PPARGC1A通過影響腫瘤微環(huán)境中免疫成分改善腎透明細(xì)胞癌的預(yù)后

儲(chǔ)昭陽，朱向明，江峰，劉表虎，李國杰，龔儒杰，馬平川，徐凱慧

(1. 皖南醫(yī)學(xué)院研究生院，安徽 蕪湖 241000；2. 皖南醫(yī)學(xué)院弋磯山醫(yī)院超聲醫(yī)學(xué)科，安徽 蕪湖 241000；3. 浙江省臺(tái)州市黃巖區(qū)婦幼保健院超聲醫(yī)學(xué)科，浙江 臺(tái)州 318020)

腎細(xì)胞癌(renal cell carcinoma，RCC)起源于腎上皮，是最常見的腎癌類型[1]，預(yù)后差[2]。RCC約占腎癌的90%，其中最常見的組織亞型是腎透明細(xì)胞癌(kidney renal clear cell carcinoma，KIRC)[3]。目前根治性切除是KIRC的主要治療方法，其次是放療、化療和靶向治療，然而，即使在成功的治療后，30%的患者出現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[4]，因此，探討KIRC的發(fā)生機(jī)制和治療方法已迫在眉睫。腫瘤微環(huán)境(tumor microenvironment，TME)的結(jié)構(gòu)成分主要是基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞[5]。本研究應(yīng)用ESTIMATE和CIBERSORT計(jì)算方法[6]，計(jì)算了來自癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)數(shù)據(jù)庫的KIRC樣本的TICs比例和TME中免疫和基質(zhì)成分的比率，并確定了一個(gè)預(yù)測性生物標(biāo)志物：過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1A(PPARGC1A)。最近的一項(xiàng)研究也發(fā)現(xiàn)，PPARGC1A缺乏會(huì)引起自發(fā)性腎臟炎癥并增加急性腎損傷(AKI)的嚴(yán)重性[7]。本文從KIRC免疫成分和基質(zhì)成分比較產(chǎn)生的差異表達(dá)基因(DEGs)出發(fā)，通過一系列分析揭示PPARGC1A可能是KIRC中TME狀態(tài)改變的潛在指標(biāo)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)準(zhǔn)備并進(jìn)行評(píng)分 從TCGA數(shù)據(jù)庫(https：//portal.gdc.cancer.gov/)下載611例KIRC病例的轉(zhuǎn)錄組RNA-seq數(shù)據(jù)(正常樣本72例；腫瘤樣本539例)和相應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)(年齡、性別、腫瘤分級(jí)、病理分期和生存結(jié)果)，利用LIMMA軟件包進(jìn)行歸一化處理，刪除正常或重復(fù)的樣本[8]。之后使用R語言4.0.2版本，加載ESTEST軟件包[9]，對(duì)每個(gè)樣本的TME中免疫、基質(zhì)成分的比例進(jìn)行估計(jì)，分別表現(xiàn)為免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和總評(píng)分三種評(píng)分形式，它們分別與免疫、基質(zhì)和兩者的總和的比率正相關(guān)，這意味著各自的分?jǐn)?shù)越高，在TME的相應(yīng)成分的比率越大。

