家蠶非滯育紅卵突變體Re-nd的遺傳分析

張宇靖, 張海燕, 沈關(guān)望, 吳金鑫, 賈林幫,毛雪芹, 焦夢(mèng)瑤, 林 英,4,5,*

(1. 西南大學(xué), 家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400716; 2. 西南大學(xué)生物學(xué)研究中心, 重慶 400716;3. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 成都 610066; 4. 重慶市蠶桑學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400716;5. 重慶市蠶絲纖維新材料工程技術(shù)研究中心, 重慶400716)

家蠶Bombyxmori是作為遺傳背景研究較為深入的鱗翅目模式昆蟲，具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和基礎(chǔ)科學(xué)研究價(jià)值，其形態(tài)性狀一直備受關(guān)注。家蠶卵色是家蠶形態(tài)學(xué)的重要組成部分，在家蠶遺傳學(xué)研究中占有重要地位，主要由卵殼色和漿液膜色組成。野生型家蠶卵的顏色在產(chǎn)卵初期呈現(xiàn)淡黃色，主要是由卵黃和黃色色素3-羥基-犬尿氨酸(3-hydroxy-kynurenine)透過卵殼所呈現(xiàn)出的顏色，不同品種、來源以及滯育性的卵顏色深淺稍有不同。隨著卵的發(fā)育，3-羥基-犬尿氨酸經(jīng)過酶促反應(yīng)生成眼色素(ommochromes)，在漿液膜上形成褐色色素，隨著漿液膜內(nèi)的色素顆粒不斷沉積，漿液膜色也逐漸由淡褐色加深為深褐色，最終與卵殼一起形成卵的固有色(向仲懷, 2005)。

家蠶卵色的形成主要和家蠶體內(nèi)色氨酸等氨基酸代謝及眼色素的形成有關(guān)，而積累在家蠶卵漿液膜內(nèi)色素顆粒上的各種眼色素就來源于氨基酸代謝的產(chǎn)物，包括奧敏類(ommins)和奧馬丁類(ommatins)以及它們的前體物質(zhì)(Koga and Osanai, 1967; Linzenetal., 1974; Sawadaetal., 2000; Bannoetal., 2010)。經(jīng)典的奧馬丁類包括眼黃素(xanthommatin)、奧馬丁D(dihydro-xanthommatin sulfate, ommatin D)以及視紅質(zhì)(dihydro-xanthommatin-O-β-d-glucoside, rhodommatin)(Linzen, 1974)。因此，研究眼色素的生物合成代謝對(duì)研究家蠶卵的著色機(jī)制具有重要作用。

家蠶突變品系中存在多種卵色突變品系(向仲懷, 2005)，為研究家蠶卵色遺傳學(xué)提供了很好的材料。目前，已通過定位克隆、RNA雙鏈干涉、轉(zhuǎn)基因修復(fù)等方法確定了卵色相關(guān)的突變體有w-1,w-2,w-3,w-3(oe),pe,re等(Quanetal., 2002a, 2002b, 2007; Komotoetal., 2009; Tatematsuetal., 2011; Osanai-Futahashietal., 2012, 2016)，這些已確定突變基因的家蠶卵色突變體均與眼色素合成通路相關(guān)。家蠶白卵突變體w-1的突變基因與果蠅的cinnabar基因同源，由于缺乏犬尿氨酸-3-單加氧酶(kynurenine 3-monooxygenase, KMO)導(dǎo)致3-羥基-犬尿氨酸的合成受阻，不能形成眼色素從而導(dǎo)致卵的顏色偏白(Quanetal., 2002a, 2007)。白色卵突變體w-2和w-3是由于white基因的突變引起ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(ATP-binding cassette transporter)功能缺失，使眼色素前體3-羥基-犬尿氨酸不能轉(zhuǎn)運(yùn)到色素顆粒進(jìn)一步形成眼色素，導(dǎo)致w-2和w-3突變體的蠶卵因缺乏眼色素而呈現(xiàn)淡黃色(Quanetal., 2002b; Komotoetal., 2009; Tatematsuetal., 2011)。家蠶桃紅眼白卵突變體pe是由于cardinal基因的突變而引起cardinal編碼的吩噁嗪酮合成酶(phenoxazinone synthetase, PHS)的功能缺失，吩噁嗪酮合成酶是眼色素中奧敏類色素合成所必需的酶，同時(shí)也是催化3-羥基-犬尿氨酸形成眼黃素的合成酶，其功能缺失導(dǎo)致pe突變體的蠶卵缺乏奧敏類色素，而3-羥基-犬尿氨酸能發(fā)生自身氧化形成少量的眼黃素而呈現(xiàn)淡黃偏微紅色(Osanai-Futahashietal., 2016)。紅卵突變體re是Bm-re基因的突變導(dǎo)致所編碼的MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白(major facilitator superfamily transporter)的功能缺失引起。在眼色素生物合成通路中，MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白可介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)其下游奧敏類色素合成所必需的底物半胱氨酸或甲硫氨酸等含硫氨基酸進(jìn)入色素顆粒，如果MFS轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白功能缺失將導(dǎo)致re突變體的卵缺乏奧敏類色素，僅含有奧馬丁類色素，最終呈現(xiàn)出紅色(Toyamaetal., 1913; Tirellietal., 1946; Kawase and Aruga, 1954; Sanai-Futahashietal., 2012)。目前關(guān)于眼色素生物合成后期3-羥基-犬尿氨酸進(jìn)一步代謝合成奧馬丁類的過程尚不完全清楚。

