苦蕎黃酮的提取工藝及測(cè)定方法研究進(jìn)展*

蘇學(xué)軍，梅 穎，趙 靜

（泰州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

苦蕎又名韃靼蕎麥，是一種對(duì)惡劣生存環(huán)境具有較強(qiáng)適應(yīng)能力的藥食同源作物[1]，在我國(guó)西南、華北地區(qū)廣為栽培與種植，具有卓越的營(yíng)養(yǎng)及保健功效。苦蕎蛋白生物價(jià)高、人體必需氨基酸種類(lèi)齊全，其膳食纖維含量豐富，所含脂肪酸主要為不飽和的油酸和亞油酸，并含多種維生素和礦物元素[2,3]，更為重要的是苦蕎中含有與人體健康緊密相連的多酚、多糖、活性肽等多種生物活性成分。其中，多酚中的黃酮類(lèi)化合物是苦蕎中含量最多、也是最重要的活性成分，它包括蘆丁、槲皮素、山奈酚和花青素等[1]，遍布于苦蕎的花、莖、葉、籽粒等器官中?？嗍w黃酮能夠降血糖、降血脂、抗缺血、清除體內(nèi)自由基、抑制癌細(xì)胞增殖、改善記憶力，藥用功效顯著[4]。本文綜述了苦蕎黃酮的提取工藝及含量測(cè)定方法，以期為進(jìn)一步推動(dòng)苦蕎資源的綜合利用，提供科學(xué)依據(jù)。

1 提取方法

1.1 溶劑浸提法

黃酮類(lèi)化合物因結(jié)構(gòu)和存在狀態(tài)不同，其溶解度也存在較大差異。水、甲醇、乙醇是傳統(tǒng)的黃酮提取溶劑，提取時(shí)一般根據(jù)目標(biāo)物的極性大小，常選擇一定濃度的醇-水溶液浸提。按操作方式可分為熱回流提取、索氏抽提、熱水浸提等。米智等[5]以濃度為80%的乙醇溶液為提取劑，采用索氏抽提法提取苦蕎黃酮，經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后，發(fā)現(xiàn)在最佳工藝條件下需提取3 次，回流1.5h，黃酮才有較高得率。扶慶權(quán)[6]的研究表明，加熱回流條件下，苦蕎黃酮最優(yōu)提取工藝條件為：使用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，在80℃下連續(xù)回流1h，此時(shí)苦蕎總黃酮提取率可達(dá)7.85%。這些研究表明，采用溶劑浸提法提取，設(shè)備簡(jiǎn)單，操作成本低，但存在操作費(fèi)時(shí)，能耗高，溶劑用量大且回收難等缺點(diǎn)。

1.2 超聲波輔助提取法

苦蕎黃酮的提取過(guò)程是一個(gè)相際間的傳質(zhì)過(guò)程，即黃酮在濃度差的作用下由苦蕎組織內(nèi)部向提取劑進(jìn)行滲透擴(kuò)散。超聲波產(chǎn)生的強(qiáng)烈的空化效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)與活化效應(yīng)[7]，極易破壞植物的細(xì)胞壁，加速細(xì)胞內(nèi)黃酮的釋放。同時(shí)，超聲場(chǎng)引起的攪拌、擾動(dòng)、湍動(dòng)和旋渦運(yùn)動(dòng)，使傳質(zhì)阻力減少，提取劑的穿透力增強(qiáng)，這有助于苦蕎黃酮的高效率提取。王斯慧等[8]采用超聲波輔助乙醇提取苦蕎麩皮中的總黃酮，研究表明，與傳統(tǒng)有機(jī)溶劑提取工藝相比，超聲波提取可降低提取溫度，縮短提取時(shí)間，且得到的黃酮化合物的純度及二次提取率均較高。王麗娟等[9]在提取黑苦蕎中黃酮類(lèi)化合物時(shí)，利用單因素及正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了超聲提取工藝，得優(yōu)選后的工藝條件為：在超聲功率400W 條件下，體積濃度為80%的乙醇按料液比1∶15（g∶mL）在60 ℃下浸泡提取，黃酮提取率為4.58%。上述試驗(yàn)表明，超聲波輔助提取具有操作易、效率高、產(chǎn)物品質(zhì)高、提取成本低、生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，但在超聲場(chǎng)下進(jìn)行規(guī)模提取尚有困難。

