抗乙肝藥物恩替卡韋的合成工藝改進(jìn)

王 喬，劉騫峰

(1.西安建筑科技大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 西安 710000；2.西安瑞聯(lián)新材料股份有限公司，陜西 西安 710000)

乙型病毒性肝炎是一類由乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染的肝臟性疾病，易導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌[1-2]，是一個全球性的公共問題.根據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，2015年，全球范圍內(nèi)約有2.57億人感染慢性乙肝，導(dǎo)致約88.7萬人死亡.2017年，約有110萬新感染者[3].2018年12月8日在韋立得上市會上，中國工程院院士莊輝發(fā)表的講話中指出：“目前中國大約有8 600萬乙肝病毒攜帶者，約占全球感染人數(shù)的1/3.如對慢性乙肝患者不進(jìn)行抗病毒治療，從2015年到2030年，預(yù)計(jì)約有1 000萬人將死于乙肝相關(guān)的肝硬化和肝癌等疾病[4-5]”.目前，乙肝的治療主要是抗病毒治療，其中應(yīng)用較多的是核苷類藥物[6-8].

恩替卡韋(Entecavir)是美國BMS公司的分子藥理學(xué)家COLONNO博士研究出來的一種藥物，最早是用來治療單純皰疹病毒感染，但在臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)該藥物對HBV-DNA具有很強(qiáng)的抑制作用，故開發(fā)作為乙肝治療藥物，于2005年3月被美國FDA批準(zhǔn)上市，商品名博路定，目前是乙肝臨床治療中應(yīng)用最廣泛的一線藥物，具有抗病毒作用強(qiáng)，低耐藥率的特點(diǎn).2020年年初，在COVID19治療藥物的研究過程中，研究人員將恩替卡韋作為候選.對恩替卡韋抗病毒作用進(jìn)行分析，用SARS病毒的RdRp結(jié)構(gòu)與2019-nCoV的RdRp蛋白序列進(jìn)行同源分析后進(jìn)行3D建模，然后與恩替卡韋三磷酸進(jìn)行分子對接，發(fā)現(xiàn)其可以完好結(jié)合到RdRp的活性口袋，從這些已知的分子藥理機(jī)制來看，恩替卡韋可能具有廣譜抗病毒作用，不僅僅對HBV有效，后續(xù)還需要更多的臨床試驗(yàn)證實(shí).

恩替卡韋，結(jié)構(gòu)式如圖1，化學(xué)名為2-氨基-9-[(1S,3S,4S)-4-羥基-3-羥甲基-2-亞甲戊基]-1，9-氫-6-H-嘌呤-6-酮-水合物，是一種鳥嘌呤核苷酸類似物.

Fig.1 Chemical structure of entecavir

目前關(guān)于恩替卡韋的合成路線眾多[9-14].最早的合成路線是專利US5206244A1所報(bào)道的以環(huán)戊二烯為原料合成恩替卡韋，專利中發(fā)生的氧化反應(yīng)是Pfitzner-Moffatt氧化，該氧化中反應(yīng)試劑DMSO需過量，而且反應(yīng)中可能會發(fā)生副反應(yīng).在后續(xù)對恩替卡韋的路線研究中，相繼出現(xiàn)以S-二甲基-3-羥基己二酸酯，(1R)-(+)-α-蒎烯，1,3-丙二醇等為原料的合成路線，這些路線都或多或少存在某些問題.本研究是在專利US5206244A1的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，結(jié)合現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料，對路線中涉及的各步反應(yīng)進(jìn)行單因素條件優(yōu)化，最終制備得到恩替卡韋.具體合成路線如圖2所示.

圖2 恩替卡韋的合成路線

本研究對第一步氨基的保護(hù)反應(yīng)采用單因素實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件.目前該步合成中存在的主要問題是反應(yīng)時間過長，本研究針對這一問題對投料方式及投料比進(jìn)行優(yōu)化，有效縮短反應(yīng)周期，更適合工業(yè)化生產(chǎn).為控制第二步反應(yīng)氧化產(chǎn)物互變異構(gòu)問題，對該反應(yīng)的后處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

儀器：智能恒溫電熱套(陜西愛信儀器有限公司)，DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(陜西予輝儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海申生科技有限公司)，DHJF-4020低溫恒溫加熱式磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，循環(huán)水式真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，高效液相色譜儀(日本島津)，液質(zhì)聯(lián)用儀(日本島津).

試劑：(1S,2S,3S,5S)-5-(2-氨基-6-芐氧基-9H-嘌呤-9-基)-3-芐氧基-2-芐氧基甲基環(huán)戊醇、4-甲氧基三苯基氯甲烷、戴斯馬丁氧化劑、納斯特試劑、三氯化硼，除四氯化鈦，叔丁醇為分析純外，合成使用的其他試劑均為工業(yè)級.

