新型冠狀病毒病原學(xué)特征與致病機(jī)制研究進(jìn)展

高光俊，穆廷杰，馬娟娟，徐興然，徐杰

1 甘肅省臨夏州人民醫(yī)院，甘肅臨夏731100；2 西南大學(xué)藥學(xué)院；3 蘇州大學(xué)第一附屬醫(yī)院

自2019年12月底以來(lái)，從中國(guó)武漢等地區(qū)發(fā)現(xiàn)了多例“不明原因的病毒性肺炎”病例，此后包括中國(guó)在內(nèi)的多個(gè)國(guó)家出現(xiàn)并呈現(xiàn)出全球爆發(fā)流行的態(tài)勢(shì)，為一種先前尚未發(fā)現(xiàn)的冠狀病毒株系所致的急性呼吸道傳染?。?-2］。此后，世界衛(wèi)生組織（WHO）將其命名為2019 新型冠狀病毒（2019-nCoV），由此感染的肺炎命名為“COVID-19”，國(guó)際病毒分類委員會(huì)將該病毒命名為“SARS-CoV-2”。由于這種新型冠狀病毒高致病能力和傳染特性，我們國(guó)家迅速將其納入法定傳染病乙類，采取甲類傳染病進(jìn)行防控管理。2019-nCoV 所致的突發(fā)疫情給全球公共衛(wèi)生安全帶來(lái)了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)和威脅，引發(fā)了全球的高度關(guān)注。目前尚沒(méi)有特效治療藥物與安全有效性疫苗。系統(tǒng)深入了解2019-nCoV 新型冠狀病毒的相關(guān)病原學(xué)特征與致病機(jī)制對(duì)于COVID-19 防治具有重要意義，近期有關(guān)此方面的研究取得了不少成果，現(xiàn)將2019-nCoV 的病原學(xué)特征及致病機(jī)理等研究進(jìn)展作一綜述。

1 2019-nCoV起源與生物進(jìn)化

早期武漢地區(qū)感染患者病毒基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV 與β 冠狀病毒相匹配，與MERS-CoV和SARS-CoV 的同源性僅為50%和79%，而與蝙蝠分 離 的SARS 樣 冠 狀 病 毒（bat-SL-CoVZC45，MG772933.1）同源性超過(guò)85%，進(jìn)化關(guān)系上2019-nCoV 更接近于蝙蝠來(lái)源的兩種SARS 樣冠狀病毒，其親緣關(guān)系最為密切，提示蝙蝠可能是2019-nCoV宿主［3-4］。同源建模顯示，2019-nCoV與SARS-CoV具有相似受體結(jié)合域，盡管存在部分殘基的變異，但是其感染機(jī)制可能與SARS-CoV 存在相似的發(fā)病機(jī)制［4］。基于高通量的NGS 研究發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV 為SARS 樣冠狀病毒（>87.1%），與SARS 高度同源（同源性79.5%），具有SARS 同源的ORF1ab 位點(diǎn)（同源性94.6%）和非結(jié)構(gòu)性蛋白，與SARS 屬同種，這也是命名為SARS-CoV-2的緣由［5］。2019-nCoV 不同于其他β 冠狀病毒的是具有可供Furin 蛋白酶切的位點(diǎn)和插入“CGGCGG”序列，提示此突變可能和侵染細(xì)胞效率增強(qiáng)有關(guān)，進(jìn)而使其傳播力顯著高于SARS［6］。作為RNA 病毒的2019-nCoV 由于其復(fù)制酶缺少校正功能，在自然界與動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制過(guò)程中發(fā)生重組和變異的概率高，容易引起生物學(xué)結(jié)構(gòu)和特性的變異，甚至誘發(fā)突變株或新毒株的出現(xiàn)，提示要高度重視病毒的變異和進(jìn)化趨勢(shì)?；诨蚪M數(shù)據(jù)闡述病毒在人群傳播中的演化發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV存在149 個(gè)突變位點(diǎn)，且多為近期發(fā)生。依據(jù)第8782位和28144位兩個(gè)高度連鎖突變位點(diǎn)將病毒分為L(zhǎng) 型和S 型，S 型與蝙蝠冠狀病毒更接近，進(jìn)化上也更為原始，L型（毒力傳播能力強(qiáng)）則可能由S型演化而來(lái)。有72 株（約70%）為“L”型，29 株（約28%）為“S”型。在時(shí)空分布上，武漢患者L 型占96.3%，武漢外患者L 型占61.6%，表明病毒爆發(fā)早期以L型為主導(dǎo)，武漢主要感染類型為L(zhǎng)型，隨著病毒的持續(xù)傳播，S 型逐漸上升至38%。表明人為干預(yù)如醫(yī)療和隔離措施加強(qiáng)后，選擇壓力的變化使病毒從L型為主導(dǎo)變?yōu)镾 型主導(dǎo)，L 型負(fù)選擇壓力更大，感染變少；而毒性更低的S型傳播范圍則更廣［7-8］。