家蠶非滯育紅卵突變體Re-nd是由本實(shí)驗(yàn)室林英等(2007)利用化學(xué)誘變劑N-甲基-N-亞硝基脲(N-methyl-N-nitrosourea, MNU)處理家蠶品種C108而誘導(dǎo)突變產(chǎn)生的新型非滯育家蠶卵色突變體，屬于漿液膜色突變。該突變體在滯育的情況下與正常卵色一樣是褐色，只有在非滯育的情況下才呈現(xiàn)出艷麗的紅色。在家蠶中發(fā)現(xiàn)的滯育情況下呈現(xiàn)紅卵表型的突變體也有很多(向仲懷, 2005； 范曉東等, 2006)，但在非滯育的情況下具有艷麗的紅色表型的突變體，目前就只報(bào)道了非滯育紅卵突變體Re-nd。因此，對(duì)Re-nd突變體的研究，將有助于闡釋和完善家蠶眼色素代謝通路，也為將來應(yīng)用色素相關(guān)基因創(chuàng)制新品種提供分子標(biāo)記和突變體表型生物標(biāo)記。為此，鑒于家蠶非滯育紅卵突變體Re-nd的遺傳特性尚不明確，本研究將通過雜交及遺傳分析，探明Re-nd突變體的遺傳特征，為后續(xù)的基因克隆和功能應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

供試家蠶分別為野生型滯育二化型家蠶品種大造(Dazao)和非滯育多化型品種N4，家蠶突變體品系滯育白卵突變體w-2、桃紅眼白卵突變體pe和紅卵突變體re以及非滯育紅卵突變體Re-nd(林英等, 2007)，均由西南大學(xué)家蠶基因組生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。供試家蠶材料孵化幼蟲的催青條件為： 溫度25℃、光周期12L∶12D，催青周期為10 d左右。所有家蠶供試材料均在25℃、自然光的條件下以新鮮桑葉飼養(yǎng)。

1.2 試蟲純度檢測(cè)

大造、N4、Re-nd、w-2、pe和re共6種供試家蠶材料均已是不發(fā)生遺傳表型性狀分離的純系。以單蛾區(qū)飼養(yǎng)的方式進(jìn)行飼養(yǎng)，即對(duì)同一蛾圈蠶卵孵化的幼蟲(同胞后代)進(jìn)行飼養(yǎng)，至成蟲期(羽化出蛾時(shí)期)進(jìn)行交配制種(同胞交配)，每一交配后代產(chǎn)生的蠶卵集中附著于產(chǎn)卵紙上，形成一個(gè)單一蛾圈中的蠶卵。在產(chǎn)卵第5天調(diào)查同一蛾圈內(nèi)的蠶卵卵色的分離情況，在此時(shí)期蠶卵的卵色表現(xiàn)為野生型蠶卵卵色或突變體蠶卵卵色的穩(wěn)定表型(即固有色表型)；進(jìn)入滯育的蠶卵胚胎停止發(fā)育，而非滯育的蠶卵胚胎繼續(xù)發(fā)育至產(chǎn)卵后大約10 d孵化出幼蟲，由此對(duì)6種供試家蠶材料的遺傳表型進(jìn)行純度鑒定。

