肺癌組織中Kras通路分子CylinD1、Caspase-3的表達(dá)差異及其臨床意義的研究

婁永富 邱模昌 周曉東 章彥 江章貴 黃奕

[關(guān)鍵詞] 非小細(xì)胞肺癌;CylinD1;Caspase-3;病理特征;預(yù)后

[中圖分類號(hào)] R734.2? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2021）29-0013-04

Study on the expression difference and clinical significance of Kras pathway molecules CylinD1 and Caspase-3 in lung cancer tissues

LOU Yongfu1? ?QIU Mochang2? ?ZHOU Xiaodong1? ?ZHANG Yan1? ?JIANG Zhanggui1? ?HUANG Yi1

1.Department of Thoracic Surgery，the People's Hospital of Shangrao City in Jiangxi Province，Shangrao? ?334000，China; 2.Department of Teaching Affairs， Jiangxi Medical College， Shangrao? ?334000，China

[Abstract] Objective To study the expression difference and clinical significance of Kras pathway molecules CylinD1 and caspase-3 in non-small cell lung cancer（NSCLC） tissues. Methods Patients with stage Ⅰ-ⅢA NSCLC who underwent surgical resection in our hospital from March 2016 to December 2017 were selected. The mRNA expression levels and protein expression levels of CylinD1 and Caspase-3 in NSCLC tissues and adjacent non-cancerous tissues were detected. Patients were followed for progression-free survival（PFS）. Results The mRNA and protein expression levels of CylinD1 in NSCLC tissues were higher than those in the paracancerous tissues（P<0.05）. The mRNA and protein expression levels of Caspase-3 in NSCLC tissues were lower than those in the paracancerous tissues（P<0.05）. The mRNA expression level and protein expression level of CylinD1 was higher in stage ⅢA，poorly differentiated NSCLC tissues than in stage Ⅰ-Ⅱ，moderately and well-differentiated NSCLC tissues（P<0.05）. The mRNA expression level and protein expression level of Caspase-3 in stage ⅢA，poorly differentiated NSCLC tissues were lower than those of stage Ⅰ-Ⅱ，moderately well-differentiated NSCLC tissues （P<0.05）. PFS was shorter in NSCLC patients with CyclinD1 expression levels ≥ median than in NSCLC patients with CyclinD1 expression levels < median（P<0.05）. NSCLC patients with Caspase-3 expression levels≥median had longer PFS than NSCLC patients with Caspase-3 expression levels < median（P<0.05）. Conclusion Increased expression of Kras pathway molecule CyclinD1 and decreased expression of Caspase-3 in NSCLC are related to pathological progress and deterioration of prognosis.

[Key words] Non-small cell lung cancer; CylinD1; Caspase-3; Pathological features; Prognosis

肺癌是我國(guó)發(fā)病率居首位的惡性腫瘤，非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung carcinoma，NSCLC）是肺癌最主要的病理類型[1]。Kras基因是Ras基因家族中3種癌基因之一，發(fā)生突變后處于持續(xù)激活狀態(tài)并介導(dǎo)促增殖、抗凋亡作用。已有研究報(bào)道，Kras基因突變與NSCLC的發(fā)病密切相關(guān)[2-3]，但Kras通路參與NSCLC發(fā)病的機(jī)制尚不十分明確。細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cysteinyl aspartate specific proteinase-3，Caspase-3）是Kras通路中重要的兩種分子，前者促進(jìn)細(xì)胞周期發(fā)展及細(xì)胞增殖，后者促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4-5]。為了闡明Kras通路在NSCLC發(fā)病中的作用，本研究分析NSCLC中CylinD1、Caspase-3的表達(dá)差異及其臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年3月至2017年12月在我院接受手術(shù)切除的Ⅰ～ⅢA期NSCLC患者作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理診斷為NSCLC，病理分期Ⅰ～ⅢA期;②臨床病理資料完整;③術(shù)后留取NSCLC組織及癌旁組織;④術(shù)后隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前接受過放化療或其他抗腫瘤治療者;②既往有其他惡性腫瘤病史者。共納入152例，其中男84例，女68例，年齡41～67歲、平均（59.58±10.93）歲。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 CylinD1、Caspase-3 mRNA表達(dá)的檢測(cè)? 取NSCLC組織和癌旁組織，采用RNA提取試劑盒提取組織中的RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用熒光定量PCR試劑盒對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，分別使用目的基因CylinD1、Caspase-3的特異性引物及內(nèi)參基因β-actin的特異性引物，得到相應(yīng)基因的PCR循環(huán)曲線及循環(huán)閾值，以β-actin為內(nèi)參、計(jì)算CylinD1及Caspase-3的mRNA表達(dá)水平。

