜜蜂AcNPC1基因PCR擴增(A)、驗證(B)和原核表達載體構(gòu)建(C)

2.3 重組蛋白AcNPC1的誘導(dǎo)表達及表達形式

將驗證正確的pET-30a-AcNPC1重組表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)入原核表達載體RosettaTM(DE3)進行體外蛋白原核表達，利用0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達，產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳檢測，結(jié)果如圖3(A)所示，IPTG誘導(dǎo)下獲得了蛋白分子量約為36 kD的目的蛋白帶。利用Ni-NTA superflow cartridges以含8 mol/L尿素的洗脫緩沖液對重組蛋白進行純化與富集，將收集的蛋白溶液進行SDS-PAGE電泳檢測(圖3: B)，5-8泳道為純化蛋白隨機取樣的電泳結(jié)果，條帶單一，表明純化效果較好。由于高濃度的尿素對細胞有毒害作用，在免疫小鼠時可能產(chǎn)生造成一定的傷害甚至死亡，因此采用透析將尿素含量降低至2 mol/L，將透析后的蛋白溶液進行SDS-PAGE蛋白電泳檢測(圖3: C)，結(jié)果顯示透析后的蛋白濃度較高，通過純化及透析共制得約10 mg重組蛋白作為抗原制備多克隆抗體。

圖3 SDS-PAGE檢測中華蜜蜂AcNPC1重組蛋白的誘導(dǎo)表達(A)及純化(B和C)

圖4 Western blot檢測抗血清對重組蛋白AcNPC1(A)和中華蜜蜂總蛋白(B)的特異性

2.4 中華蜜蜂抗AcNPC1多克隆抗體

用純化后重組蛋白AcNPC1作為抗原制備鼠多克隆抗體，將多克隆抗體與上述純化、透析后的重組蛋白AcNPC1進行蛋白免疫印跡分析(4: A)，在分子量為36 kD左右處有一條明顯的雜交信號條帶，表明抗體AcNPC1是特異性與重組蛋白AcNPC1反應(yīng)。進一步免疫印跡分析AcNPC1在中華蜜蜂中的表達情況，結(jié)果表明(4: B)，AcNPC1抗體可以從中華蜜蜂總蛋白中雜交到兩條帶，分別約70和30 kD，推測可能原因是膜蛋白的提取比較困難，AcNPC1在提取過程中發(fā)生了部分降解。

2.5 siRNA對中華蜜蜂AcNPC1表達水平的影響

RT-qPCR數(shù)據(jù)分析表明，與對照相比(正常幼蟲)，給正常中華蜜蜂幼蟲分別添食AcNPC1的siRNA1, siRNA2和siRNA3后，siRNA1片段最先開始表現(xiàn)出干涉效果，在添食12 h后AcNPC1基因表達下調(diào)了66.19%(P<0.05)，siRNA1, siRNA2和siRNA3干擾24 h時均使AcNPC1基因表達顯著下調(diào)(P<0.01)，分別下調(diào)了73.20%, 72.81%和54.78%；在添食48 h后siRNA1仍具有干涉效果(P<0.05)，AcNPC1基因表達下調(diào)了57.76%(圖5)。與CSBV添毒幼蟲相比，感染CSBV的幼蟲在添食siRNA1片段 12 h后AcNPC1基因表達開始出現(xiàn)下調(diào)(P<0.05)，下調(diào)了48.07%，24 h后AcNPC1基因表達下調(diào)了43.90%(P<0.05)；添食siRNA2和siRNA3 48 h后，感染CSBV的幼蟲AcNPC1基因表達出現(xiàn)顯著性下調(diào)(P<0.01)，分別下調(diào)了59.85%和57.67%(圖5)，說明siRNA1, siRNA2和siRNA3 3個干涉片段均對CSBV添毒幼蟲中的AcNPC1具有干擾作用，其中siRNA3效果最為明顯。圖6顯示，使用siRNA1干擾AcNPC1后12 h，與未干擾組相比，CSBV VP1基因表達量明顯降低并逐漸下降，到72 h時，CSBV VP1基因的表達水平下調(diào)了67.65%(P<0.01)，而此時該實驗組中AcNPC1的表達并未被siRNA1顯著下調(diào)(圖5)，暗示CSBV病毒含量的變化與AcNPC1的表達并不直接相關(guān)。

