一種新的真核DNA表觀遺傳標(biāo)記
——6mA

祁 婧，涂艷陽(yáng) (空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院實(shí)驗(yàn)外科,陜西西安710038)

0 引言

基因在某種程度上決定大多數(shù)常見(jiàn)疾病的風(fēng)險(xiǎn)［1－3］,同時(shí)也不排除環(huán)境因素等一系列其他的因素,而其中表觀遺傳學(xué)在個(gè)體的遺傳因素和環(huán)境之間提供了一個(gè)機(jī)械的交叉點(diǎn)［4－6］,那么通過(guò)找出該交叉口控制分子機(jī)制就有可能探究出疾病發(fā)生的秘密,以及采取具體的直接的治療方案來(lái)影響這一過(guò)程并改變其中的疾病風(fēng)險(xiǎn)［7］。目前所報(bào)道的,與表觀遺傳學(xué)相關(guān)的疾病主要有腫瘤、心血管病、精神病和自身免疫系統(tǒng)性病等［8－9］。

DNA甲基化屬于表觀遺傳學(xué)［1－2］范疇,是其研究中最深入的方向。DNA甲基化是最常見(jiàn)的復(fù)制后及轉(zhuǎn)錄后修飾方式之一,它不改變DNA一級(jí)結(jié)構(gòu),在細(xì)胞生長(zhǎng)分化、基因表達(dá)模式以及基因組的穩(wěn)定性中起著至關(guān)重要的作用。DNA甲基化是目前研究最為廣泛的表觀遺傳現(xiàn)象。在真核生物體內(nèi),DNA甲基化是一種酶介導(dǎo)的化學(xué)修飾,在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMTs)的作用下,以 S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine,SAM)為甲基供體,將甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到胞嘧啶和鳥嘌呤雙核苷酸(CpG島或稱CpG)的胞嘧啶上,當(dāng)然生物亦能通過(guò)屏蔽甲基轉(zhuǎn)移酶的作用實(shí)現(xiàn)去甲基化［10－11］。

2015年,三項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)在三種不同的真核生物中6mA獨(dú)立存在,揭示了這種甲基化修飾在真核生物中的功能［12－14］。通過(guò)利用和開發(fā)幾種高通量測(cè)序方法在Chlamydomonas基因組DNA中繪制6mA,顯示6mA不僅富含轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)周圍的ApT二核苷酸,還標(biāo)記了活性轉(zhuǎn)錄基因,并標(biāo)記了接頭相鄰核小體之間的DNA區(qū)域,表明衣藻基因組中腺嘌呤甲基化的潛在基因激活功能(圖 1B)［15－16］。

1 m6A的發(fā)現(xiàn)

最初N6-甲基腺嘌呤(6mA或 m6dA)在細(xì)菌DNA中被發(fā)現(xiàn),參與DNA修復(fù)、復(fù)制和細(xì)胞防御。20世紀(jì)50年代Dunn等［17］在探究胸腺胞嘧啶(T)的結(jié)構(gòu)類似物對(duì)需T菌株的影響時(shí),將DNA水解后利用二維紙層析方法進(jìn)行堿基分離時(shí),發(fā)現(xiàn)了第5個(gè)紫外吸收光點(diǎn) X——6mA。然而6mA目前在萊茵衣藻、秀麗隱桿線蟲、果蠅、真菌等真核生物中發(fā)現(xiàn)了DNA-6mA的存在。然而,真核系統(tǒng)中6mA的功能仍然沒(méi)有得到完全揭示。m6A的廣泛存在得到研究人員越來(lái)越多的關(guān)注,從而針對(duì)其生物學(xué)意義和重要性進(jìn)行更深入的研究。

隨著免疫沉淀、限制酶切、LC-MS/MS以及生物測(cè)序等生物技術(shù)的發(fā)展,研究人員在秀麗隱桿線蟲中發(fā)現(xiàn)6mA,其去甲基化酶NMAD-1和潛在的甲基轉(zhuǎn)移酶DAMT-1改變了之前的觀點(diǎn),即秀麗隱桿線蟲缺乏DNA甲基化,提出了6mA作為DNA甲基化標(biāo)記而不是5mC的可能性。nmad-1和damt-1缺失的表型以及腺嘌呤甲基化和組蛋白修飾之間的串?dāng)_表明6mA 的潛在基因激活作用(圖1C)［18］。