1.2 生存分析及DEGs的提取 使用軟件包Survminer進(jìn)行生存分析。在539例腫瘤標(biāo)本中，537例有詳細(xì)的生存時(shí)間記錄，用于生存分析。緊接著根據(jù)與免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的中位數(shù)的比較，539個(gè)腫瘤樣本分別被標(biāo)記為高分組或低分組。用LIMMA軟件包進(jìn)行基因表達(dá)的差異性分析，通過比較高分樣本和低分樣本產(chǎn)生的DEGs。將log2(Fold change)的絕對(duì)值>1.0的DEGs(高分組/低分組)和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05的DEGs視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.3 GO和KEGG富集分析、熱圖及臨床分期與評(píng)分的相關(guān)性分析 將得到的DEGs進(jìn)行GO和KEGG富集分析，在R軟件包c(diǎn)lusterProfiler、enrichplot和ggplot2的幫助下進(jìn)行，只有P值和q值均<0.05的通路才被認(rèn)為是顯著富集。用R語言結(jié)合pheatmap軟件包生成DEGs的熱圖，之后從TCGA下載與KIRC標(biāo)本相對(duì)應(yīng)的臨床病理特征數(shù)據(jù)。采用R語言進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以Wilcoxon秩和檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)為顯著性檢驗(yàn)，在不同臨床分期之間進(jìn)行比較。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建及Cox回歸分析 在String數(shù)據(jù)庫對(duì)得到的DEGs構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，然后用Cytoscape 3.6.1進(jìn)行重構(gòu)。利用交互關(guān)系置信度>0.40的節(jié)點(diǎn)構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)PPI中的主要節(jié)點(diǎn)按其具有相關(guān)性的數(shù)量多少排序；用R語言對(duì)DEGs進(jìn)行單變量Cox回歸分析。將結(jié)果按P值從小到大的順序排序，之后對(duì)二者的分析結(jié)果取交集。

1.5 目標(biāo)基因驗(yàn)證及基因數(shù)據(jù)集富集分析 運(yùn)用R語言探討選取的目標(biāo)基因在腫瘤和正常組織中的表達(dá)水平，并根據(jù)TCGA-KIRC數(shù)據(jù)和完整的臨床信息，對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行生存分析和臨床相關(guān)性的分析。然后對(duì)所有腫瘤樣品的轉(zhuǎn)錄組都用于GSEA(基因集富集分析)，使用gsea-4.0.3軟件執(zhí)行GSEA的目標(biāo)集(C2 KEGG基因數(shù)據(jù)集v7.1和C7免疫學(xué)特征基因數(shù)據(jù)集v6.2)。只有NOMP<0.05的基因集被認(rèn)為是有意義的。

1.6 腫瘤浸潤免疫細(xì)胞分析 采用CIBERSORT計(jì)算方法估計(jì)所有腫瘤樣本中的腫瘤浸潤免疫細(xì)胞豐度分布，然后進(jìn)行質(zhì)量過濾，只選擇P<0.05的腫瘤樣本進(jìn)行免疫細(xì)胞與目標(biāo)基因的相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 免疫評(píng)分與KIRC患者的生存率相關(guān) 為了建立估計(jì)的免疫和基質(zhì)比例與生存率的相關(guān)性，分別對(duì)免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和總評(píng)分進(jìn)行生存分析。免疫評(píng)分或基質(zhì)評(píng)分中估計(jì)的較高分?jǐn)?shù)代表TME中免疫或基質(zhì)成分的數(shù)量較多?？傇u(píng)分是免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分的總和，表示兩者在TME中的綜合比例。如圖1A所示，免疫成分比例與總體存活率呈負(fù)相關(guān)。盡管基質(zhì)評(píng)分和總評(píng)分與總生存率無顯著相關(guān)性(見圖1B、圖1C)。提示TME中的免疫成分更適合作為判斷KIRC患者預(yù)后的指標(biāo)。

注：A：免疫評(píng)分；B：基質(zhì)評(píng)分；C：總評(píng)分。圖1 免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和總評(píng)分與KIRC患者存活率的相關(guān)性

2.2 免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和總評(píng)分與KIRC患者的臨床病理分期有關(guān) 為了確定免疫成分和基質(zhì)成分的比例與臨床病理特征之間的關(guān)系，我們從TCGA數(shù)據(jù)庫中分析了KIRC病例的相應(yīng)臨床信息。免疫評(píng)分結(jié)果表明，男性的免疫評(píng)分高于女性(P=0.015)；在Ⅰ期和Ⅱ期、Ⅰ期和Ⅲ期、Ⅰ期和Ⅳ期中，后者的免疫評(píng)分高于前者(P=0.052、0.0004、0.0002)；在T1和T3中， 后者的免疫評(píng)分也高于前者(P=0.030)。<65歲組的基質(zhì)評(píng)分高于65歲以上的組(P=0.0064)；T2組的基質(zhì)評(píng)分高于T1組(P=0.040)。 這些結(jié)果表明免疫成分和基質(zhì)成分的比例與KIRC的進(jìn)展有關(guān)。