1.3 微波輔助提取法

微波的輔助作用可歸因于其穿透溶劑后能直接深入細(xì)胞內(nèi)部，產(chǎn)生的微波能可為細(xì)胞吸收并快速轉(zhuǎn)換為熱能，使細(xì)胞內(nèi)部溫度瞬間升高，致壓力激增，當(dāng)細(xì)胞壁無(wú)法承受高壓時(shí)便發(fā)生破裂，細(xì)胞內(nèi)部目標(biāo)組分得以釋放，并迅速傳遞至周?chē)軇┒芙狻Ｎ⒉óa(chǎn)生的熱效應(yīng)，可提高擴(kuò)散系數(shù)，并使固液界面間的有效層流膜層變薄，增強(qiáng)了傳質(zhì)的推動(dòng)力，提高了黃酮的得率。李富蘭等[10]以提取率為目標(biāo)，研究了苦蕎茶中黃酮的提取工藝，得出苦蕎茶粉末按1∶20（g∶mL）料液比加入濃度為70%的乙醇溶液，微波功率300W，提取時(shí)間3.0min，該最佳組合條件下黃酮的提取率可達(dá)4.13%。梁虓等[11]將微波提取技術(shù)與傳統(tǒng)回流提取法相結(jié)合，對(duì)苦蕎籽樣品先進(jìn)行微波預(yù)處理，然后于80℃下水浴回流提取，響應(yīng)曲面法優(yōu)化出最佳提取工藝條件，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)表明，黃酮得率為5.02%，與預(yù)測(cè)模型符合度較好。相比于其他提取方法，微波法具有選擇性高，可節(jié)省溶劑，提取時(shí)間短，安全環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)；不足之處是提取過(guò)程溫控不易操作，會(huì)產(chǎn)生局部過(guò)熱現(xiàn)象，部分黃酮可能會(huì)分解失活，影響了產(chǎn)品品質(zhì)及最終得率。

1.4 超臨界萃取法

超臨界萃取法是利用某些萃取劑在超臨界區(qū)所表現(xiàn)出的特殊的溶解性能來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物的萃取，并通過(guò)改變溫度和壓力讓萃取劑和目標(biāo)物分離的一種現(xiàn)代萃取技術(shù)。郭月英[12]以蕎麥殼為原料，研究了超臨界CO2萃取苦蕎黃酮工藝，得出最優(yōu)工藝條件為：選擇乙醇為夾帶劑，控制萃取壓力25MPa，固液比為1∶10，35℃下萃取4h。譚光迅[13]的研究表明，壓力和溫度是影響超臨界萃取的主要因素，萃取前若能將萃取釜保壓一段時(shí)間，可以使苦蕎黃酮的提取率提高近33.33%。超臨界萃取可在常溫下操作，操作條件易控，無(wú)有機(jī)溶劑殘留，特別適合于非極性化合物的提取，但該法存在設(shè)備投資費(fèi)用較高，日常維護(hù)繁瑣等缺陷。

1.5 超高壓提取法

超高壓提取技術(shù)是指在超高壓釜內(nèi)加壓，使密閉體系壓力升至100～1000MPa 處理植物原料，使細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)發(fā)生破壞，目標(biāo)組分得以更多更快地轉(zhuǎn)移到提取溶劑，進(jìn)而獲得高提取效率的一種新興提取技術(shù)[14]。王居偉等[15]研究了超高壓法提取苦蕎黃酮工藝，采用Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化確定最優(yōu)工藝條件為：壓力388.1MPa，保壓時(shí)間8.09min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為95.31%，液料比為19.82（mL∶g），在此條件下提取的苦蕎黃酮得率為2.185%，而傳統(tǒng)回流提取法只有1.982%。該法提取耗時(shí)短，可在常溫下操作，能很好地保留黃酮的生物活性。