1.2 合成過程

1.2.1 化合物3的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在250 mL三頸圓底燒瓶中先加入二氯甲烷100 mL，加入化合物210.0 g(18.1 mmol)，4-甲氧基三苯基氯甲烷7.72 g(25.0 mmol)，三乙胺2.73 g，4-二甲氨基吡啶0.20 g，(其中4-甲氧基三苯基氯甲烷分5批次投加，每批1.54 g，間隔20 min)，保溫20～30 ℃反應(yīng)，TLC點(diǎn)板檢測跟蹤反應(yīng)，約1 h反應(yīng)完全，停止反應(yīng).反應(yīng)完畢后向反應(yīng)體系中加入碳酸氫鈉溶液淬滅反應(yīng)，分液后水相用二氯甲烷萃取，萃取液用飽和食鹽水洗滌，然后無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，減壓蒸餾除去溶劑，得到油狀濃縮物，柱色譜分離得到類白色泡沫狀固體14.1 g，收率為95.2%，液相檢測純度為99.6%.MS(m/z)：824[M+H]+.

1.2.2 化合物4的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在250 mL三頸圓底燒瓶中依次加入戴斯馬丁氧化劑7.21 g(17.0 mmol)，二氯甲烷70 mL，叔丁醇1.33 g，攪拌至溶解清亮.滴加化合物310 g(12.1 mmol)的二氯甲烷溶液100 mL，滴加完畢后攪拌反應(yīng)，約3 h反應(yīng)完全，停止反應(yīng).將反應(yīng)體系降溫至0～10 ℃，加入混合溶液(10%的亞硫酸鈉溶液：5%的碳酸氫鈉溶液：5%的食鹽溶液體積比為1.5∶1.0∶1.0)300 mL，攪拌30 min，分出有機(jī)相，水相用二氯甲烷萃取，將有機(jī)相合并，分別用水、飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，減壓濃縮，得到化合物4粗品10.17 g，液相檢測純度為89.8%.MS(m/z)：822[M+H]+.粗品直接投入下一步反應(yīng).

1.2.3 化合物5的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，250 mL圓底燒瓶中加入納斯特試劑27.60 g(60.5 mmol)，冷卻至0～5 ℃，加入四氯化鈦11.54 g，加畢后繼續(xù)將體系冷卻至-30～-20 ℃，滴加化合物4粗品10.17 g的四氫呋喃溶液100 mL，滴畢后緩慢升溫至20～30 ℃反應(yīng)，TLC檢測跟蹤反應(yīng)，約3 h反應(yīng)完全，停止反應(yīng).向反應(yīng)液中緩慢加入飽和碳酸氫鈉溶液500 mL(有氣泡產(chǎn)生，并有沉淀生成)，攪拌1 h，過濾.有機(jī)相水洗至中性，無水硫酸鈉干燥，過濾除去硫酸鈉，減壓濃縮得到類白色油狀物9.31 g，柱色譜分離后得到類白色泡沫狀固體6.99 g，收率為71%，液相檢測純度為95.6%.MS(m/z)：819[M+H]+.

1.2.4 化合物6的合成

將化合物56.99 g(8.5 mmol)溶于四氫呋喃35 mL和甲醇35 mL中，滴加2 mol/L的鹽酸51 mL，滴畢后，回流反應(yīng)，約3 h反應(yīng)完全，停止反應(yīng).反應(yīng)液冷卻至室溫，加入水80 mL淬滅反應(yīng)，攪拌下用1 mol/L的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至中性，水相用乙酸乙酯萃取，合并有機(jī)相，減壓濃縮蒸除部分溶劑，殘余物冷卻至-10 ℃，攪拌析晶，過濾，得到類白色固體2.5 g，收率為64%，液相檢測純度為96.8%.MS(m/z)：457[M+H]+.