2.3 免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分共有的DEGs主要表現(xiàn)為免疫相關(guān)基因的富集 為了確定TME中有關(guān)免疫和基質(zhì)成分的基因譜的準(zhǔn)確變化，對(duì)高分和低分樣本進(jìn)行了比較分析。與中位數(shù)相比，從免疫評(píng)分中獲得了569個(gè)DEGs(高分與低分的樣本)，其中有466個(gè)基因上調(diào)，有103個(gè)基因下調(diào)。同樣，從基質(zhì)評(píng)分獲得312個(gè)DEG(215個(gè)上調(diào)基因和97個(gè)下調(diào)基因)。相交分析顯示，免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分中共有44個(gè)高分相交的上調(diào)基因，和49個(gè)低分相交的下調(diào)基因。這些DEGs(共93個(gè)基因)可能是TME中的決定因素。基因本體(GO)富集分析的結(jié)果表明，DEGs幾乎映射到與免疫相關(guān)的GO通路，例如白細(xì)胞增殖和體液免疫反應(yīng)(見圖2A)。京都基因與基因組百科全書(KEGG)富集分析還顯示了原發(fā)性免疫缺陷，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和造血細(xì)胞譜系的富集(見圖2B)。因此，DEGs的整體功能似乎映射在免疫相關(guān)活動(dòng)上，這表明免疫因素的參與或許是KIRC中TME的一個(gè)潛在特征。

圖2 對(duì)DEGs的GO(A)和KEGG(B)富集分析

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)與單變量Cox回歸的交集分析 為了進(jìn)一步探索其潛在機(jī)制，我們使用Cytoscape軟件基于STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建了52個(gè)DEGs的93個(gè)關(guān)系的PPI網(wǎng)絡(luò)，并表示了按節(jié)點(diǎn)數(shù)排列的前30個(gè)DEGs的條形圖(見圖3A)。對(duì)KIRC患者的生存進(jìn)行單因素Cox回歸分析，以確定影響KIRC患者生存的顯著因素(見圖3B)。然后，對(duì)PPI網(wǎng)絡(luò)中的領(lǐng)先節(jié)點(diǎn)與單變量Cox回歸中P值排名前30位的因素進(jìn)行交集分析，只有IGLL5、PPARGC1A、MZB1、HSD11B1和TNFSF13B這5個(gè)基因重疊 (見圖3C)，通過對(duì)這5個(gè)基因進(jìn)一步生存分析發(fā)現(xiàn)，僅有PPARGC1A的表達(dá)水平與KIRC患者的預(yù)后成正相關(guān)。

注：A：按節(jié)點(diǎn)數(shù)排序的前30個(gè)基因；B：單因素Cox回歸分析； C：顯示PPI中前30個(gè)節(jié)點(diǎn)和單變量Cox中最顯著因子的Venn圖。圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)與單變量Cox回歸分析

2.5 PPARGC1A表達(dá)與KIRC患者生存期及TNM分期的關(guān)系 PPARGC1A在B細(xì)胞的增殖和分化中起重要作用。在本研究中，將所有KIRC樣本分為PPARGC1A高表達(dá)組和PPARGC1A低表達(dá)組，并與PPARGC1A中位值進(jìn)行比較表達(dá)式生存分析顯示，PPARGC1A高表達(dá)的KIRC患者的生存率高于PPARGC1A低表達(dá)患者(見圖4A)。之后，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)分析顯示腫瘤樣本中PPARGC1A的表達(dá)顯著低于正常樣本(見圖4B)。在來自同一患者的正常組織和腫瘤組織的配對(duì)分析中也觀察到類似的結(jié)果(見圖4C)。以上結(jié)果表明，TME中PPARGC1A的表達(dá)與KIRC的預(yù)后呈正相關(guān)，病人PPARGC1A的表達(dá)隨TNM分期的進(jìn)展而降低，特別的是，PPARGC1A的表達(dá)在不同年齡組及性別之間無明顯相關(guān)性。