1.3 雜交實(shí)驗(yàn)

選取各供試品種/突變體的純系(未發(fā)生卵色分離、品系純度合格)的單一蛾圈的蠶卵進(jìn)行催青，孵化幼蟲，單蛾區(qū)飼養(yǎng)，分別以Re-nd為母本和父本與其他卵色品系的親本進(jìn)行雜交，調(diào)查正交和反交所產(chǎn)生的F1代蠶卵的卵色表型。

選取親本雜交產(chǎn)生的F1代進(jìn)行催青，孵化幼蟲，單蛾區(qū)飼養(yǎng)，以同蛾區(qū)內(nèi)的F1代進(jìn)行同胞交配，調(diào)查同胞交配產(chǎn)生的F2代蠶卵的卵色表型。

選取親本雜交產(chǎn)生的F1代進(jìn)行催青，孵化幼蟲，單蛾區(qū)飼養(yǎng)，分別以F1代為母本和父本與Re-nd的親本進(jìn)行回交，并調(diào)查回交所產(chǎn)生的B1代蠶卵的卵色表型。

雜交、同胞交配及回交的每一代制2張蠶種(28個(gè)成對(duì)交配蠶蛾所產(chǎn)生的28個(gè)蛾圈蠶卵/張蠶種)，用于卵色調(diào)查。

2 結(jié)果

2.1 Re-nd突變體與野生型大造和N4的雜交和遺傳分析

非滯育的Re-nd分別與野生型滯育的二化品種大造和非滯育多化品種N4雜交，無論正交還是反交，其F1代的非滯育卵均表現(xiàn)為淡紅色，排除Re-nd突變體是母性遺傳或假母性遺傳的可能(圖1: A, B)。F1代同胞交配產(chǎn)生的F2代的非滯育卵出現(xiàn)卵色分離，有紅色、淡紅色和淡黃色，且每個(gè)蛾圈中的紅色卵(包括淡紅色卵)與淡黃色卵的數(shù)量比基本符合3∶1(圖1: A, B及局部放大示意圖)；以F1代為母本和父本，分別與大造和N4回交，產(chǎn)生的B1代的非滯育卵均表現(xiàn)出卵色分離，有紅色和淡黃色，且每個(gè)蛾圈中的紅色卵與淡黃色卵的數(shù)量比基本符合1∶1(圖1: A, B及局部放大示意圖)。上述雜交后代F2代(即F1代同胞交配后代、回交后代)的性狀分離符合孟德爾遺傳定律，證實(shí)了Re-nd突變體屬于獨(dú)立的顯性遺傳，其非滯育卵純合體為艷麗的紅色，雜合體為淡紅色。

