蒙藥地梢瓜修復(fù)LPS誘導(dǎo)的NCM460細(xì)胞損傷的有效部位篩選

喜杰，寶開花

（內(nèi)蒙古民族大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼）

0 引言

蒙藥地梢瓜是蒙醫(yī)臨床從古至今一直使用的止瀉藥，是內(nèi)蒙古地區(qū)生長(zhǎng)的道地蒙藥材之一。地梢瓜在蒙醫(yī)臨床常用作“清協(xié)日”，藥性涼，具有清協(xié)日，止瀉功效，常用于協(xié)日性腹瀉，腑熱，腸刺熱等癥[1]。有關(guān)地梢瓜化學(xué)成分研究，王玎等[2]對(duì)地梢瓜果實(shí)進(jìn)行分離純化，得到6個(gè)三萜類化合物，分別鑒定為b-香樹脂醇乙酸酯、羽扇豆醇乙酸酯、a-香樹脂醇正辛烷酸酯、a-香樹脂醇、b-香樹脂醇、齊墩果酸等。李熠等[3]對(duì)地梢瓜葉中總黃酮進(jìn)行了提取及含量測(cè)定，結(jié)果顯示總黃酮含量為2.116mg/g。然而，關(guān)于地梢瓜藥理作用及其藥效等研究尚未見有報(bào)道。

研究發(fā)現(xiàn)[4]，炎癥模型小鼠受到白介素-8（interleukin-8，IL-8）和腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor-α，TNF-α）刺激，會(huì)造成其腸粘膜上皮細(xì)胞凋亡、脫落，同時(shí)伴隨粘膜屏障的損壞導(dǎo)致向腔外釋放細(xì)菌及毒力因子和各種趨化因子，從而激活免疫細(xì)胞導(dǎo)致炎癥發(fā)生。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）也稱作內(nèi)毒素[5]，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁外的一種強(qiáng)促炎分子，由保守的脂質(zhì)A與多聚糖組成。LPS能夠引起多種細(xì)胞的凋亡。腸粘膜屏障是維持腸體內(nèi)平衡的重要結(jié)構(gòu)，已經(jīng)證實(shí)由IL-8和TNF-α引起的腸細(xì)胞過度凋亡以及緊密連接蛋白功能異常能夠?qū)е聡?yán)重的腸功能素亂[6]。本研選用人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460，通過LPS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，地梢瓜不同提取物作用于誘導(dǎo)的細(xì)胞模型上，觀察地梢瓜不同提取部位對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，以及對(duì)炎性因子IL-8和TNF-α的調(diào)控作用，期為該藥物對(duì)結(jié)腸粘膜屏障損傷機(jī)理研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為該藥的進(jìn)一步研究提供新思路，新方法。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

NCM460細(xì)胞（商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司）；1640細(xì)胞培養(yǎng)液（商城北納創(chuàng)聯(lián)生物科技有限公司）；PB磷酸鹽緩液（Phosphate Buffered Saline，PBS）（海標(biāo)科技生物有限公司）；胰蛋白酶（北京百奧萊博科技有限公司）；MTT試劑盒、IL-8試劑盒、TNF-α試劑盒（上海原葉生物技術(shù)有限公司）；二甲基亞砜（南京化學(xué)試劑有限公司）；地梢瓜（自采于內(nèi)蒙古通遼市科左中旗）；乙醇[阿拉丁試劑（上海）有限公司]，正丁醇[阿拉丁試劑（上海）有限公司]，石油醚[阿拉丁試劑（上海）有限公司]，乙酸乙酯[阿拉丁試劑（上海）有限公司]。

1.2 儀器設(shè)備

5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（三洋）；無(wú)菌操作臺(tái)（蘇州智凈凈化）；HH－S266數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海赫田科學(xué)儀器有限公司）；培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶（25cm2）；倒置光學(xué)顯微鏡（Nikon，TS100）；離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器，TDL－5－A）；酶標(biāo)儀（奧地利-瑞士帝肯公司，DNM－9602）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液的制備