3 討論

NPC1蛋白是胞內(nèi)運輸膽固醇的重要受體蛋白，是維持人體健康的重要因子，其突變將會使細胞中膽固醇和鞘糖脂等脂類沉積在晚期胞內(nèi)體、溶酶體，從而引發(fā)疾病。多種研究表明NPC1蛋白也參與了多種囊膜病毒侵染宿主細胞過程，說明NPC1蛋白不僅維持細胞正常生理活動所必需的，也是及其重要的病毒侵染因子即協(xié)助囊膜病毒進入細胞。中蜂囊狀幼蟲病病毒(CSBV)是嚴重威脅中華蜜蜂的健康病原之一，CSBV屬于無囊膜的RNA病毒，目前對無囊膜的RNA病毒的入侵機制已有大量研究，但受體介導(dǎo)病毒入侵的機制尚不清楚，而CSBV作為無囊膜病毒的代表無疑是最好的研究材料之一，因此本研究對中華蜜蜂AcNPC1在CSBV侵染蜜蜂是否相關(guān)進行初步探索。

圖5 siRNA對中華蜜蜂正常幼蟲和感染CSBV幼蟲中AcNPC1表達的影響

圖6 siRNA 干擾AcNPC1對感染CSBV的中華蜜蜂幼蟲中CSBV VP1基因表達水平的影響

通過對中華蜜蜂NPC1序列信息的深入分析，為了研究NPC1是否與CSBV存在互作，我們選取NPC1蛋白與埃博拉病毒結(jié)合的區(qū)域為靶標(biāo)，構(gòu)建原核表達載體，進行IPTG誘導(dǎo)表達，得到了蛋白分子量為36 kD重組蛋白，并以其為抗原進行動物免疫，獲得相應(yīng)的抗血清，將收集得到的血清與重組蛋白進行免疫印跡分析雜交到一條特異的、分子量大小約為36 kD的蛋白質(zhì)條帶。而與中華蜜蜂總蛋白的免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)，NPC1抗體能雜交到兩條帶，有可能是在提取膜蛋白過程中該蛋白發(fā)生了部分降解。

本研究利用RT-qPCR從mRNA水平檢測了AcNPC1基因在正常中華蜜蜂幼蟲和感染CSBV中華蜜蜂幼蟲中的表達水平，結(jié)果顯示正常幼蟲中AcNPC1基因表達量呈先下調(diào)后上調(diào)趨勢(圖5)。為了進一步確定AcNPC1是否參與了CSBV感染宿主的過程，我們通過體外飼喂siRNA下調(diào)AcNPC1基因表達后，檢測CSBV病毒在蜜蜂幼蟲中的增殖情況。RT-qPCR數(shù)據(jù)表明，正常幼蟲中AcNPC1的3個干涉片段均對AcNPC1基因有下調(diào)作用。siRNA1的干涉效果最好，僅在干涉12 h后使AcNPC1基因表達下調(diào)了66.19%，而在感染CSBV的幼蟲中，3個干涉片段的干涉效果不及在正常幼蟲中的干涉效果(圖5)。越來越多的研究數(shù)據(jù)表明，病毒可通過編碼 RNA 或蛋白質(zhì)抑制劑來干擾 RNAi。例如HIV-1的Tat蛋白通過阻止Dicer將前體dsRNA加工成siRNA而消除細胞的RNAi防御功能(Bennasseretal., 2005)，埃博拉病毒的VP35也被證實具有與HIV的Tat類似抑制RNAi的作用(Haasnootetal., 2007)。CSBV病毒為正義單鏈RNA病毒，因此，我們推測CSBV對宿主蜜蜂幼蟲可能具有抗RNAi的作用，從而導(dǎo)致感染CSBV的幼蟲中RNAi效果不理想。在RNAi干擾實驗中，值得注意的是，CSBV病毒的VP1基因顯著下調(diào)時AcNPC1并沒有被顯著沉默(圖5, 6)，可能是因為NPC1下調(diào)后并不直接影響CSBV的感染而是影響了宿主的其他代謝活動進而影響了CSBV病毒的增殖。此外，圖5顯示CSBV病毒感染72 h時AcNPC1基因才出現(xiàn)顯著上調(diào)，也進一步表明AcNPC1基因可能不是CSBV入侵直接相關(guān)的關(guān)鍵基因。

綜上，本研究首次對中華蜜蜂AcNPC1進行了原核表達，獲得了高純度的重組蛋白，制備了特異性強的鼠多抗，為后期AcNPC1蛋白的精細定位奠定基礎(chǔ)。同時，本研究利用合成的siRNA對中華蜜蜂幼蟲中AcNPC1的表達進行干擾，使AcNPC1基因下調(diào)了50%以上，表明在蜜蜂中通過飼喂的方式進行RNAi是可行的。此外，AcNPC1與CSBV病毒感染之間的相互關(guān)系有待進一步分析驗證。