通過(guò)敲除果蠅基因組中的去甲基化酶候選物并監(jiān)測(cè)6mA水平,Zhang等發(fā)現(xiàn)果蠅Tet同源物可能是果蠅基因組中6mA去甲基化的原因。鑒定的DNA 6mA去甲基化酶(DMAD)在胚胎發(fā)生和組織穩(wěn)態(tài)過(guò)程中調(diào)節(jié)6mA的水平。進(jìn)一步的測(cè)序分析表明,動(dòng)態(tài)去甲基化與轉(zhuǎn)座子表達(dá)相關(guān),并在發(fā)育中起關(guān)鍵作用(圖 1D)［16］。

圖1

2 m6A的普遍

近年來(lái),隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展,人們已經(jīng)在萊茵衣藻、秀麗隱桿線蟲、果蠅、真菌等真核生物中發(fā)現(xiàn)了DNA-6mA的存在,并且發(fā)現(xiàn)6mA甲基化參與了調(diào)控基因和轉(zhuǎn)座子的表達(dá)。此外,已有大量研究表明RNA-m6A修飾在人類mRNA中廣泛存在,與RNA剪接、mRNA穩(wěn)定性和基因表達(dá)有關(guān)。但有關(guān)DNA-6mA是否在基因調(diào)控和疾病致病機(jī)制中發(fā)揮作用等問(wèn)題仍未得到深入研究。

大多數(shù)真核生物6mA研究都集中在單細(xì)胞原生生物上,包括纖毛蟲四膜蟲、草履蟲以及綠藻。6mA占這些基因組中總腺嘌呤的約0.4%～0.8%,這比哺乳動(dòng)物和植物中5mC的普遍率低幾倍。有趣的是,也有極少數(shù)的報(bào)道表明在最近進(jìn)化的生物體中存在6mA,包括蚊子、植物,甚至哺乳動(dòng)物。

3 m6A的生物學(xué)功能

目前表觀遺傳學(xué)在癌癥的發(fā)展中的關(guān)鍵作用越來(lái)越受到人們的重視。單靠遺傳學(xué)并不能解釋沒(méi)有家族史的個(gè)體的散發(fā)性癌癥和癌癥的發(fā)展。表觀遺傳學(xué)為解釋這種情況下癌癥的發(fā)展提供了一種機(jī)制。表觀遺傳學(xué)特征的改變可以提供對(duì)癌癥的病因和發(fā)生發(fā)展的重要見(jiàn)解。由于幾種表觀遺傳變化發(fā)生在組織病理學(xué)改變之前,它們可以作為癌癥診斷和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的生物標(biāo)志物。根據(jù)表觀基因組信息,已經(jīng)確定了一些可作為診斷工具的表觀遺傳標(biāo)記物；其中一些生物標(biāo)記物也可能有助于預(yù)后以及治療效果的判斷［26］。腺嘌呤甲基化對(duì)DNA結(jié)構(gòu)的直接影響及其在原核生物學(xué)中的作用已被充分表征［27－28］。6mA是否在真核生物中發(fā)揮保守的功能作用還有待觀察［29－30］,但討論其在原核生物中的功能效應(yīng)提出了幾項(xiàng)的潛在功能,需要在真核生物中進(jìn)一步探索。

3.1 轉(zhuǎn)錄 腺嘌呤的甲基化可通過(guò)修飾轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合或改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)影響轉(zhuǎn)錄。在細(xì)菌中,6mA已經(jīng)被證明可以調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄［31－32］,這提高了真核生物中保留類似功能的可能性。有趣的是,已顯示N6腺嘌呤甲基化對(duì)哺乳動(dòng)物和植物中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合具有相反的作用。在腺嘌呤的N6位甲基化的轉(zhuǎn)染DNA降低了哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合親和力［27－28］。 在植物中,鋅指蛋白 AGP1與 DNA 的結(jié)合親和力可以通過(guò)靶序列的N6腺嘌呤甲基化來(lái)增強(qiáng)［33］。此外,在大麥中使用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng),發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄在6mA修飾的報(bào)告質(zhì)粒中增加,而5mC對(duì)轉(zhuǎn)錄效率幾乎沒(méi)有或沒(méi)有影響［33］。