取地梢瓜果實(shí)5kg，干燥粉碎后以體積分?jǐn)?shù)75%乙醇回流提取3次（每次2倍量，提取2h），合并提取液，回收溶劑，干燥得浸膏994g。將浸膏混懸于水中（2倍量），分別以等體積的石油醚（bp30℃－60℃）、乙酸乙酯、正丁醇萃取各3次，回收溶劑得石油醚浸膏505g、乙酸乙酯浸膏408g、正丁醇浸膏81g。地梢瓜乙醇提取物取1.2107g加入50ml錐形瓶中，以分子量為500得出加入24ml二甲基亞砜溶解，濃度為0.0504g/ml。地梢瓜石油醚提取物取1.4362g加入50ml錐形瓶中，以分子量為500得出加入28ml二甲基亞砜溶解，濃度為0.0522g/ml。地梢瓜乙酸乙酯提取物取0.5341g加入50ml錐形瓶中，以分子量為500得出加入18ml二甲基亞砜溶解，濃度為0.0501g/ml。正丁醇提取物取0.9020g加入50ml錐形瓶中，以分子量為500得出加入10ml二甲基亞砜溶解，濃度為0.0534g/ml。二甲基亞砜溶解物各取1ml過濾于15ml離心管中，再加入9ml培養(yǎng)液，最終濃度為5μg/ml備用。

2.2 細(xì)胞復(fù)蘇與造模

在超凈臺(tái)中無(wú)菌操作，將凍存管內(nèi)的細(xì)胞移入15ml離心管中離心，1000rpm/5min。棄去上清，加5ml培養(yǎng)基，吹吸混勻，用移液槍吸到培養(yǎng)瓶中，放入37℃、飽和濕度5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液。細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，將細(xì)胞傳到96孔板，正常組加入培養(yǎng)液，其余組加入相同20μg/ml濃度的LPS[7]。

2.3 加藥與分組

模型成功后，將96孔板中的液體棄去，分為正常組、模型組、地梢瓜石油醚提取物組、地梢瓜乙醇物組、地梢瓜正丁醇物組、地梢瓜乙酸乙酯物組，每組設(shè)12個(gè)復(fù)孔，正常組加培養(yǎng)液，模型組加20μg/ml濃度的LPS，地梢瓜石油醚提取物組加5μg/ml的石油醚提取物、地梢瓜乙醇物組加5μg/ml的乙醇提取物、地梢瓜正丁醇物組加5μg/ml的正丁醇提取物、地梢瓜乙酸乙酯物組加5μg/ml的乙酸乙酯提取物，繼續(xù)培養(yǎng)24h。

2.4 檢測(cè)指標(biāo)

鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力，ELISA方法檢測(cè)IL-8和TNF-α的含量。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 MTT檢測(cè)結(jié)果

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，模型組與正常組比較OD值顯著低（P＜0.05）；培養(yǎng)24h時(shí)乙酸乙酯組和正丁醇組與模型組，比較OD值顯著高（P＜0.05）。培養(yǎng)48h時(shí)4組加藥組的與模型組比較OD值顯著增高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞MTT法OD值（±s，n=12）

表1 各組細(xì)胞MTT法OD值（±s，n=12）

注：與正常組比較*P＜0.05，與模型組比較＃P＜0.05

組別 24h 48h正常組 0.43±0.01 0.63±0.01模型組 0.20±0.01* 0.19±0.01*地梢瓜乙酸乙酯組 0.33±0.03＃ 0.54±0.04＃地梢瓜石油醚組 0.21±0.05 0.43±0.13＃地梢瓜正丁醇組 0.37±0.04＃ 0.59±0.03＃地梢瓜乙醇組 0.25±0.02 0.43±0.02＃

3.2 ElISA法檢測(cè)結(jié)果

ELISA法檢測(cè)結(jié)果顯示，TNF-α OD值模型組與正常組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；培養(yǎng)24h時(shí)乙酸乙酯組和正丁醇組與模型組比較OD值顯著降低。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-8 OD值模型組與正常組比較顯著增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；培養(yǎng)24h時(shí)乙酸乙酯組和正丁醇組與模型組比較OD值顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

4 討論

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（NCM460）是體外研究中常用的研究腸粘膜上皮的細(xì)胞模型，腸上皮細(xì)胞在腸腔內(nèi)的分布位置以及其生理功能決定了其在粘膜屏障中具有關(guān)鍵作用。

蒙藥地梢瓜是蒙醫(yī)臨床從古至今一直使用的止瀉藥，前期研究已發(fā)現(xiàn)對(duì)腸粘膜有保護(hù)作用[8]。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，地梢瓜乙酸乙酯和正丁醇萃取部位對(duì)LPS誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞損傷有一定修復(fù)作用。LPS誘導(dǎo)NCM460細(xì)胞后，IL-8、TNF-α炎性因子的表達(dá)明顯升高，加地梢瓜提取物后對(duì)炎性因子有明顯的抑制作用。這說明地梢瓜對(duì)NCM460細(xì)胞損傷有修復(fù)作用，給臨床上應(yīng)用地梢瓜藥物對(duì)結(jié)腸上皮細(xì)胞修復(fù)提供了理論依據(jù)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。