1.6 酶輔助提取法

因目標(biāo)化合物主要存在于植物的細(xì)胞壁內(nèi)，而細(xì)胞壁的致密結(jié)構(gòu)使活性組分難以擴(kuò)散到提取溶劑中，若經(jīng)恰當(dāng)?shù)睦w維素酶、果膠酶處理，則可提高細(xì)胞壁的通透性，增加溶劑的可及性，降低溶出阻力，還能在一定程度上提升產(chǎn)品的品質(zhì)。李會(huì)瑞等[16]研究了纖維素酶提取苦蕎茶中總黃酮工藝，在醇提條件不變的情況下，考察了酶解pH 值、酶用量、酶作用時(shí)間等因素對(duì)提取率的影響，經(jīng)響應(yīng)面分析優(yōu)化確定：酶用量0.6%，在pH 值為5.0、40℃條件下，酶解90min，苦蕎茶中總黃酮提取率為1.497%。與乙醇浸提法相比，酶解法使總黃酮的提取率增加了34%。

1.7 減壓內(nèi)部沸騰法

減壓內(nèi)部沸騰法是目前應(yīng)用于植物活性組分提取的一種較為高效實(shí)用的提取技術(shù)。該法是讓低沸點(diǎn)的有機(jī)溶劑充分滲入植物組織內(nèi)部，然后加入沸點(diǎn)較高的熱溶劑，在一定的真空度下使內(nèi)部有機(jī)溶劑迅速發(fā)生沸騰而汽化，進(jìn)而加快被提組分解吸的一種提取方法。王九峰等[17]的研究表明，采用減壓內(nèi)部沸騰法提取苦蕎籽粒中的總黃酮時(shí)，通過(guò)Plackett-Burman 實(shí)驗(yàn)篩選出對(duì)總黃酮得率有顯著影響的實(shí)驗(yàn)因子為真空度、乙醇濃度、提取時(shí)間和提取溫度，而溶劑用量不是顯著因子。再以響應(yīng)面法優(yōu)化出最佳工藝參數(shù)，發(fā)現(xiàn)黃酮得率最高時(shí)提取溫度較低，為52℃，提取時(shí)間僅需5min。由此可見(jiàn)，內(nèi)部沸騰法在天然活性成分提取方面有著獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，可以減少高溫對(duì)活性組分的破壞，縮短提取時(shí)間、降低溶劑的使用量，且在一定程度上提高了提取效率。

2 測(cè)定方法

2.1 光譜法

光譜法是測(cè)定苦蕎中黃酮類(lèi)化合物應(yīng)用廣泛且重要的分析方法，主要有紫外可見(jiàn)分光光度法、熒光光度法、流動(dòng)注射分光光度法等[18]。其中，分光光度法因操作簡(jiǎn)單、設(shè)備及檢測(cè)投資少、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好而成為目前苦蕎中總黃酮測(cè)定最常用的檢測(cè)方法。該法是利用黃酮類(lèi)化合物能與一些金屬離子發(fā)生絡(luò)合作用，生成穩(wěn)定的有色絡(luò)合物，然后在特定波長(zhǎng)下測(cè)出吸光度，來(lái)實(shí)現(xiàn)定量分析，常使用的絡(luò)合劑為Al（NO3）3和AlCl3。

王銳等[19]采用Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 比色法，對(duì)云南昭通大山包的系列苦蕎產(chǎn)品中的總黃酮含量進(jìn)行測(cè)定。經(jīng)方法學(xué)考察，該法簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果可靠，研究發(fā)現(xiàn)黃苦蕎仁中總黃酮含量較黑苦蕎仁中要高，苦蕎仁經(jīng)炒制加工后黃酮含量會(huì)增高。韓旭等[20]系統(tǒng)比較了Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 和AlCl3-NaAc 兩種方法在對(duì)苦蕎酒中的總黃酮進(jìn)行分析測(cè)定時(shí)的差異，結(jié)果表明，Al（NO3）3-NaNO2-NaOH 法測(cè)定的結(jié)果偏高，分析可能是苦蕎中的一些多酚類(lèi)物質(zhì)，如肉桂酸類(lèi)、原花色素等物質(zhì)在510nm 處參與了顯色。因此，AlCl3-NaAc 法測(cè)定苦蕎黃酮的專(zhuān)屬性高，結(jié)果更為可靠，需要注意是使用AlCl3-NaAc 法應(yīng)在顯色反應(yīng)發(fā)生后30min 內(nèi)進(jìn)行測(cè)定，否則結(jié)果會(huì)發(fā)生偏差。