1.2.2 CylinD1、Caspase-3蛋白表達(dá)的檢測(cè)? 取NSCLC組織和癌旁組織，加入組織裂解液進(jìn)行勻漿、提取組織蛋白，將蛋白樣本煮沸變性后進(jìn)行Western blot檢測(cè)。首先在SDS-聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳，而后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫封閉1 h，4℃孵育CylinD1、Caspase-3及β-actin的一抗過夜，次日室溫孵育二抗1 h，最后在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)顯影，得到CylinD1、Caspase-3及β-actin的蛋白條帶，根據(jù)條帶吸光值，以β-actin為內(nèi)參計(jì)算CylinD1、Caspase-3的蛋白表達(dá)水平。

1.2.3 無進(jìn)展生存期（Progression free survival，PFS）的隨訪? 采用門診復(fù)診、電話回訪等方式進(jìn)行隨訪，隨訪內(nèi)容為PFS，隨訪截止時(shí)間為2020年10月31日，從病理確診日期至發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移日期或隨訪截止日期為PFS。

1.3觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

觀察指標(biāo)包括CylinD1、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平，以及患者的PFS。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn);預(yù)后采用生存曲線進(jìn)行描述，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織及癌旁組織中CylinD1、Caspase-3表達(dá)水平的比較

與癌旁組織比較，NSCLC組織中CylinD1的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平均明顯升高，Caspase-3的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1、表1。

2.2 不同病理特征NSCLC組織中CylinD1、Caspase-3表達(dá)水平的比較

不同病理類型、原發(fā)部位NSCLC組織中CylinD1、Caspase-3的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）;病理分期ⅢA期NSCLC組織中CylinD1的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平高于Ⅰ～Ⅱ期NSCLC組織（P<0.05），Caspase-3的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平低于Ⅰ～Ⅱ期NSCLC組織（P<0.05）;低分化NSCLC組織中CylinD1的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平高于中高分化NSCLC組織（P<0.05），Caspase-3的mRNA表達(dá)水平及蛋白表達(dá)水平低于中高分化NSCLC組織（P<0.05）。見表2。

2.3 不同CylinD1表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后比較

CylinD1 mRNA表達(dá)≥中位數(shù)、蛋白表達(dá)≥中位數(shù)的NSCLC患者PFS較CylinD1 mRNA表達(dá)<中位數(shù)、蛋白表達(dá)<中位數(shù)的NSCLC患者縮短（P<0.05）。見圖2～3。

2.4 不同Caspase-3表達(dá)的NSCLC患者預(yù)后比較

Caspase-3 mRNA表達(dá)≥中位數(shù)、蛋白表達(dá)≥中位數(shù)的NSCLC患者PFS較Caspase-3 mRNA表達(dá)<中位數(shù)、蛋白表達(dá)<中位數(shù)的NSCLC患者延長(zhǎng)（P<0.05）。見圖4～5。

3 討論

NSCLC是肺癌最主要的病理類型，發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及環(huán)境因素、遺傳因素、基因突變等多環(huán)節(jié)、多因素。Kras基因是重要的癌基因，編碼產(chǎn)物具有GTP酶活性、是表皮生長(zhǎng)因子受體下游重要的通路之一，該基因發(fā)生突變會(huì)使p21蛋白GTP酶活性降低，進(jìn)而造成Kras通路持續(xù)處于激活狀態(tài)。在NSCLC發(fā)病過程中，普遍存在Kras基因突變，突變主要涉及12或13位密碼子。相關(guān)的臨床研究并未發(fā)現(xiàn)Kras基因突變與NSCLC病理特征的關(guān)系[6-7]，在NSCLC發(fā)病過程中，Kras基因突變后下游信號(hào)通路的變化與病理進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系尚缺乏臨床證據(jù)。因此，本研究將以Kras通路分子為切入點(diǎn)，深入探討Kras通路分子在NSCLC發(fā)病中的作用。