2 2019-nCoV的病原學(xué)特征

冠狀病毒是一類屬于網(wǎng)巢病毒目、冠狀病毒科的一類具有囊膜、基因組為線性單股正鏈RNA 的病毒，是自然界廣泛存在的一類病毒。基于種系發(fā)生和基因組學(xué)可將冠狀病毒分為α-冠狀病毒（α-CoV）、β-冠狀病毒（β-CoV）、γ-冠狀病毒（γ-CoV）和δ-冠狀病毒（δ-CoV）等四個(gè)類型。其中，δ-CoV 和γ-CoV 包括IBV、HKU11 能夠感染禽類，部分種類也能感染哺乳類動(dòng)物［9］。α-CoV 和β-CoV 僅感染哺乳類動(dòng)物可引起人類嚴(yán)重呼吸道疾病和動(dòng)物胃腸道疾病，主 要 包 括HCoV-NL63、HCoV-229E、HCoVOC43、HKU1 和SARS-CoV、MERS-CoV 等病毒。前4種通常會(huì)導(dǎo)致免疫正常個(gè)體普通感冒癥狀，而SARS-CoV、MERS-CoV 能引起人類嚴(yán)重呼吸道疾病綜合征?；诜肿舆z傳學(xué)證實(shí)，SARS-CoV、MERSCoV、HCoV-NL63、HCoV-229E 為蝙蝠來(lái)源病毒，HCoV-OC43和HKU1來(lái)源于嚙齒類。而某些馴養(yǎng)動(dòng)物作為中間宿主在病毒從天然宿主轉(zhuǎn)移至人類過(guò)程中具有十分重要的作用［10］。

2.1 2019-nCoV 生物學(xué)特性 2019-nCoV 屬于β 冠狀病毒屬，為第7 種被鑒定出的可引起人類感染的新型冠狀病毒，是引發(fā)全球多地感染性肺炎暴發(fā)流行的病原，為第7 種被鑒定的可引起人類感染的新型冠狀病毒。通過(guò)負(fù)染電鏡對(duì)病毒顆粒進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)2019-nCoV呈球形，表現(xiàn)為多形性，直徑在60～140 nm。病毒顆粒呈現(xiàn)了日冕狀，具有包膜和明顯蛋白刺突結(jié)構(gòu)（9～12 nm）。體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，在感染人呼吸道上皮細(xì)胞96 h 后可出現(xiàn)細(xì)胞病變（CPE），并能夠在電鏡下觀察到病毒顆粒表面的纖毛結(jié)構(gòu)，而感染Huh-7和Vero-E6細(xì)胞后需常規(guī)培養(yǎng)6 d后才出現(xiàn)細(xì)胞病變現(xiàn)象［3］。