圖1 家蠶突變體Re-nd與野生型品種大造(A)和N4(B)的雜交

2.2 Re-nd突變體與白卵突變體w-2的雜交和遺傳分析

非滯育Re-nd與滯育白卵突變體w-2雜交，無論正交還是反交，其F1代均表現(xiàn)為淡褐色滯育卵色；F1代同胞交配產(chǎn)生的F2代出現(xiàn)卵色分離，滯育卵有正常深褐色、淡褐色、黃色以及淡黃偏微紅色(圖2: A)，而Re-nd的滯育卵純合體為深褐色、雜合體為淡褐色，w-2滯育卵為淡黃色。F2代卵色分離出現(xiàn)淡黃偏微紅色卵，類似于pe突變體的滯育卵色；其F2代非滯育卵有紅色、淡黃偏微紅色、橙黃色以及淡黃色(圖2: A)，而w-2非滯育卵的顏色為淡黃色(Zhangetal., 2017)，Re-nd的非滯育卵純合體為紅色、雜合體為淡紅色，卵色分離出現(xiàn)橙黃色(圖2: A)。推測(cè)Re-nd的突變基因與w-2的突變基因存在基因互作[在分子遺傳學(xué)上理解，此經(jīng)典遺傳學(xué)上的“基因互作”關(guān)系，可能表現(xiàn)為眼色素代謝途徑中上下游代謝底物的基因/酶的上下游關(guān)系(Tatematsuetal., 2011; Osanai-Futahashietal., 2012, 2016)]，二者互作在一定程度上補(bǔ)償了w-2突變體的缺陷，使色素代謝得以往下游底物進(jìn)行，從而呈現(xiàn)更下游的色素代謝底物的顏色。暗示Re-nd的突變基因位于w-2突變基因的下游(范曉東等, 2010; Tatematsuetal., 2011)，即3-羥基-犬尿氨酸進(jìn)入色素顆粒之后的眼色素合成過程(圖2: B)。

圖2 家蠶突變體Re-nd與w-2的雜交及突變基因關(guān)系

2.3 Re-nd突變體與桃紅眼白卵突變體pe的雜交和遺傳分析

非滯育Re-nd與滯育桃紅眼白卵突變體pe雜交，無論正交還是反交，其雜交F1代均表現(xiàn)為淡褐色滯育卵，F(xiàn)1代同胞交配后產(chǎn)的F2代全部是滯育卵，出現(xiàn)卵色分離，有正常深褐色、淡褐色、淡黃偏微紅色以及紅色(圖3)，pe滯育卵的顏色為淡黃偏微紅色，而F2代滯育卵中卵色分離出現(xiàn)紅色，卵色與re突變體的滯育卵色一致(圖3: A及局部放大示意圖)。推測(cè)Re-nd的突變基因與pe的突變基因存在基因互作，Re-nd突變體在一定程度上補(bǔ)償了pe突變體的缺陷，眼色素合成得以往下游代謝底物進(jìn)行，從而呈現(xiàn)更下游的代謝底物的色素顏色。暗示Re-nd的突變基因處于pe突變基因的下游(范曉東等, 2010; Osanai-Futahashietal., 2016)，即參與3-羥基犬尿氨酸進(jìn)一步代謝合成奧馬丁類和奧敏類色素的過程(圖3: B)。

圖3 家蠶突變體Re-nd與pe的雜交(A)及突變基因關(guān)系(B)

2.4 Re-nd突變體與紅卵突變體re的雜交和遺傳分析

非滯育Re-nd突變體與滯育紅卵突變體re進(jìn)行雜交，無論正交還是反交，雜交F1代均為淡褐色滯育卵色，F(xiàn)1代同胞交配后產(chǎn)的F2，以及與re回交產(chǎn)的B1代也全部是滯育卵，出現(xiàn)卵色分離，F(xiàn)2代有正常深褐色、淡褐色以及紅色，B1代有正常深褐色和紅色，而re滯育卵的顏色為紅色，并沒有分離出新的卵色(圖4: A及局部放大示意圖)。推測(cè)Re-nd的突變基因與re的突變基因同時(shí)存在的情況下，對(duì)蠶卵穩(wěn)定著色沒有改變，表明其色素合成途徑出現(xiàn)了類似問題。而Re-nd突變體在滯育的情況下，卵色為正常的褐色，表明奧敏類色素的合成是正常的，暗示Re-nd突變基因與re突變基因參與了不同的色素代謝分支(Osanai-Futahashietal., 2012)，即Re-nd突變基因可能參與了3-羥基犬尿氨酸進(jìn)一步代謝合成奧馬丁類色素的過程(圖4: B)。

3 討論

圖4 家蠶突變體Re-nd與re的雜交(A)及突變基因關(guān)系(B)