Kras通路激活具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，在惡性腫瘤發(fā)病中的效應(yīng)包括促增殖、抗凋亡。在Kras通路發(fā)揮促增殖作用的過程中，其下游分子CyclinD1的表達(dá)顯著上調(diào);在Kras通路發(fā)揮抗凋亡作用的過程中，其下游分子Caspase-3的表達(dá)顯著下調(diào)。已有研究報(bào)道，在NSCLC、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的發(fā)病過程中，腫瘤病灶內(nèi)CyclinD1的表達(dá)增加、Caspase-3的表達(dá)降低[8-10]。本研究選擇152例接受手術(shù)切除治療的NSCLC患者，對(duì)NSCLC組織及癌旁組織中CyclinD1、Caspase-3表達(dá)的差異進(jìn)行分析，與癌旁組織比較，NSCLC組織CyclinD1的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)均明顯升高，Caspase-3的mRNA表達(dá)水平和蛋白表達(dá)水平明顯降低，與既往文獻(xiàn)關(guān)于NSCLC中CyclinD1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低的結(jié)果一致。

CyclinD1具有促增殖作用，能夠與細(xì)胞周期依賴蛋白激酶結(jié)合并加速細(xì)胞周期發(fā)展，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂及增殖[11];Caspase-3具有促凋亡作用，線粒體凋亡途徑、死亡受體凋亡途徑等不同途徑最終均作用于Caspase-3，該分子能夠作用于多聚聚合酶PARP并影響DNA修復(fù)，進(jìn)而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[12]。在惡性腫瘤的發(fā)展過程中，細(xì)胞增殖增強(qiáng)、凋亡減弱能夠促進(jìn)病灶生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移，同時(shí)也可能影響腫瘤分化。本研究結(jié)果顯示，在證實(shí)NSCLC中CyclinD1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低后，進(jìn)一步分析了CyclinD1、Caspase-3表達(dá)與病理進(jìn)展的關(guān)系，隨著NSCLC分化程度降低、病理分期增加，病灶內(nèi)CyclinD1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低，提示NSCLC中CyclinD1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低與病理進(jìn)展有關(guān)。

NSCLC病理進(jìn)展是影響預(yù)后的重要因素。有研究報(bào)道，病理分期增加是NSCLL患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素[13-14]。本研究已證實(shí)CyclinD1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低與NSCLC的病理進(jìn)展有關(guān)，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步分析CyclinD1、Caspase-3表達(dá)與NSCLC患者預(yù)后的關(guān)系。已有臨床研究報(bào)道，CyclinD1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低與乳腺癌、膀胱癌預(yù)后惡化有關(guān)[15-17]。本研究對(duì)NSCLC患者的預(yù)后進(jìn)行隨訪，通過繪制PFS的KM曲線并分析證實(shí)，隨著NSCLC中CyclinD1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低、患者的PFS明顯縮短，提示NSCLC中CyclinD1、Caspase-3的異常表達(dá)與患者預(yù)后惡化有關(guān)。

綜上所述，NSCLC中Kras通路分子CyclinD1表達(dá)升高、Caspase-3表達(dá)降低;CyclinD1、Caspase-3的異常表達(dá)與病理進(jìn)展、預(yù)后惡化有關(guān)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 陳萬青，李賀，孫可欣，等. 2014年中國(guó)惡性腫瘤發(fā)病和死亡分析[J]. 中華腫瘤雜志，2018，40（1）：5-13.

[2] Araujo LH，Souza BM，Leite LR，et al. Molecular profile of KRAS G12C-mutant colorectal and non-small-cell lung cancer[J]. BMC Cancer，2021，21（1）：193.