2.2 2019-nCoV 基因組學(xué)與毒力因子 冠狀病毒為RNA 病毒，具備典型5’端甲基化“帽”，3’端PolyA“尾”結(jié)構(gòu)，能夠編碼結(jié)構(gòu)蛋白與輔助蛋白。其中，刺突蛋白（S 蛋白）、膜蛋白（M 蛋白）、包膜蛋白（E 蛋白）、核衣殼蛋白（N 蛋白）是冠狀病毒最為重要的4 種結(jié)構(gòu)蛋白［11］。2019-nCoV 屬β 冠狀病毒屬，具有冠狀病毒典型基因組結(jié)構(gòu)，包括6 個(gè)主要ORF 和其他結(jié)構(gòu)基因。主要包含有5′非翻譯區(qū)（UTR）、復(fù)制酶復(fù)合物（orf1ab）、S 基因、E 基因、M 基因、N基因、3′UTR和幾個(gè)未識(shí)別的非結(jié)構(gòu)ORF等基因 結(jié) 構(gòu)［3］。 2019-nCoV 基 因 組（GenBank：MN975262）亦具有典型的冠狀病毒結(jié)構(gòu)，含29 891個(gè)核苷酸，G+C 占比約38%，編碼9 860 個(gè)氨基酸，UTR 和編碼整段多聚蛋白的開(kāi)放閱讀框（ORF），其結(jié)構(gòu)順序依次為5′復(fù)制酶（orf1/ab）—結(jié)構(gòu)蛋白［Spike（S）-Envelope（E）-Membrane（M）-Nucleocap?sid（N）］-3′，但缺乏β 類冠狀病毒所具有的血凝素酯酶基因結(jié)構(gòu)；占基因組全長(zhǎng)1/3 的ORF 含有一個(gè)保守的小向?qū)NA（sgRNA），9 個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列（TRS）（ACGAAC或CUAAC形式）和2個(gè)末端非翻譯區(qū)（UTR），約占基因組全長(zhǎng)2/3 的orf1a/b 編碼多聚蛋白酶（pp1a/pp1ab），由16 個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白（NSP）組成。

S蛋白由兩個(gè)亞基S1與S2組成。S1亞基包含1個(gè)信號(hào)肽、N 端結(jié)構(gòu)域（NTD）和受體結(jié)合域（RBD），而S2 亞基包含融合肽（FP）、七肽重復(fù)序列1 和2、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域，表明S 蛋白R(shí)BD 區(qū)域與人體血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（ACE2）的作用在病毒結(jié)合、吸附中具有十分重要的作用，可作為藥物和疫苗研發(fā)的重要作用靶點(diǎn)。E 蛋白包含疏水結(jié)構(gòu)域和跨膜α 螺旋結(jié)構(gòu)域，是病毒包膜組成部分，并參與病毒顆粒組裝和釋放。M 蛋白含有3 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，是病毒包膜的組成部分，參與病毒顆粒的組裝和釋放［12-14］。N蛋白序列保守程度高，在病毒復(fù)制過(guò)程中發(fā)揮重要作用。N 蛋白與病毒RNA 結(jié)合形成復(fù)合體，隨后在M 蛋白和E 蛋白的共同作用下，包裹后進(jìn)入病毒衣殼中［15-16］。

熊子軍等對(duì)2019-nCoV 與SARS 基因組數(shù)據(jù)全基因組序列信息對(duì)2019-nCoV 基因組結(jié)構(gòu)、功能與致病亞型進(jìn)行相關(guān)的分析發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2 有11個(gè)功能基因，其中3個(gè)同源于SARS，7個(gè)同源于蝙蝠冠狀病毒，1個(gè)功能未知。2019-nCoV 基因組存在毒株差異，表現(xiàn)為蛋白編碼基因區(qū)域含17 個(gè)SNPS，可能引起致病基因變異。非蛋白編碼區(qū)域含5 個(gè)SNP。ORF3a 和ORF8 基因的蛋白序列存在變異。通過(guò)對(duì)全基因組序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)2 個(gè)毒株的2 個(gè)序列存在缺失，即起始端的15 個(gè)堿基和序列末端的11個(gè)堿基缺失［17］。