眼色素是昆蟲色素的主要成分之一，通常以顆粒的形式存在，主要表現(xiàn)為黃色、紅色、棕色或紫褐色，多與昆蟲的復(fù)眼、卵、表皮和翅的著色相關(guān)。由于眼色素及其前體物質(zhì)具有易于辨認(rèn)的顏色，眼色素合成相關(guān)基因常被用作分子標(biāo)記(Klemenzetal., 1987; Fridell and Searles, 1991)，在家蠶中，白色卵突變體w-1的突變基因Bm-Kmo可用于轉(zhuǎn)基因的篩選標(biāo)記，但由于其突變卵色為淡黃色，與野生型非滯育卵的卵色及未受精卵的卵色相近，不易區(qū)分；且w-1屬于假母性遺傳，作為分子標(biāo)記應(yīng)用受限；桃紅眼白卵突變體pe以及深紅眼紅卵突變體re的突變基因也可以用作分子標(biāo)記，然而這些卵色突變體均為隱性突變，作為分子標(biāo)記不利于雜合子的篩選。非滯育紅卵突變體Re-nd通過十幾代的單蛾圈同胞交配篩選，最后獲得了一個(gè)穩(wěn)定遺傳的突變體純系。在對(duì)突變體與野生型大造和N4的雜交分析中，也觀察到滯育卵產(chǎn)生，卵色都表現(xiàn)為褐色和淡褐色卵。

本研究關(guān)注的Re-nd是在非滯育的情況下表現(xiàn)出紅卵，前期研究中對(duì)其進(jìn)行初步的雜交遺傳分析，推測(cè)Re-nd可能是隱性非致死性遺傳(林英等, 2007)。在本研究中，通過Re-nd與野生型滯育的二化品種大造和非滯育多化品種N4雜交，F(xiàn)1代再分別以雌雄正反回交(半同胞交配)大造、N4親本和進(jìn)行F1代自交(同胞交配)，統(tǒng)計(jì)這些雜交后代非滯育表型下單個(gè)蛾圈中蠶卵的卵色分離(圖1)，已可明確證實(shí)Re-nd屬于獨(dú)立的顯性遺傳，矯正了作者等之前鑒定的隱性遺傳的看法(林英等, 2007)。通過表型觀察，該突變體相對(duì)于其他卵色突變基因的篩選標(biāo)記，其顏色鮮明且在非滯育情況下以顯性呈現(xiàn)，這易于篩選轉(zhuǎn)基因雜合子，作為分子標(biāo)記在應(yīng)用方面有潛力。

同時(shí)，本研究通過將Re-nd與其他已知突變基因的卵色突變品系進(jìn)行雜交，根據(jù)F2代的卵色分離情況，以推測(cè)Re-nd突變基因可能位于卵色代謝途徑的位置。由于已知卵色突變體在滯育的情況下，w-2卵呈現(xiàn)淡黃色、pe卵呈現(xiàn)淡黃偏微紅色、re卵呈現(xiàn)紅色；但在非滯育的情況下，這幾個(gè)突變品系的卵都呈現(xiàn)淡黃色(Zhangetal., 2017)。而Re-nd突變體在滯育情況下呈現(xiàn)褐色，在非滯育情況下呈現(xiàn)艷麗的紅色 (林英等, 2007)。通過對(duì)Re-nd突變體雜交遺傳分析(圖2～4)，暗示了Re-nd突變基因應(yīng)位于w-2及pe突變基因的下游，并且有別于re突變基因，可能參與了眼色素生物合成后期3-羥基-犬尿氨酸進(jìn)一步代謝合成奧馬丁類(ommatins)色素的過程。目前對(duì)家蠶卵色的眼色素生物合成這一后期代謝途徑的研究尚不明確，且已知代謝途徑的研究均是在卵發(fā)生滯育的狀態(tài)下進(jìn)行的，對(duì)非滯育狀態(tài)下的研究更不清楚。所以家蠶非滯育紅卵Re-nd突變體的意義就在于它屬于顯性突變體，并且是在非滯育情況下呈現(xiàn)艷麗紅色卵的表型突變。因此，本研究結(jié)果為進(jìn)一步通過定位克隆解析Re-nd突變體的突變基因提供了重要依據(jù)。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)深入研究Re-nd突變基因的功能，將有助于闡釋和完善家蠶色素代謝通路，探明非滯育情況下家蠶卵的著色機(jī)理。