重組人腺病毒P53和碘125粒子調(diào)節(jié)Bax和Bcl2對裸鼠膽管癌移植瘤增殖和凋亡的影響

和慶章 王桂良 邱 萍 徐林芳 龔敏 付云輝 韓明 文劍波

[關(guān)鍵詞] 膽管癌;rHAd-P53;碘125;Bcl2;Bax

[中圖分類號] R735.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）29-0044-05

Impacts of recombinant human adenovirus P53 and iodine-125 particles regulating Bax and Bcl2 on proliferation and apoptosis of transplanted tumor of cholangiocarcinoma in nude mice

HE Qingzhang? ?WANG Guiliang? ?QIU Ping? ?XU Linfang? ?GONG Min? ?FU Yunhui? ?HAN Ming? ?WEN Jianbo

Department of Gastroenterology， Pingxiang Hospital Affiliated to Gannan Medical University， Pingxiang? ?337000， China

[Abstract] Objective To explore the impacts of recombinant human adenovirus P53（rHAd-P53） and iodine-125 particles regulating Bax and Bcl2 on proliferation and apoptosis of transplanted tumor of cholangiocarcinoma in nude mice. Methods Human cholangiocarcinoma cells were selected to establish human cholangiocarcinoma xenograft model in nude mice. A total of 48 nude mice were divided into the blank control group， the rHAd-P53 group， the iodine-125 particles group and the rHAd-P53 combined with iodine-125 particles group. The transplanted tumor size and weight were measured before and after treatment，the proliferation-related protein （Ki-67） was detected by immunohistochemistry， the apoptosis index was detected by TUNEL method， the expression of Bcl2 and Bax mRNA was detected by Realtime-PCR method， and the expression of Bcl2 and Bax protein was detected by Western blot method. Results After treatment， compared with the blank control group， the volume difference， tumor weight， proliferation index， Bcl2 and Bcl2/Bax mRNA， Bcl2 protein of transplanted tumor in the rHAd-P53 group， the iodine-125 particles group and the rHAd-P53 combined with iodine-125 particles group were significantly decreased， while Bax mRNA and protein were significantly increased.Compared with the rHAd-P53 group， the volume difference， tumor weight， proliferation index，significance of Bcl-2 and Bcl-2/Bax mRNA， Bcl-2 protein of transplanted tumor in the iodine-125 particles group or rHAd-P53 combined with iodine-125 particles group were all significantly decreased， while the tumor inhibition rate， Bax mRNA and protein were all significantly increased.Compared with the iodine-125 particles group， the volume difference， tumor weight， proliferation index， Bcl-2 and Bcl-2/Bax mRNA and Bcl-2 protein of transplanted tumor in rHAd-P53 combined with iodine-125 particles group were all significantly decreased， while the tumor inhibition rate， Bax mRNA and protein were all significantly increased. Conclusion RHAd-P53 and iodine-125 particles can inhibit the proliferation and promote the apoptosis of transplanted cholangiocarcinoma in nude mice by inhibiting the expression of Bcl2 and promoting the expression of Bax. rHAd-P53 can enhance the sensitivity of iodine-125 particles radiotherapy， and the effect of combining them is better than that of using them singly.

[Key words] Cholangiocarcinoma; rHAd-P53; iodine-125; Bcl2; Bax

膽管癌是一種起源于膽管上皮細(xì)胞的惡性腫瘤，其位置特殊、發(fā)病隱匿、惡性程度高、手術(shù)切除機(jī)會小、體外放療和化療效果均不理想[1]，碘125粒子局部放療具有創(chuàng)傷低、靶向效果好、并發(fā)癥少、對正常組織損害小等優(yōu)點，因而越來越受到國內(nèi)外學(xué)者的重視[2]。P53基因是最有效的抑癌基因，能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡。rHAd-P53能增強(qiáng)腫瘤對碘125粒子放療的敏感性[3]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于臨床，國內(nèi)外尚沒有將二者聯(lián)用的研究報道，本研究應(yīng)用rHAd-P53和碘125粒子單獨治療及聯(lián)合治療人裸鼠膽管癌移植瘤模型，以觀察rHAd-P53對碘125粒子治療膽管癌敏感性的影響，為基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用提供新的思路，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