由于黃酮能與鋁離子在一定條件下形成穩(wěn)定的強(qiáng)熒光絡(luò)合物，近年來(lái)，熒光分光光度法測(cè)定苦蕎中黃酮已引起學(xué)者們的關(guān)注。李小梅等[21]建立了一種流動(dòng)注射液滴熒光增敏法測(cè)定苦蕎中的蘆丁含量測(cè)定方法。樣品經(jīng)超聲振蕩萃取后，含蘆丁的上清液中加入適量0.1mol·L-1的Al3+，生成了Al3+-蘆丁絡(luò)合物，再選擇激發(fā)波長(zhǎng)239nm、發(fā)射波長(zhǎng)507nm 測(cè)定熒光強(qiáng)度，該法的檢出限較低，為0.02mg·L-1，回收率為86.0%～104%，RSD 為3.1%～6.1%。實(shí)際檢測(cè)時(shí)要注意絡(luò)合物的熒光強(qiáng)度會(huì)受共存的金屬離子Cr3+、Hg2+、Fe3+的干擾。

2.2 高效液相色譜法

高效液相色譜法（HPLC）分析黃酮類(lèi)化合物具有靈敏度高、進(jìn)樣量少、可批量測(cè)定等優(yōu)點(diǎn)，能滿(mǎn)足苦蕎中多種黃酮類(lèi)組分的同時(shí)測(cè)定。對(duì)苦蕎黃酮進(jìn)行定性定量分析時(shí)，常與紫外、熒光、二極管陣列檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，可以快速、準(zhǔn)確實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)組分的檢測(cè)，適用范圍較廣。

張繼斌等[22]采用HPLC 法測(cè)定四川、云南、貴州、陜西不同產(chǎn)地的苦蕎麥中黃酮類(lèi)成分，先以熱水浴回流提取樣品中活性組分，再以乙腈-0.1% H3PO4溶液為流動(dòng)相，經(jīng)Sepex C18色譜柱分離，紫外檢測(cè)器在360nm 處測(cè)定4 種黃酮類(lèi)成分的含量。結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的黃酮類(lèi)成分含量存在一定的差異，云南產(chǎn)的苦蕎麥中槲皮素、山奈酚的含量明顯要高于其他地區(qū)，而不同地區(qū)樣品中的蘆丁、山奈酚-3-O-蕓香糖苷的含量相差不明顯。張莉等[23]選用Wondasil C18柱（4.6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇-0.4% H3PO4溶液（60∶40）；測(cè)定波長(zhǎng)為370nm，HPLC 法測(cè)定了苦蕎麥不同部位槲皮素的含量，得出同一品種苦蕎不同植株部位的槲皮素含量為葉>莖>根。鄭瑾等[24]在研究酸水解工藝條件對(duì)苦蕎提取物中槲皮素含量影響時(shí)，采用HPLC 法測(cè)定提取物中蘆丁和槲皮素的含量。測(cè)定方法學(xué)考察表明，蘆丁和槲皮素的線性范圍分別為0.093～291.2μg·mL-1、0.167～259μg·mL-1，精密度和重復(fù)性的RSD 均小于1.24%，方法的穩(wěn)定性較好，并得出在最佳水解工藝條件下，苦蕎醇提物中有64.11%的蘆丁可轉(zhuǎn)化為槲皮素，藥代動(dòng)力學(xué)表明，水解后的苷元槲皮素更易被腸道吸收。

