IGF2基因在卵巢癌組織中的表達差異分析

吳巧珠 陳鳳英 孫芳

[關(guān)鍵詞] IGF2基因;卵巢癌組織;卵巢組織;病理分級

[中圖分類號] R392.11? ? ? ? ? [文獻標(biāo)識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）29-0021-03

Analysis on the differential expression of IGF2 gene in ovarian cancer tissues

WU Qiaozhu1? ?CHEN Fengying1? ?SUN Fang2

1.Department of Obstetrics and Gynecology， the Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University （Shenzhen， Futian）， Shenzhen? ?518000， China; 2.Department of Gynecology， Shenzhen Hospital of the University of Hongkong， Shenzhen? 518058， China

[Abstract] Objective To analyze the expression and changes of insulin-like growth factor 2（IGF2） gene in ovarian cancer tissues. Methods A total of 72 patients with ovarian cancer admitted to the Department of Obstetrics and Gynecology of The Eighth Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University（Shenzhen， Futian） from February 2018 to April 2019 were selected as the study subjects. They were divided into the high expression group（n=41） and the low expression group（n=31） according to the level of the IGF2 gene expression. Meanwhile， 72 healthy women were selected as the control group during the same period. The difference between high and low expression of IGF2 in patients′ general data was analyzed， Quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction （qRT-PCR） experiment and staining experiment. Results The qRT-PCR technique was used to detect the messenger ribonucleic acid （mRNA） expression of IGF2 gene. The detection results showed that the IGF2 gene was highly expressed in ovarian cancer tissue cells， and the level of IGF2 gene was much higher in ovarian cancer cells than that in normal ovarian tissues，the difference was statistically significant （P<0.05）. The Western-blot was used to detect the IGF2 protein expression， and the detection results showed that the IGF2 protein was normally expressed in normal ovarian tissues and highly expressed in ovarian cancer tissues， the difference was statistically significant（P<0.05）. Conclusion 1. The expression of IGF2 gene in ovarian cancer tissues is significantly higher than that in normal ovarian tissues and paracancerous tissues， and it is significantly correlated with the pathological grading of patients. 2. The expression of IGF2 gene is closely related to the survival time of patients with ovarian cancer， and it is an important poor prognostic factor.

[Key words] Insulin-like growth factor 2 gene; Ovarian cancer tissues; Ovarian tissues; Pathological grading

卵巢癌（Ovarian cancer，OC）是婦科最常見的惡性腫瘤，同時也是最難診斷、惡性程度高、進展快和預(yù)后差的婦科腫瘤之一，發(fā)病早期隱匿、發(fā)生進展快、病死率高，病死率占婦科惡性腫瘤約50%[1]。目前由于缺乏早期有效檢測手段，大部分患者確診時已經(jīng)為中晚期[2]。因此早診斷、早治療是促使卵巢癌患者快速康復(fù)的關(guān)鍵，長期臨床實踐發(fā)現(xiàn)，胰島素樣生長因子2（IGF2）在卵巢癌女性中呈現(xiàn)高表達，因此加強IGF2因子表達水平的檢測，對早期診斷卵巢癌有較大幫助[3]。IGF2與IGF1R、IGF1、IGF2R等6個結(jié)合蛋白相輔相成，共同分布于細(xì)胞表面，構(gòu)成胰島素素樣生長因子（Insulin-1ike growth factors，IGFs）。IGFs屬于蛋白質(zhì)復(fù)合體，其中各蛋白成分的表達在診斷各類癌癥中具有標(biāo)志性作用[4]，IGF2的作用則是能夠促進細(xì)胞分裂，因此卵巢組織中IGF的過量表達提示可能存在癌細(xì)胞[5-6]。研究[7-9]發(fā)現(xiàn)，IGF2在細(xì)胞增殖、分化和代謝中發(fā)揮著重要作用。鑒于此，本研究以72名正常女性、72例卵巢癌女性為對象進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取2018年2月至2019年4月中山大學(xué)附屬第八醫(yī)院（深圳福田）婦產(chǎn)科收治的72例卵巢癌患者為觀察組，根據(jù)其IGF2基因表達情況分為高表達組、低表達組各41例、31例，選取同期72名健康女性為對照組。對照組年齡22～65歲，平均（38.56±1.25）歲;觀察組年齡23～66歲，平均（38.52±1.21）歲。兩組一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