BALB/c-nu裸鼠（5～6周齡，體重18～22 g，SPF環(huán)境下飼養(yǎng)），購自江西中醫(yī)學(xué)院動物部[動物許可證號：SYXK（贛）2008-0006）];人膽管癌細(xì)胞株QBC939細(xì)胞株購自美國ATCC公司;重組人rHAd-P53（1×1012VP/支，國藥準(zhǔn)字S20040004）購自深圳賽百諾公司;Bax、Bcl2、GAPDH一抗購自美國Abcam公司;碘125粒子（粒子活度為0.6 mCi）購自北京智博高科生物技術(shù)有限公司;cDNA合成試劑盒購自美國Thermo公司;TUNEL試劑盒購自瑞士Roche公司;Trizol試劑自美國Invitrogen公司;PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq聚合酶購自日本TaKaRa公司。Real time PCR擴(kuò)增基因引物序列見表1，由上海生工生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 裸鼠膽管癌模型制備及分組? 將QBC939細(xì)胞株（1×106個）接種于裸鼠右腋窩皮下。接種后觀察腫瘤生長情況，腫瘤直徑約0.5 cm時即用于實驗。根據(jù)治療方案將裸鼠隨機(jī)分為四組：空白對照組;rHAd-P53組;碘125粒子組;rHAd-P53+碘125粒子組，每組各12只。

1.2.2 空白對照? 給裸鼠每日一次瘤內(nèi)注射生理鹽水0.1 mL，共6次。

1.2.3 rHAd-P53治療? 給裸鼠每日一次瘤內(nèi)注射rHAd-P53 1×1010 VP，共6次。

1.2.4 碘125粒子治療? 用穿刺針將1顆碘125粒子置入瘤體中央。

1.2.5 腫瘤體積計算? 治療前及每次治療時測量腫瘤體積（=0.5×長徑×短徑2），抑瘤率（IR）=（空白對照組平均瘤重-治療組平均瘤重）/空白對照組平均瘤重×100%。

1.2.6 細(xì)胞增殖和凋亡情況觀察? 將裸鼠移植瘤的冰凍組織切片行常規(guī)HE染色，觀察組織顯微形態(tài)，通過免疫熒光檢測腺病毒載體上的綠色熒光蛋白（EGFP）標(biāo)簽，顯示rHAd-P53在組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平。采用免疫組化法檢測Ki-67蛋白的表達(dá)，反映腫瘤細(xì)胞增殖情況，每張切片隨機(jī)選取5個高倍視野（400×），分別計數(shù)陽性細(xì)胞數(shù)及腫瘤細(xì)胞總數(shù)。增殖指數(shù)（PI）%=陽性細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)×100%;TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡，凋亡指數(shù)（AI）%=[凋亡細(xì)胞數(shù)/腫瘤細(xì)胞總數(shù)]×100%[3]。

1.2.7 Real-time PCP檢測Bcl2和Bax mRNA的表達(dá)? 以β-actin作為內(nèi)參照，配制20 μL的反應(yīng)體系：上游引物0.5 μL，下游引物0.5 μL，SYBR Enzyme 10 μL，cDNA 1 μL，無酶水8 μL。反應(yīng)條件為： 95℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性30 s，60 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。計算Bcl2和Bax mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.8 Western blotting檢測Bcl2和Bax蛋白的表達(dá)? 提取組織總蛋白，以10% SDS-聚丙烯酰胺膠電泳，后轉(zhuǎn)至PVDF膜上，以5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗，4℃孵育過夜;TBST洗膜3次，每次10 min，加入熒光二抗，室溫避光孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min;加入顯色液后，ECL顯色，利用Image J軟件分析各條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)對照GAPDH條帶的比值表示目的蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，正態(tài)分布且方差齊的計量資料多組間比較采用單因素方差分析，偏態(tài)分布或正態(tài)分布但方差不齊的計量資料多組間比較采用非參數(shù)檢驗，組間兩兩比較采用LSD法。計數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四組移植瘤顯微形態(tài)變化

免疫熒光顯示，空白對照組沒有EGFP表達(dá)，rHAd-P53組有EGFP表達(dá)，且表達(dá)較高，說明rHAd-P53轉(zhuǎn)染效率較高。HE染色顯示，空白對照組瘤細(xì)胞排列密集，大小不等，細(xì)胞核較大，可見病理性核分裂象，血管較為密集，血供豐富;rHAd-P53組和碘125粒子組可見壞死腫瘤細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞間隙較大，部分癌細(xì)胞呈活躍狀，細(xì)胞間隙略大;rHAd-P53組+碘125粒子組可見大片壞死的腫瘤細(xì)胞及核固縮、核碎裂的細(xì)胞，細(xì)胞間隙較大。見封三圖4。