1.2.5 恩替卡韋1的合成

氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將化合物62.5 g(5.5 mmol)溶于二氯甲烷25 mL中，冷卻至-80～-70 ℃，控制該溫度下滴加1 mol/L的三氯化硼的二氯甲烷溶液55 mL，滴畢后緩慢升溫至-30～-20 ℃，約5 h反應(yīng)完全，停止反應(yīng).控制體系溫度為-30 ℃，緩慢滴加甲醇溶液，加畢后將體系升至室溫減壓蒸除溶劑，殘余物中加入甲醇溶解，減壓濃縮，得到的殘余物中水、乙酸乙酯攪拌，分液，水相用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)至中性.加入活性炭脫色，過濾，減壓蒸餾.將體系冷卻至0 ℃，過濾得到化合物1粗品.粗品用乙醇-水體系重結(jié)晶2次，得到白色的恩替卡韋0.83 g，收率為51%，液相檢測純度為99.4%.MS(m/z)：278[M+H]+，276[M-H]-.13C NMR(126 MHz, DMSO):δ156.84, 153.48, 151.44, 151.26, 136.00, 116.21, 109.26, 70.39, 63.00, 55.13, 54.07.1H NMR(500 MHz, DMSO):δ10.59(s, 1H), 7.67(s, 1H), 6.42(s, 2H), 5.36(dd,J= 10.4, 8.0 Hz, 1H), 5.10(s, 1H), 4.87(s, 1H), 4.83(s, 1H), 4.56(t,J= 2.1 Hz, 1H), 4.23(s, 1H), 3.54(d,J= 4.9 Hz, 2H), 3.37(s, 2H), 2.61-2.46(m, 2H), 2.28-2.16(m, 1H), 2.04(dd,J= 12.5, 7.8 Hz, 1H).

圖3 恩替卡韋1高效液相圖譜(a)、液質(zhì)圖譜(b)、核磁共振碳譜(c)、核磁共振碳譜(d)

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物3的合成

氨基的保護(hù)反應(yīng)是一種常見的反應(yīng)類型，目前合成中所用的氨基保護(hù)基種類也很多，在該實(shí)驗(yàn)中選擇的保護(hù)基為4-甲氧基三苯基氯甲烷(MMTCl)，反應(yīng)條件溫和.通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，溫度對反應(yīng)收率的影響不大.分批投加保護(hù)基可較大程度地縮短反應(yīng)時間，同時分批投加能夠有效控制體系中的保護(hù)基濃度，避免原料中羥基被保護(hù)，發(fā)生副反應(yīng)，故反應(yīng)選擇分5批投加氨基保護(hù)基.通過單因素實(shí)驗(yàn)對反應(yīng)進(jìn)行優(yōu)化，詳見表1.其最佳工藝條件為化合物2：4-甲氧基三苯基氯甲烷：三乙胺的物質(zhì)的量之比為1.0∶1.4∶1.5，繼續(xù)增加料比時，收率變化不大，并且有緩慢減小的趨勢，原因在于體系中保護(hù)基含量過高發(fā)生副反應(yīng).

表1 物料料比對反應(yīng)的影響

2.2 化合物4的合成

化合物4的合成采用的氧化劑為戴斯馬丁氧化劑，反應(yīng)條件溫和，選擇性高.該反應(yīng)中存在的問題是，反應(yīng)生成的酮化合物易發(fā)生互變異構(gòu)，異構(gòu)體的轉(zhuǎn)變主要有如圖4所示的兩種方式，分別生成2R3S5R和2R3S5R異構(gòu)體.

圖4 化合物3的酮式-烯醇式的互變異構(gòu)

體系中化合物4與兩種異構(gòu)體之間會相互轉(zhuǎn)化，但當(dāng)異構(gòu)體含量較大時，會影響下步反應(yīng)收率，原因在于化合物4轉(zhuǎn)化生成的兩種異構(gòu)體由于立體效應(yīng)較難與納斯特試劑發(fā)生反應(yīng)，所以需對體系中異構(gòu)體含量進(jìn)行控制，其中主要是對后處理?xiàng)l件的優(yōu)化，詳見表2.

表2 后處理?xiàng)l件對反應(yīng)的影響

2.3 化合物5的合成

化合物5的合成主要是發(fā)生亞甲基化反應(yīng)，選用的亞甲基化試劑為納斯特試劑，相比于Zn/TiCl4體系，納斯特試劑的使用更方便.反應(yīng)的機(jī)理推測如下圖5.該反應(yīng)后處理生成的鋅氫氧化物和鈦氫氧化物難溶物直接采用硅藻土過濾，能夠加快速率.

圖5 化合物5合成機(jī)理圖

3 結(jié)論

本文對恩替卡韋合成工藝進(jìn)行優(yōu)化，在制備化合物3時，通過改變投料方式，并對物料配比進(jìn)行優(yōu)化，縮短了反應(yīng)時間，同時減少了副反應(yīng)的發(fā)生，收率可提高至95%.合成化合物4時，對后處理?xiàng)l件進(jìn)行優(yōu)化，可降低體系中異構(gòu)體含量.優(yōu)化后的合成路線符合當(dāng)前綠色化學(xué)的理念，反應(yīng)條件溫和，操作更簡便，產(chǎn)率高，安全性好，在工業(yè)化生產(chǎn)中有較好的應(yīng)用價(jià)值.