采用qRT-PCR、Western-blot實驗對IGF2表達情況進行分析，先檢測其mRNA表達水平，具體方法如下。

1.2.1 提取組織標(biāo)本RNA? 將組織標(biāo)本離體后，剪切成2 mm3左右，及時放入液氮罐保存。提取RNA前，研磨缽預(yù)冷，反復(fù)加液氮，確保其充分預(yù)冷。之后，取出樣本，在預(yù)冷的研磨缽放入組織塊，研磨期間適量加入液氮，確保研磨期間液氮不會揮發(fā)干。研磨組織塊重量每次控制在300 mg以內(nèi)。研磨為粉末后，每個研磨缽加Trizol試劑1 mL，加入后轉(zhuǎn)移到新的離心管（1.5 mL）中。在離心管加入0.2 mL氯仿，震蕩30 s，靜置5 min。靜置后放于4℃，以120 000 g離心處理15 min，將離心后液相分為3層，最下層為酚-氯仿相（紅色）、最上層為無色的水相及中間層，其中RNA僅在最上層。將上層水相轉(zhuǎn)移到EP管（1.5 mL，確保潔凈），注入預(yù)冷的異丙醇500 μL，靜置10 min，在4℃下以12 000 g離心15 min，棄去上清液。重復(fù)操作2次，在離心管加75%乙醇1 mL（經(jīng)過預(yù)冷處理），輕輕洗滌混勻，于4℃下以7500 g離心5 min，棄去上清液。室溫下晾干，干燥沉淀RNA，加20 μL的DEPC水溶解，促使RNA重懸，以移液器從RNA溶解液取2 μL加入干凈EP管，同時加98 μL DEPC水，離心混合均勻，將DEPC水作為對照，以紫外分光光度儀檢測OD值。利用電泳試驗鑒定RNA質(zhì)量，提取好的RNA放于-80℃保存。

1.2.2 qRT-PCR檢測? 選擇Promega公司的熒光定量試劑盒實施定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)，所有操作嚴(yán)格按照儀器與試劑說明書執(zhí)行。

1.2.3 組織標(biāo)本蛋白提取與Western-blot檢測 ①組織標(biāo)本蛋白提?。禾崛∏?日洗凈勻漿器，放于75%乙醇浸泡，提取組織蛋白前將其自然晾干，并置于烤箱。提取前配制裂解液，現(xiàn)配現(xiàn)用，配比為RIPA：PMSF=100：1，配制完成完成安放于4℃冰塊上。預(yù)冷研磨缽，反復(fù)往內(nèi)加入液氮，確保充分預(yù)冷。之后取出樣本，剪切為合適的組織塊，將40 mg左右組織塊放入預(yù)冷研磨缽實施研磨，研磨期間適當(dāng)加入液氮，反復(fù)研磨，直到為粉末狀。加預(yù)冷過且配置好的蛋白裂解液200 μL至冰上進行孵育，時間20 min。之后，將其轉(zhuǎn)移到新的離心管，4℃下以10 000 g離心，時間15 min，上清液則轉(zhuǎn)移到新的離心管處理。②Western-blot檢測：將蛋白標(biāo)準(zhǔn)配制液1.2 mL轉(zhuǎn)移至新的管蛋白標(biāo)準(zhǔn)中，混合均勻且充分溶解，促使其達到25 mg/mL的蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。于配制好的蛋白標(biāo)準(zhǔn)中提取40 μL，稀釋為0.5 mg/mL，加稀釋液1960 μL。根據(jù)樣品情況，10 mL BCA試劑A+200 μL BCA試劑B，按照50：1配比配制為BCA工作液，充分混合。將標(biāo)準(zhǔn)品加入96孔板標(biāo)準(zhǔn)孔，加標(biāo)準(zhǔn)品溶液后補充至20 μL，體積依次為0、1、2、4、8、12、16、20 μL。將合適體積的蛋白樣品轉(zhuǎn)移到96孔板，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋到20 μL。每個測量孔加BCA工作液20 μL，放于37℃，靜置30 min。利用酶標(biāo)儀檢測A562、540～595 nm的波長，參考標(biāo)準(zhǔn)曲線將樣本蛋白濃度計算出來。