2.2 裸鼠移植瘤治療后生長狀況比較

給予重組rHAd-P53注射后，利用綠色免疫熒光檢測顯示，P53在移植瘤組織高表達(dá)。與空白對照組比較，rHAd-P53組、碘125粒子組、rHAd-P53+碘125粒子組瘤重顯著性降低。與rHAd-P53組比較，碘125粒子組和rHAd-P53+碘125粒子組瘤重顯著性降低，抑瘤率顯著性增加。與碘125粒子組比較，rHAd-P53+碘125粒子組瘤重顯著性降低，抑瘤率顯著性增加。見表2。

2.3 四組裸鼠治療后增殖與凋亡情況比較

與空白對照組比較，rHAd-P53組、碘125粒子組、rHAd-P53+碘125粒子組增殖指數(shù)顯著性降低，凋亡增殖指數(shù)顯著性增加。與rHAd-P53組比較，碘125粒子組和rHAd-P53+碘125粒子組增殖指數(shù)顯著性降低，凋亡增殖指數(shù)顯著性增加。與碘125粒子組比較，rHAd-P53+碘125粒子組增殖指數(shù)顯著性降低，凋亡增殖指數(shù)顯著性增加。見表3。

2.4 四組裸鼠治療后Bcl2和Bax mRNA表達(dá)量比較

與空白對照組比較，rHAd-P53組、碘125粒子組和rHAd-P53+碘125粒子組Bcl2 mRNA和Bcl2/Bax mRNA顯著性降低，Bax mRNA顯著性增加。與rHAd-P53組比較，碘125粒子組和rHAd-P53+碘125粒子組Bcl2 mRNA和Bcl2/Bax mRNA顯著性降低，Bax mRNA顯著性增加。與碘125粒子組比較，rHAd-P53+碘125粒子組Bcl2 mRNA和Bcl2/Bax mRNA顯著性降低，Bax mRNA顯著性增加。見表4。

2.5 四組治療后Bcl2和Bax蛋白表達(dá)量比較

與空白對照組比較，rHAd-P53組、碘125粒子組和rHAd-P53+碘125粒子組Bcl2蛋白顯著性降低，Bax蛋白顯著性增加。與rHAd-P53組比較，碘125粒子組和rHAd-P53+碘125粒子組Bcl2蛋白顯著性降低，Bax蛋白顯著性增加。與碘125粒子組比較，rHAd-P53+碘125粒子組Bcl2蛋白顯著性降低，Bax蛋白顯著性增加。見圖1。

3 討論

膽管癌由膽道上皮細(xì)胞的惡變而來，發(fā)病機(jī)制與炎癥和膽汁淤積導(dǎo)致膽管細(xì)胞DNA損傷﹑堿基錯配﹑原癌基因的激活及抑癌基因的失活、細(xì)胞因子和生長因子表達(dá)異常、異常細(xì)胞增殖相關(guān)[4-5]。從細(xì)胞凋亡角度研究腫瘤的發(fā)生和治療是目前研究的熱點。P53是一種抑癌基因，不但自身具有抗腫瘤作用，且能提高對腫瘤細(xì)胞的放療敏性[6]。Bcl2和Bax是細(xì)胞凋亡中的兩個關(guān)鍵因子，Bcl2是一種重要的抗凋亡基因，能促進(jìn)細(xì)胞存活、抑制細(xì)胞凋亡[7]，Bax是一種重要的促凋亡基因，可形成同源二聚體或與Bcl2形成異源二聚體，阻遏Bcl2發(fā)揮作用[8]。Bax/Bcl2兩蛋白之間的比例關(guān)系決定對細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱，Bcl2/Bax比值上調(diào)，抑制細(xì)胞凋亡，Bcl2/Bax比值下調(diào)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[9]。靶向抑制Bcl2和（或）促進(jìn)Bax的表達(dá)有助于殺滅腫瘤細(xì)胞。