注：A：PPARGC1A高低表達(dá)患者的生存分析；B、C：PPARGC1A在標(biāo)本中的表達(dá)。圖4 PPARGC1A在KIRC患者中的表達(dá)及生存分析

2.6 PPARGC1A有可能成為TME調(diào)制的指標(biāo) 鑒于PPARGC1A的水平與KIRC患者的生存期和TNM分期的相關(guān)性，因此使用GSEA軟件分別應(yīng)用于高表達(dá)和低表達(dá)組。如圖5A所示，在C2 kegg v7.1數(shù)據(jù)集，PPARGC1A高表達(dá)組的基因在代謝途徑中富集，例如賴氨酸降解、丙酸酯代謝、纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的降解、丙酮酸代謝、丁酸酯代謝、三羧酸循環(huán)(TCA cycle)、脂肪酸代謝、過氧化物酶體、近端小管碳酸氫鹽回收和ErbB信號(hào)通路。對(duì)于C7基因集：免疫學(xué)特征數(shù)據(jù)集，多個(gè)免疫功能基因集在高PPARGC1A表達(dá)組中富集(見圖5B)，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)、B細(xì)胞分化、激活的CD4 T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，B淋巴細(xì)胞、先天免疫刺激。這些結(jié)果表明，PPARGC1A可能是TME中調(diào)節(jié)免疫成分的潛在指標(biāo)。

2.7 PPARGC1A與腫瘤浸潤免疫細(xì)胞(TICs)比例的相關(guān)性 為了進(jìn)一步證實(shí)PPARGC1A表達(dá)與免疫微環(huán)境的相關(guān)性，使用CIBERSORT算法分析了腫瘤浸潤免疫亞群的比例，并在KIRC樣品中構(gòu)建了22種免疫細(xì)胞譜(見圖6)。差異和相關(guān)分析的交集結(jié)果表明，共有9種TICs與PPARGC1A的表達(dá)相關(guān)(見圖7)。其中5種TICs與PPARGC1A表達(dá)呈正相關(guān)，包括幼稚B細(xì)胞、靜息肥大細(xì)胞、CD4記憶靜息T細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M2。4種TICs與PPARGC1A表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，包括漿細(xì)胞、CD8T細(xì)胞、Tfh、Treg。這些結(jié)果進(jìn)一步支持了PPARGC1A的表達(dá)水平影響TME的免疫活性。

注：A：高PPARGC1A表達(dá)樣品在C2 kegg v7.1數(shù)據(jù)集中富集的基因集。每條線代表一個(gè)

注：小提琴圖顯示PPARGC1A低表達(dá)或高表達(dá)的KIRC腫瘤標(biāo)本中21種免疫細(xì)胞相對(duì)于PPARGC1A表達(dá)水平中位數(shù)的比值分布，采用Wilcoxon秩和法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。圖6 KIRC腫瘤標(biāo)本中免疫細(xì)胞分布

注：A：散點(diǎn)圖顯示與PPARGC1A表達(dá)具有相關(guān)性的TICs(P<0.05)。各小區(qū)的藍(lán)線

3 討論

作為腎癌中最常見的亞型，KIRC很難治愈[2]，因?yàn)槿狈τ行в糜贙IRC治療的治療靶點(diǎn)和分子藥物。在過去的12年里，RCC的醫(yī)療已經(jīng)從非特異性免疫途徑(在細(xì)胞因子時(shí)代)過渡到針對(duì)血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的靶向治療，現(xiàn)在已經(jīng)過渡到新的免疫治療藥物[1，10]。然而，要提高對(duì)特定藥物反應(yīng)的患者選擇仍然是一項(xiàng)主要挑戰(zhàn)，需要更好的生物標(biāo)志物和預(yù)測模型[11]。本研究從高、低免疫、基質(zhì)評(píng)分組的比較中篩選出總共93個(gè)相交的DEGs。功能富集分析和KEGG通路分析表明，DEGs在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和初級(jí)免疫缺陷中明顯聚集，暗示與免疫微環(huán)境密切相關(guān)。