在C.reinhardtii中,6mA在TSS周圍富含超過(guò)14 000個(gè)基因,其中大多數(shù)是活躍轉(zhuǎn)錄的,并且這些6mA位點(diǎn)中的大多數(shù)在幾乎每個(gè)分析的細(xì)胞中都被甲基化［34］。相反,沉默基因在其TSS周圍具有較低的6mA水平。因此,似乎6mA是活性基因的一般標(biāo)記,盡管目前還不清楚它是否在基因表達(dá)的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)中起作用。相比之下,5mC也存在于C.reinhardtii的基因組中,但位于基因體并且與轉(zhuǎn)錄抑制相關(guān)。尚不清楚在線蟲中轉(zhuǎn)錄期間6mA具有什么作用。有趣的是,突變體中6mA水平升高,組蛋白H3賴氨酸4二甲基化(H3K4me2)水平升高,這是與活躍轉(zhuǎn)錄相關(guān)的標(biāo)志［35］。這表明6mA也可以標(biāo)記秀麗隱桿線蟲中的活性基因,就像在C.reinhardtii中一樣。

在D.melanogaster中,6mA被提議用于促進(jìn)轉(zhuǎn)座子表達(dá)。6mA-IP-seq測(cè)定顯示轉(zhuǎn)座子富集6mA,并且假定的脫甲基酶DMAD的喪失導(dǎo)致轉(zhuǎn)座子表達(dá)增加［36］。因此,三個(gè)進(jìn)化上遙遠(yuǎn)的生物中的最新發(fā)現(xiàn)表明6mA與基因表達(dá)升高的相關(guān)性,盡管仍然有待觀察這種機(jī)制的一般性以及6mA是否已進(jìn)化為在不同物種和/或不同背景中具有不同功能。未來(lái)重要的實(shí)驗(yàn)將涉及將DNA甲基轉(zhuǎn)移酶或去甲基化酶引導(dǎo)至特定基因座并分別檢查添加或去除6mA對(duì)轉(zhuǎn)錄的影響［37］。

3.2 DNA甲基化和核小體定位 嗜熱鏈球菌的先前研究表明,核小體DNA中的6mA水平低于接頭DNA［38］中的6mA水平。秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)6mA［38］的核小體定位偏倚。然而,秀麗隱桿線蟲研究是在混合組織上進(jìn)行的,特定的基因組模式可能只在更詳細(xì)的組織特異性檢查中出現(xiàn)。另一方面,在萊茵衣藻中,發(fā)現(xiàn)6mA優(yōu)先位于TSS-近端接頭DNA上。這可以通過(guò)有利于接頭DNA的甲基化機(jī)制來(lái)解釋,可能是由于物理上易于接近,或者通過(guò)6mA調(diào)節(jié)核小體定位。有趣的是,某些藻類物種的CG重復(fù)中的甲基化發(fā)生在極端密度下,這不利于核小體組裝,從而決定核小體定位［39］。因此,DNA甲基化可以提供控制單細(xì)胞真核生物中核小體定位的一般機(jī)制。

3.3 表觀遺傳標(biāo)記 在原核生物中,6mA甲基轉(zhuǎn)移酶在特定序列基序的情況下甲基化腺嘌呤［40］,但真核生物6mA似乎不強(qiáng)烈依賴于序列基序識(shí)別。在萊茵衣藻中,6mA發(fā)生在多個(gè)序列中,主要位于ApT二核苷酸,類似于哺乳動(dòng)物中CpG二核苷酸的5mC甲基化［41］。在多個(gè)裂變單元循環(huán)期間,穩(wěn)定地保持6mA水平。單堿基圖譜表明大多數(shù)單個(gè)6mA位點(diǎn)在變異培養(yǎng)條件下忠實(shí)保守,強(qiáng)化了6mA作為可遺傳的表觀遺傳標(biāo)記［34］的推測(cè)。盡管尚未在萊茵衣藻中鑒定出6mA甲基轉(zhuǎn)移酶,但很可能存在從母細(xì)胞到子細(xì)胞繼承6mA特征的機(jī)制。在秀麗隱桿線蟲中,H3K4me2去甲基化酶spr-5的缺失導(dǎo)致跨代的生育力逐漸喪失［42］。這種生育缺陷與H3K4me2的逐漸積累和抑制標(biāo)記H3K9me365［43］的水平下降同時(shí)發(fā)生。在spr-5突變體蠕蟲中,6mA也會(huì)在幾代人中增加；6mA去甲基化酶nmad-1的缺失加速,而潛在的6mA甲基轉(zhuǎn)移酶damt-1的缺失抑制了spr-5突變體蠕蟲的進(jìn)行性生育缺陷。此外,刪除damt-1抑制了H3K4me2的積累,表明N6-腺嘌呤甲基化和H3K4二甲基化可能是共調(diào)節(jié)的并相互增強(qiáng)［44］。雖然6mA或H3K4me2本身是否可以跨代傳輸表觀遺傳信息仍有待確定,但當(dāng)表觀遺傳信息被不正確地遺傳時(shí),這些修飾會(huì)累積。這些發(fā)現(xiàn)提高了6mA可能作為表觀遺傳標(biāo)記的可能性,其在真核生物中攜帶可遺傳的表觀遺傳信息。