對(duì)于含量較低的黃酮類(lèi)化合物，僅用高效液相色譜法分析往往難以獲得有效分離和準(zhǔn)確定量，將色譜技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用，可對(duì)目標(biāo)組分進(jìn)行有效識(shí)別，并可對(duì)物質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。薛長(zhǎng)暉[25]采用HPLC-UV/ESI-MS 技術(shù)對(duì)來(lái)自山西靈丘的苦蕎粉中的黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行了分離識(shí)別，共分離出5 種黃酮類(lèi)化合物，并首次發(fā)現(xiàn)六取代黃酮和槲皮素-3-雙鼠李糖苷是苦蕎粉的重要組成。李欣等[26]建立了一種超高液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法（UPLCMS-MS）對(duì)苦蕎麥中蘆丁、槲皮素和山奈酚含量進(jìn)行測(cè)定的方法。結(jié)果表明，3 種黃酮組分的線性范圍為0.1～100μg·mL-1，相關(guān)系數(shù)r2大于0.99，高、中、低三水平加標(biāo)回收率均在94%以上，蘆丁的最低檢測(cè)水平為0.01ng·mL-1，其余兩種物質(zhì)為0.1ng·mL-1。此法具有預(yù)處理簡(jiǎn)單，分析耗時(shí)少，靈敏度高，選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)。

2.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法是一種發(fā)展較為迅速的液相分離技術(shù)，具有試劑及進(jìn)樣量少，分離分析時(shí)間短，分辨率高，樣品預(yù)處理方便，能滿(mǎn)足目標(biāo)化合物的快速微量分析要求。目前，報(bào)道的方法中，對(duì)苦蕎中黃酮類(lèi)化合物分離是通過(guò)選擇合適的緩沖溶液和添加劑，讓黃酮組分帶電，在電場(chǎng)中實(shí)現(xiàn)高效分離。侯建霞等[27]建立了一種毛細(xì)管電泳結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)方法，可對(duì)苦蕎麥芽中的表兒茶素、蘆丁、槲皮素3 種黃酮類(lèi)物質(zhì)實(shí)現(xiàn)分離檢測(cè)。在以50mmol·L-1的硼砂-硼酸緩沖液為運(yùn)行液，pH 值為8.5，分離電壓為20kV的條件下，3 種組分能在12min 內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離，加標(biāo)回收率分別為100.6%、99.1%、101.1%。此法檢出限較低，重現(xiàn)性好，有望應(yīng)用于苦蕎芽菜及苦蕎產(chǎn)品中黃酮物質(zhì)的快速分離檢測(cè)。郭芳芳等[28]采用高效毛細(xì)管電泳法對(duì)5 個(gè)不同產(chǎn)地的苦蕎中的黃酮組分進(jìn)行測(cè)定，樣品經(jīng)超聲波輔助醇提法提取后，離心分離，取上清液過(guò)濾分析，在最佳檢測(cè)條件下，苦蕎醇提液中4 種黃酮類(lèi)化合物可在7min 內(nèi)得到分離，方法的檢出限較低，平均回收率為95.5%～104.7%，RSD 小于3.66%。毛細(xì)管電泳法目前應(yīng)用于苦蕎中黃酮物質(zhì)的分析目前報(bào)道較少，未來(lái)有很大的發(fā)展空間。

3 結(jié)語(yǔ)

苦蕎是提取天然活性成分黃酮類(lèi)化合物的優(yōu)質(zhì)植物資源，近年來(lái)不斷有新的提取方法被開(kāi)發(fā)應(yīng)用于苦蕎中黃酮的提取，但這些方法得到的工藝參數(shù)目前尚限于小試規(guī)模，今后應(yīng)加大工業(yè)化提取工藝參數(shù)的研究，規(guī)?；奶崛≡O(shè)備也需同步研發(fā)。由于紫外分光光度法測(cè)定的是苦蕎中的總黃酮的含量，隨著苦蕎中黃酮新類(lèi)型的不斷發(fā)現(xiàn)，對(duì)不同黃酮成分實(shí)行定性定量檢測(cè)，就需進(jìn)一步加強(qiáng)高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、色譜-質(zhì)譜檢測(cè)法及聯(lián)用檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。隨著提取技術(shù)和檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，苦蕎黃酮在新的食品添加劑、保健品及藥品中應(yīng)用將更為廣泛。