3 2019-nCoV的致病機(jī)制

2019-nCoV 主要侵犯肺泡上皮細(xì)胞，潛伏期為1～14 d，最長(zhǎng)達(dá)24 d，2019-nCoV 感染患者的臨床癥狀與SARS-CoV 和MERS-CoV 感染相似，以發(fā)熱、干咳為主。多數(shù)呈輕癥狀態(tài)，表現(xiàn)為低熱、輕微乏力，但無(wú)肺炎癥狀。重癥多集中在老年或有嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病患者，多在感染后1周出現(xiàn)呼吸困難，然后發(fā)展為急性呼吸窘迫綜合征、膿毒血癥等。 影像學(xué)CT 顯示肺部呈多發(fā)性磨玻璃影和浸潤(rùn)影，甚至肺實(shí)變［1］。

3.1 2019-nCoV S 蛋白與ACE2 蛋白結(jié)合 S 蛋白與ACE2 蛋白的結(jié)合是2019-nCoV 感染人體細(xì)胞的關(guān)鍵。2019-nCoV S 蛋白受體結(jié)合域與SARS-CoVs（73.8%～74.9%）、bat-CoV（75.9%～76.9%）氨基酸序列和蛋白結(jié)構(gòu)序列上存在高度同源性、關(guān)鍵氨基酸高度保守性及被感染細(xì)胞類型的一致性，表明2019-nCoV 存在著相似的結(jié)合受體和入侵過(guò)程［4，18］。研究證實(shí)，ACE2 受體是2019-nCoV 進(jìn)入細(xì)胞的入口，蛋白酶處理可以增強(qiáng)病毒的侵染水平［19］。細(xì)胞絲氨酸蛋白酶TMPRSS2 和組織蛋白酶CatB/L 能夠協(xié)同激活SARS-2-S 入侵細(xì)胞，而蛋白酶TMPRSS2的作用更為關(guān)鍵，同時(shí)發(fā)現(xiàn)絲氨酸蛋白酶抑制劑卡莫 司 他（Camostat）能 夠 阻 斷2019-nCoV 感 染［18］。2019-nCoV S 蛋白以三聚體形態(tài)存在，S1 亞基受體結(jié)合域（RBD）（21 kD）則以鉸鏈?zhǔn)綐?gòu)象變化來(lái)隱藏或暴露受體結(jié)合的關(guān)鍵位點(diǎn)。結(jié)構(gòu)生物學(xué)證據(jù)顯示，2019-nCoV S 蛋白結(jié)合ACE2 的親和力要遠(yuǎn)高于SARS-CoV（>10～20 倍），這可能是其高傳染性的原因。2019-nCoV 與蝙蝠冠狀病毒RaTG13 S 蛋白序列同源性高達(dá)96%，但最顯著變化是具有S1/S2蛋白酶切割位點(diǎn)“RRAR”氨基酸序列，此現(xiàn)象常見(jiàn)于流感病毒血凝素的變異［20］。2019-nCoV 與SARS 高度同源且具有相似入侵機(jī)制，提示樹(shù)突狀細(xì)胞（DCSIGN 等）和肝竇、淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞（L-SIGN）等SARS受體也可能與2019-nCoV 的感染相關(guān)［21］。ACE2 是SARS-CoV 表面受體，可直接作用于SARS-CoV 表面S 蛋白。ACE2 結(jié)構(gòu)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，ACE2 由于肽酶結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)移而具有開(kāi)放和關(guān)閉兩種構(gòu)象變化，但兩種構(gòu)象均存在于冠狀病毒相互識(shí)別界面，2019-nCoV 的RBD 會(huì)被ACE2 的胞外肽酶結(jié)構(gòu)域（PD）通過(guò)極性殘基所識(shí)別，三聚體S蛋白與二聚體ACE2相容性結(jié)合就表明兩者間可能存在聚類作用或以胞膜內(nèi)陷的內(nèi)吞機(jī)制，為SARS-CoV-2感染機(jī)制和治療提供新線索和思路［22-24］。與SARS-CoV 相似的是ACE2也是SARS-CoV-2 RBD 的結(jié)合受體，RBD 序列和結(jié)構(gòu)的高度保守特性是結(jié)合ACE2 的關(guān)鍵［25］。2019-nCoV 均能進(jìn)入表達(dá)ACE2 的多種細(xì)胞，但無(wú)法有效進(jìn)入ACE2 缺失的細(xì)胞或其他受體的細(xì)胞，表明ACE2 可能是2019-nCoV 的潛在受體，且2019-nCoV并不能利用N-氨基肽酶、丙氨酸肽酶等其他冠狀病毒的病毒受體［2］。肺部Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞（AT2）除表達(dá)大量ACE2 受體外，還參與大量與病毒復(fù)制相關(guān)的其他基因，促進(jìn)病毒的感染，提示基于ACE 受體或相關(guān)基因的干預(yù)策略可能是阻斷病毒感染、進(jìn)行藥物開(kāi)發(fā)和治療的有效途徑［25］。