4 展望

在幾十年前的真核基因組中發(fā)現(xiàn)了5mC和6mA都是如此［45］。由于其在哺乳動(dòng)物和植物中的豐富性,研究集中于表征5mC已經(jīng)揭示了5mC的多種功能,而6mA的研究在真核生物中非常有限。眾所周知,5mC可以自發(fā)脫氨基,導(dǎo)致 C-to-T突變［46］；因此,由于甲基化胞嘧啶的脫氨作用,具有5mC的生物體往往會(huì)失去CpG二核苷酸［47］。相反,6mA不傾向于自發(fā)突變,這顯然可能有利于基因組穩(wěn)定性。

最近顯示真核mRNA中的腺嘌呤甲基化對(duì)基因表達(dá)具有深遠(yuǎn)的影響［48］。6mA DNA在塑造基因表達(dá)中的潛在作用仍然很大程度上未知。RNA N6-甲基腺嘌呤的甲基可以使Watson-Crick堿基配對(duì)不穩(wěn)定～1.0 kcal/mol［49－50］,這顯示出誘導(dǎo)“m2A-轉(zhuǎn)換”機(jī)制,其改變RNA結(jié)構(gòu)并因此通過(guò)蛋白質(zhì)結(jié)合［51］。DNA中的相同特性可能影響轉(zhuǎn)錄,復(fù)制和其他需要鏈分離或DNA彎曲的過(guò)程。此外,甲基可以促進(jìn)或抑制DNA結(jié)合蛋白的識(shí)別和結(jié)合,以調(diào)節(jié)基因表達(dá)。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,FTO催化的RNA N6-甲基腺嘌呤的去甲基化產(chǎn)生兩種新發(fā)現(xiàn)的中間體,N6-羥甲基腺苷(hm6A)和N6-甲酰腺苷(f6A),在非編碼RNA和mRNA［52］中。由于hm6A和f6A是非常穩(wěn)定的修飾,它們可能不僅僅是中間體,而且具有調(diào)節(jié)功能。還有待觀察是否在DNA 6mA的氧化去甲基化反應(yīng)期間產(chǎn)生類似的修飾,并且如果它們存在,是否它們具有任何生物學(xué)作用。這些修飾可以進(jìn)一步使DNA雙鏈體失穩(wěn)或產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。

值得注意的是,秀麗隱桿線蟲和黑腹果蠅在其基因組DNA中幾乎沒(méi)有或沒(méi)有5mC,類似于其他一些含 6mA 的生物,如 P.aurelia［51］和 T.thermophila［52］。然而,萊茵哈迪在其基因組中含有6mA和5mC,但5mC的相對(duì)總體低水平加上其在外顯子上的不尋常富集表明與最近進(jìn)化的植物和動(dòng)物相比,5mC具有不同的功能,其中它主要是標(biāo)記。6mA和5mC豐度和功能的相對(duì)變化可能具有不同的進(jìn)化后果。正如最近的研究［52］所揭示的,N6-腺嘌呤甲基化可能是影響某些真核生物中基因表達(dá)的主要DNA甲基化機(jī)制。在其他系統(tǒng)中,它可能在功能上更顯著的5mC DNA甲基化中起補(bǔ)充作用。不同物種中6mA-甲基轉(zhuǎn)移酶同源物的存在提高了6mA可能存在于更多生物體中的可能性,包括哺乳動(dòng)物。6mA的相對(duì)生物學(xué)重要性是否隨著其在最近進(jìn)化的生物中的較低豐度而下降仍有待觀察。我們推測(cè)6mA可能在這些物種中進(jìn)化出更為特殊的功能。隨著新的,靈敏的檢測(cè)技術(shù)的出現(xiàn),目前的研究聚焦于詳細(xì)探究這種DNA修飾在整個(gè)生命樹中的功能和精確的基因組分布。