由于膽管癌發(fā)病位置隱匿、早期癥狀不明顯、影像學(xué)技術(shù)對較小膽管癌的診斷率低，患者就診時多為中晚期，手術(shù)治愈率低，因為化療和體外放療的副作用大，在臨床受到一定程度的限制[10]。rHAd-P53能將P53基因?qū)肽[瘤細(xì)胞，表達(dá)P53蛋白，從而發(fā)揮抑制細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，刺激機(jī)體的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)，上調(diào)多種抗癌基因和下調(diào)多種癌基因的活性，并有抑制血管內(nèi)皮生長因子基因和藥物多抗性基因表達(dá)的作用，正被作為新的治療方案得到推廣。國內(nèi)外部分學(xué)者研究了碘125對某些腫瘤的療效，Li等[11]應(yīng)用rHAd-P53轉(zhuǎn)染胰腺癌SW1990細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，rHAd-P53胰腺癌細(xì)胞對輻射敏感性增加。Xu等[12]發(fā)現(xiàn)rHAd-P53聯(lián)合放療治療頭頸部淋巴瘤，T細(xì)胞亞群（CD3/CD4/CD8）增加，白細(xì)胞介素2受體水平降低，療效提高。碘125粒子的作用機(jī)制為近距離持續(xù)向腫瘤組織釋放γ射線破壞腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜、破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)，從而殺滅或抑制腫瘤細(xì)胞生長[13]。2015年Wang等[14]應(yīng)用125I粒子照射胰腺癌細(xì)胞株SW1990和PANC-1細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)125I粒子能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡和G2/M細(xì)胞周期停滯而起到殺傷作用，2016年Li等[15]應(yīng)用125I粒子植入治療胰腺癌患者可使腫瘤緩解率增加，2018年Hu等[16]應(yīng)用超聲引導(dǎo)125I粒子植入治療胰腺癌患者，能提高患者緩解率、生存率和中位生存期。但是腫瘤在接受放療的過程中，自身會產(chǎn)生放療抵抗，參與放療抵抗的相關(guān)分子有Survivin、nm23-H1、CyclinD1、HSF1、HSP70、HSP90等，聯(lián)用rHAd-P53可抑制放療抵抗，增強(qiáng)腫瘤組織放療的敏感性[17]。但P53抑制腫瘤細(xì)胞生長及增加放療敏感性的具體機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。

本實驗以膽管癌細(xì)胞株接種到裸鼠皮下建立膽管癌移植瘤模型，觀察rHAd-P53、碘125粒子和rHAd-P53+碘125粒子治療膽管癌的療效，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，rHAd-P53組、碘125粒子組和rHAd-P53+碘125粒子組移植瘤體積差值、瘤重、增殖指數(shù)、Bcl2和Bcl2/Bax mRNA、Bcl2蛋白均顯著性降低，Bax mRNA和蛋白均顯著性升高。與rHAd-P53組比較，碘125粒子組、rHAd-P53+碘125粒子組rHAd-P53組或碘125粒子組或rHAd-P53+碘125粒子組移植瘤體積差值、瘤重、增殖指數(shù)、Bcl2和Bcl2/Bax mRNA、Bcl2蛋白均顯著性降低，抑瘤率、Bax mRNA和蛋白均顯著性升高。與碘125粒子組比較，rHAd-P53+碘125粒子組移植瘤體積差值、瘤重、增殖指數(shù)、Bcl2和Bcl2/Bax mRNA、Bcl2蛋白均顯著性降低，抑瘤率、Bax mRNA和蛋白均顯著性升高。以上結(jié)果說明，rHAd-P53和碘125粒子均能抑制腫瘤生長，碘125粒子的效果優(yōu)于rHAd-P53，rHAd-P53和碘125粒子聯(lián)用后較單用效果增加，說明rHAd-P53能增強(qiáng)碘125粒子放療的敏感性。由于腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡是由一系列相關(guān)基因的作用所致，為了進(jìn)一步探討rHAd-P53和碘125粒子治療膽管癌裸鼠抑植瘤的機(jī)制，本研究選擇了2個典型的凋亡相關(guān)基因（Bcl2和Bax）進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組比較，rHAd-P53和碘125粒子均能促進(jìn)Bax mRNA和蛋白的表達(dá)，抑制Bcl2mRNA和蛋白的表達(dá)，碘125粒子的作用優(yōu)于rHAd-P53，二者聯(lián)用后效果優(yōu)于任何一種單用方案的效果。P53作為一種轉(zhuǎn)錄因子，可能通過與Bax和Bcl2基因的啟動子直接結(jié)合或與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用與啟動子間接結(jié)合從轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)其表達(dá)進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。碘125可調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子、lincRNA或micro RNA的表達(dá)間接調(diào)控Bax和Bcl2基因的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，P53與碘125聯(lián)用后，調(diào)節(jié)Bax和Bcl2基因表達(dá)的作用增強(qiáng)，因此放療敏感性增加。由于膽管癌的發(fā)病機(jī)制、各種治療措施產(chǎn)生的療效機(jī)制非常復(fù)雜，P53和碘125對Bax和Bcl2的具體調(diào)控機(jī)制及其對其他凋亡相關(guān)基因的表達(dá)而影響膽管癌增殖和凋亡的機(jī)制尚需以后的實驗進(jìn)一步研究。