既往研究指出[7]，PPARGC1A缺乏會(huì)引起自發(fā)性腎臟炎癥并增加腎毒性AKI的嚴(yán)重性。同樣，我們的結(jié)果表明，PPARGC1A在KIRC患者的晚期表達(dá)降低。 因此，我們進(jìn)一步分析了PPARGC1A表達(dá)與TME之間的關(guān)系。GSEA富集分析結(jié)果表明，PPARGC1A高表達(dá)組的基因在代謝途徑中顯著富集，尤其在三羧酸循環(huán)中。同位素示蹤顯示，人類透明細(xì)胞腎細(xì)胞癌的體內(nèi)葡萄糖氧化受到抑制[12]，因此我們考慮PPARGC1A的高表達(dá)通過代謝途徑對(duì)KIRC的進(jìn)展發(fā)揮抑制作用。對(duì)于C7基因集：免疫學(xué)特征數(shù)據(jù)集，多個(gè)免疫功能基因集在高PPARGC1A表達(dá)組中富集，這些結(jié)果表明，PPARGC1A可能是TME中調(diào)節(jié)免疫成分的潛在指標(biāo)，并且可能是TME狀態(tài)從免疫顯性向代謝顯性轉(zhuǎn)變的一個(gè)指標(biāo)。

之后，我們?cè)u(píng)估了KIRC樣品中22種免疫細(xì)胞的獨(dú)特浸潤比例。分析表明，幼稚B細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M2與KIRC患者PPARGC1A的表達(dá)呈正相關(guān)，提示PPARGC1A可能與TME免疫活性狀態(tài)的維持有關(guān)。預(yù)后不良的高?；颊咧蠺regs和Tfh細(xì)胞的比例較高，與PPARGC1A的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。B細(xì)胞可被腫瘤細(xì)胞激活并分泌免疫球蛋白以抑制腫瘤生長[13]。巨噬細(xì)胞M2與抑制免疫反應(yīng)、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和促進(jìn)血管生成有關(guān)的主要功能特性仍然是最重要的，對(duì)腫瘤的發(fā)展起到了抑制作用[14]。長期以來，Tregs被認(rèn)為是免疫抑制抑制的主要因素，并被認(rèn)為與預(yù)后不良有關(guān)[15-16]。并且，據(jù)報(bào)道，Tregs對(duì)KIRC的預(yù)后具有反常的負(fù)面作用[17]。在本研究中發(fā)現(xiàn)表明，幼稚B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞M2在KIRC發(fā)展過程中也可能發(fā)揮保護(hù)作用，Tregs在KIRC預(yù)后中可能發(fā)揮負(fù)面作用，Tfh細(xì)胞也可能發(fā)揮負(fù)面作用，PPARGC1A的表達(dá)提高可能會(huì)降低KIRC患者Tregs、Tfh細(xì)胞水平。

總之，根據(jù)基于ESTIMATE算法的免疫和基質(zhì)評(píng)分，鑒定了93個(gè)TME相關(guān)DEGs。功能富集分析進(jìn)一步表明，PPARGC1A可能是TME狀態(tài)從免疫顯性向代謝顯性轉(zhuǎn)變的一個(gè)指標(biāo)。然后通過一系列分析得出PPARGC1A可能作為評(píng)估KIRC患者預(yù)后的樞紐基因，使用CIBERSORT評(píng)估了高危和低危人群之間22種與PPARGC1A相關(guān)的TICs的比例及其相關(guān)性。本研究表明，TME的免疫成分影響KIRC患者的臨床結(jié)局，并可能基于PPARGC1A為KIRC患者開發(fā)新的免疫療法提供基礎(chǔ)。