3.2 2019-nCoV 感染引發(fā)的炎癥因子風(fēng)暴 近期有文獻(xiàn)報(bào)道2019-nCoV 感染患者前期病癥較輕，但后期又突然加重，甚至出現(xiàn)死亡，疾病的突發(fā)轉(zhuǎn)變與炎癥風(fēng)暴相關(guān)［1］?！把装Y風(fēng)暴”即“炎癥因子風(fēng)暴”，指患者體內(nèi)各類細(xì)胞因子如INF、IL、CK、CSF、TNF 等炎癥因子不受調(diào)控的過(guò)度釋放，從而導(dǎo)致機(jī)體嚴(yán)重的細(xì)胞因子風(fēng)暴和細(xì)胞因子釋放綜合征（CRS）。目前，炎癥風(fēng)暴產(chǎn)生的成因還不明確，一般認(rèn)為是免疫系統(tǒng)對(duì)新的、高致病的病原體產(chǎn)生的過(guò)激反應(yīng)，即免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡、負(fù)反饋的缺失和正反饋的不斷自我放大，使得多種細(xì)胞因子異常升高，最終導(dǎo)致炎癥因子風(fēng)暴。研究發(fā)現(xiàn)，2019-nCoV 感染致重癥肺炎炎癥風(fēng)暴及引起的免疫損傷在COVID-19 的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了作用，組織病理學(xué)以滲出、出血、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡上皮細(xì)胞損傷及纖維化為主要特征，大量免疫細(xì)胞和組織液聚集在肺部，會(huì)阻塞肺泡與毛細(xì)血管間的氣體交換，大量滲出液聚集使氣道阻塞，導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）。既往研究發(fā)現(xiàn)，大量細(xì)胞因子的快速產(chǎn)生能夠誘發(fā)免疫病理?yè)p傷，是引起ARDS和多器官衰竭的重要原因。AR?DS 的發(fā)病原因是由于細(xì)胞因子風(fēng)暴造成的肺毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞以及肺泡上皮細(xì)胞的彌漫性損傷。

綜上所述，2019-nCoV 為SARS 樣冠狀病毒，具有可供Furin 蛋白酶切的位點(diǎn)和插入“CGGCGG”序列。2019-nCoV 特有的生物學(xué)特性、基因變異性、毒力因子等可能是導(dǎo)致其在傳染性、變異性和適應(yīng)性方面更強(qiáng)的主要原因。S 蛋白與ACE2 蛋白的結(jié)合侵犯肺泡上皮細(xì)胞是入侵的主要機(jī)制，加之炎癥因子風(fēng)暴加劇了疾病的進(jìn)展。當(dāng)前2019-nCoV 引發(fā)的肺炎疫情仍在全球肆虐，已有部分疫苗開(kāi)始對(duì)人群接種，這對(duì)保護(hù)易感人群至關(guān)重要。而病毒溯源、病毒傳播、基因變異、宿主免疫等有待進(jìn)一步揭示，對(duì)SARS-CoV-2 病原學(xué)及其致病機(jī)理的深層次的研究是揭示疾病發(fā)生、傳播、流行的重要途徑，是更加有效地進(jìn)行針對(duì)性防治的基礎(chǔ)。