綜上所述，rHAd-P53和碘125粒子能通過抑制促凋亡基因Bcl2的表達(dá)、促進(jìn)促凋亡基因Bax的表達(dá)而抑制裸鼠膽管癌移植瘤增殖、促進(jìn)其凋亡，碘125粒子的效果優(yōu)于rHAd-P53，rHAd-P53與碘125粒子聯(lián)用后，放療的敏感性增加，效果增強(qiáng)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Khan AS，Dageforde LA.Cholangiocarcinoma[J].Surg Clin North Am，2019，99（2）：315-335.

[2] Wang H，Wang J，Jiang Y. The investigation of 125I seed implantation as a salvage modality for unresectable pancreatic carcinoma[J]. J Exp Clin Cancer Res，2013，32（1）：106.

[3] Wachter F，Grunert M，Blaj C. Impact of the P53 status of tumor cells on extrinsic and intrinsic apoptosis signaling[J].Cell Commun Signal，2013，11（1）： 27-32.

[4] 趙明恩，陽丹才讓.膽管癌發(fā)病機(jī)制研究及診療進(jìn)展[J].臨床醫(yī)藥文獻(xiàn)電子雜志，2018，70（5）：197.

[5] Labib PL，Goodchild G，Pereira SP.Molecular pathogenesis of cholangiocarcinoma[J]. BMC Cancer，2019，19（1）：185.

[6] Lee CL，Blum JM，Kirsch DG. Role of P53 in regulating tissue response to radiation by mechanisms independent of apoptosis[J]. Transl Cancer Res，2013，2（5）：412-421.

[7] Jian X，Qu L，Wang Y，et al. Trichostatin A-induced miR-30a-5p regulates apoptosis and proliferation of keloid fibroblasts via targeting BCL2[J].Mol Med Rep，2019，19（6）：5251-5262.

[8] Yuan Y，Wang YY，Liu X，et al. KPC1 alleviates hypoxia/reoxygenation-induced apoptosis in rat cardiomyocyte cells though BAX degradation[J].J Cell Physiol，2019， 234（12）：22 921-22 934.

[9] Karimi Ardestani S，Tafvizi F，Tajabadi Ebrahimi M. Heat-killed probiotic bacteria induce apoptosis of HT-29 human colon adenocarcinoma cell line via the regulation of Bax/Bcl2 and caspases pathway[J].Hum Exp Toxicol，2019，38（9）：1069-1081.

[10] 奚松陽，房棟，霍介格.肝內(nèi)膽管癌的分子靶向治療進(jìn)展[J].世界華人消化雜志，2018，26（29）：1707-1716.

[11] Li J，Pan J，Zhu X，et al. Recombinant adenovirus-P53 （Gendicine） sensitizes a pancreatic carcinoma cell line to radiation[J].Chin J Cancer Res，2013，25（6）：715-721.

[12] Xu YH，Liu SH，Han FR，et al. Recombinant recombinant human adenovirus P53 combined with radiotherapy improves efficacy and safety in the treatment of head and neck lymphoma[J].Cancer Biomark，2018，23（2）：213-220.

[13] Nag S，DeHaan M，Scruggs G，et al. Long-term follow-up of patients of intrahepatic malignancies treated with iodine-125 brachytherapy[J].J Radiat Oncol Biol Phys，2006， 64（3）：736-744.

[14] Wang ZM，Lu J，Zhang LY，et al. Biological effects of low-dose-rate irradiation of pancreatic carcinoma cells in vitro using 125I seeds[J]. World J Gastroenterol，2015， 21（8）：2336-2342.

[15] Li YF，Liu ZQ，Zhang YS，et al. Implantation of radioactive （125）I seeds improves the prognosis of locally advanc-ed pancreatic cancer patients：A retrospective study[J]. J Hua-zhong Univ Sci Technolog Med Sci，2016，36（2）：205-210.

[16] Hu Y，Qi E，Liu F，et al. The application of a three-dimensional visualized seed planning and navigation system in （125）I seed implantation for pancreatic cancer[J]. Onco Targets Ther，2018，11：619-627.

[17] Jiang X，Li L，Li Y，et al.Molecular mechanisms and countermeasures of immunotherapy resistance in malignant tumor[J].J Cancer，2019，10（7）： 1764-1771.

（收稿日期：2020-10-12）