[3] Griesinger F，Eberhardt W，Nusch A，et al. Biomarker testing in non-small cell lung cancer in routine care： Analysis of the first 3，717 patients in the German prospective，observational，nation-wide CRISP Registry （AIO-TRK-0315）[J]. Lung Cancer，2021，152：174-184.

[4] Stein CK，Pawlyn C，Chavan S，et al. The varied distribution and impact of RAS codon and other key DNA alterations across the translocation cyclin D subgroups in multiple myeloma[J]. Oncotarget，2017，8（17）：27 854-27 867.

[5] Mahmoudi N，Delirezh N，Sam MR. Modulating pluripotency network genes with omega-3 DHA is followed by caspase-3 activation and apoptosis in DNA mismatch repair-deficient/KRAS-mutant colorectal cancer stem-like cells[J]. Anticancer Agents Med Chem，2020，20（10）：1221-1232.

[6] 陳靈鋒，陳小巖，俞訓(xùn)彬. 非小細(xì)胞肺癌驅(qū)動(dòng)基因突變與臨床病理特征的關(guān)系[J]. 中華病理學(xué)雜志，2016，45（4）：221-225.

[7] 羅煒，王慧，徐韞健，等. 非小細(xì)胞肺癌患者KRAS基因突變情況分析[J]. 廣東醫(yī)學(xué)，2014，35（13）：2025-2028.

[8] 黃虎，栗娜，楊柳，等. 非小細(xì)胞肺癌組織中NF-κB和CyclinD1及p27表達(dá)與患者化療敏感性[J]. 貴州醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，44（2）：195-199.

[9] Kovtunenko OV，Bakaiev AA，Shponka IS. Analysis of expression of p63 and caspase-3 and their predictive value in patients with squamous cell carcinoma of maxillary sinus[J]. Wiad Lek，2019，72（12 cz 1）：2305-2314.

[10] Yao Q，Wang W，Jin J，et al. Synergistic role of Caspase-8 and Caspase-3 expressions：Prognostic and predictive biomarkers in colorectal cancer[J]. Cancer Biomark，2018， 21（4）：899-908.

[11] Chen Y，Huang Y，Gao X，et al. CCND1 amplification contributes to immunosuppression and is associated with a poor prognosis to immune checkpoint inhibitors in solid tumors[J]. Front Immunol，2020，10（11）：1620.

[12] Do BH，Nguyen TPT，Ho NQC，et al. Mitochondria-mediated Caspase-dependent and Caspase-independent apoptosis induced by aqueous extract from Moringa oleifera leaves in human melanoma cells[J]. Mol Biol Rep，2020，47（5）：3675-3689.

[13] 宋冠初，郭根燕，陸永濤，等. 110例局部非小細(xì)胞肺癌手術(shù)治療的預(yù)后分析[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2020，28（10）：1659-1663.

[14] 周舟，侯煒. 非小細(xì)胞肺癌術(shù)后患者預(yù)后相關(guān)因素回顧性分析[J]. 中華中醫(yī)藥雜志，2019，34（10）：4820-4823.

[15] Liu X，Jiang S，Tian X，et al. Expression of cleaved caspase-3 predicts good chemotherapy response but poor survival for patients with advanced primary triple-negative breast cancer[J]. Int J Clin Exp Pathol，2018，11（9）：4363-4373.

[16] Yang X，Zhong DN，Qin H，et al. Caspase-3 over-expression is associated with poor overall survival and clinicopathological parameters in breast cancer：A meta-analysis of 3091 cases[J]. Oncotarget，2017，9（9）：8629-8641.

[17] March-Villalba JA，Ramos-Soler D，Soriano-Sarrió P，et al. Immunohistochemical expression of Ki-67，Cyclin D1，p16INK4a，and Survivin as a predictive tool for recurrence and progression-free survival in papillary urothelial bladder cancer pTa/pT1 G2（WHO 1973）[J]. Urol Oncol，2019，37（2）：158-165.

（收稿日期：2021-05-06）