1.3 觀察指標(biāo)

①比較兩組IGF2基因在卵巢癌組織和正常組織內(nèi)的表達差異;②分析IGF2基因在高表達和低表達中的差異。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗;計數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IGF2基因在卵巢癌組織和正常組織內(nèi)的表達差異

IGF2基因的mRNA表達，檢測方法為qRT-PCR，檢測顯示在卵巢癌組織細(xì)胞中的IGF2高表達，與正常卵巢組織比較，癌細(xì)胞中IGF2水平很高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）;IGF2蛋白的表達，檢測方法為Western-blot，檢測顯示在正常卵巢組織中IGF2蛋白表達正常，在癌細(xì)胞組織中呈現(xiàn)高表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。見表1。

為進一步證實IGF2在癌細(xì)胞中的表達情況，用上述兩實驗分別檢測癌組織、癌旁組織，取組織芯片進行檢測分析。結(jié)果顯示，癌旁組織中IGF2表達水平稍微高于正常卵巢組織，但其表達水平明顯低于癌細(xì)胞組織，比正常組織中水平高可能與癌細(xì)胞浸潤有關(guān)。

2.2 IGF2蛋白高表達和低表達在卵巢癌患者臨床各資料之間的差異比較

在qRT-PCR、Western-blot檢測基礎(chǔ)上，進行染色實驗，分析IGF2高表達與低表達患者一般資料的差異。結(jié)果顯示，兩組組織學(xué)等級比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其他臨床資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

3討論

卵巢癌屬于婦科疾病，對女性危害較大[10]，既往很多報告[11-14]顯示，IGF2基因在卵巢癌組織中呈現(xiàn)高表達狀態(tài)，且能加快細(xì)胞的有絲分裂過程，進而促使癌細(xì)胞生長速度加快。用小鼠進行實驗，發(fā)現(xiàn)IGF2能夠誘導(dǎo)停滯B細(xì)胞系生長[15]。也有相關(guān)文獻[16]報道，結(jié)腸癌、口腔癌的生長分化與IGF2基因的表達有密切相關(guān)性。在乳腺癌、白血病患者中，IGF2蛋白表達越高，患者病情進展越快。

IGF2基因經(jīng)過長期研究發(fā)現(xiàn)，能夠作為鑒別卵巢癌患者程度及分型的重要依據(jù)，且患者預(yù)后、生存質(zhì)量都與IGF2有著密切關(guān)系，相較于IGF2低表達的卵巢癌患者，IGF2高表達的卵巢癌患者的總生存期和無進展生存期都明顯縮短[17]。卵巢癌患者中，癌細(xì)胞組織、癌旁組織中的IGF2基因表達有著明顯差異，與癌旁組織比較，癌細(xì)胞組織中IGF2表達水平很高，說明該基因表達在癌癥進展過程中起到促進作用。因此，IGF2基因表達能成為癌癥進展的重要標(biāo)志[18]。

本研究通過qRT-PCR和Western-blot實驗分別在mRNA及蛋白水平上進行分析，發(fā)現(xiàn)與正常卵巢組織相比，卵巢癌組織中IGF2基因、蛋白表達均呈現(xiàn)出較高水平。進一步進行染色實驗，分析卵巢癌組織IGF2水平表達與患者病理類型、年齡等關(guān)系，發(fā)現(xiàn)病理分級受IGF2水平的直接影響，然而高表達和低表達在患者年齡、病理類型、腫瘤位置和腫瘤大小之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

計劃在下一步的研究中，新一代的基因編輯技術(shù)-CRISPR/Cas9技術(shù)，構(gòu)建敲除IGF2基因的人卵巢癌細(xì)胞，進一步研究IGF2基因?qū)β殉舶┘?xì)胞增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)作用的影響[19]。

卵巢癌細(xì)胞侵襲能力與IGF2表達是否存在聯(lián)系，研究顯示，通過Transwell實驗進行驗證，發(fā)現(xiàn)IGF2表達水平越高，癌細(xì)胞的侵襲能力越低[20]。有關(guān)IGF2基因及蛋白表達在卵巢癌患者中的情況，還需要更進一步的研究。

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（收稿日期：2021-04-21）