血管新生與骨形成耦聯(lián)、骨骼疾病發(fā)生及治療中H型血管的作用機(jī)制研究進(jìn)展

李高志，石菲，張舒，曹新生

空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系·航空航天醫(yī)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西西安710032

骨形成對(duì)于維持骨骼系統(tǒng)的完整性和功能性至關(guān)重要，骨形成障礙可導(dǎo)致多種骨骼疾病的發(fā)生，如骨質(zhì)疏松癥、骨不連等［1］。血管新生包括血管發(fā)生和血管形成兩個(gè)過(guò)程。血管發(fā)生是指內(nèi)皮祖細(xì)胞經(jīng)募集、增殖、分化和遷移，形成功能尚不成熟的初級(jí)血管叢；血管形成是指從已存在的血管中生出新的血管［2］。在骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育及修復(fù)重建過(guò)程中，血管新生與骨形成有著緊密的時(shí)空聯(lián)系。在時(shí)間上，血管新生早于骨形成，并且血管入侵是骨形成及礦化的前提條件；在空間上，新生血管為骨組織提供必需的氧氣、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和內(nèi)分泌激素，而且能夠清除代謝廢物，同時(shí)作為骨與鄰近組織聯(lián)系的橋梁。血管新生與骨形成的這種緊密聯(lián)系被稱為“血管—成骨耦聯(lián)”［3］。

近年，隨著骨骼系統(tǒng)內(nèi)H 型血管的發(fā)現(xiàn)，“血管—成骨耦聯(lián)”的內(nèi)在分子機(jī)制得到進(jìn)一步拓展。研究表明，H 型血管是一種與骨形成密切相關(guān)的毛細(xì)血管亞型，H 型血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠與多種骨骼細(xì)胞相互作用，從而實(shí)現(xiàn)血管新生與骨形成的耦聯(lián)［4-6］。此外，H 型血管廣泛參與骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎等多種骨骼疾病的發(fā)生發(fā)展，并有望作為上述疾病的治療靶點(diǎn)［7-8］。現(xiàn)將近年血管新生與骨形成耦聯(lián)中及骨骼疾病發(fā)生及治療中H型血管作用機(jī)制方面的文獻(xiàn)進(jìn)行綜述。

1 骨內(nèi)H型血管的特征

近年，RAMASAMY 等［5-6］根據(jù)內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)、表面標(biāo)記物和功能特征將骨內(nèi)微血管分為兩種亞型：H型和L型。其中，H型血管（即CD31hiEmcnhi）高表達(dá)血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1（PECAM-1/CD31）和內(nèi)皮黏蛋白（Emcn），主要位于干骺端和骨內(nèi)膜，呈柱狀排列，并在生長(zhǎng)板附近通過(guò)血管環(huán)或血管弓相互連接。L 型血管（即CD31loEmcnlo）表達(dá)低水平的CD31和Emcn，主要分布于骨干的骨髓腔，呈高度分支的毛細(xì)血管網(wǎng)。在干骺端與骨干交界處，L 型與H 型血管相互連接，構(gòu)成一個(gè)連續(xù)的血管床。此外，與L 型血管相比，H 型血管周?chē)植贾罅康某晒亲V系細(xì)胞。大部分Runt 相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 陽(yáng)性（Runx2+）的早期骨祖細(xì)胞、Osterix+骨祖細(xì)胞和I 型膠原陽(yáng)性（Col1ɑ+）的成骨細(xì)胞與H 型血管直接相鄰，血小板源性生長(zhǎng)因子受體陽(yáng)性（PDGFRβ+）的間充質(zhì)細(xì)胞也選擇性分布于H型血管周?chē)＿M(jìn)一步的研究表明，H 型血管能夠?yàn)楣谴x提供適宜的微環(huán)境，并通過(guò)旁分泌途徑調(diào)節(jié)血管周?chē)趋兰?xì)胞的活性，使血管新生與骨形成相互耦聯(lián)。

2 在血管新生與骨形成耦聯(lián)中H型血管的作用機(jī)制

H 型血管新生與骨形成緊密耦聯(lián)是通過(guò)H 型血管內(nèi)皮細(xì)胞與多種骨骼細(xì)胞之間的相互調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。其中，破骨前體細(xì)胞、成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞能夠分泌細(xì)胞因子促進(jìn)H 型血管形成［4，9-10］；同時(shí)，H 型血管內(nèi)皮細(xì)胞也可以分泌細(xì)胞因子促進(jìn)骨形成［5-6］。這種相互調(diào)控依賴多種信號(hào)分子及通路的參與，如缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、血小板源性生長(zhǎng)因子-BB（PDGF-BB）、SLIT3和γ-干擾素誘導(dǎo)型單核細(xì)胞因子（CXCL9）等。

2.1 通過(guò)HIF-1 信號(hào)通路參與血管新生與骨形成耦聯(lián) HIF-1是一種異源二聚體轉(zhuǎn)錄因子，由ɑ亞基和β 亞基組成，其中HIF-1ɑ 亞基是功能性亞基，決定HIF-1 的功能活性，并受到細(xì)胞內(nèi)氧濃度的調(diào)節(jié)。在氧濃度>5%的富氧組織內(nèi)，脯氨酰羥化酶（PHDs）和抑癌蛋白pVHL可以介導(dǎo)HIF-1ɑ蛋白通過(guò)泛素—蛋白酶體途徑降解。在低氧狀態(tài)下，HIF-1ɑ 不能被順利降解，從而與HIF-1β結(jié)合形成HIF-1，后者作為轉(zhuǎn)錄因子，能夠與基因序列中的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，反式激活下游靶基因，如血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等，調(diào)節(jié)血管新生、組織修復(fù)等過(guò)程［11］。

近年研究表明，低氧信號(hào)通路在血管新生和骨形成的耦聯(lián)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用。KUSUMBE等［6］發(fā)現(xiàn)，在內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除HIF-1ɑ 的轉(zhuǎn)基因小鼠中，可以觀察到脛骨干骺端和骨內(nèi)膜部位的H型血管顯著減少，同時(shí)伴隨著骨量減少和骨祖細(xì)胞數(shù)目降低。相反，在內(nèi)皮細(xì)胞中特異性敲除Vhl 基因后，觀察到H 型血管增多和新骨形成增強(qiáng)，并且Runx2+和Osterix+的骨祖細(xì)胞增多。此外，在給老齡小鼠補(bǔ)充外源性去鐵胺甲磺酸（DFM）（PHD 抑制劑，能夠增強(qiáng)HIF-1ɑ 活性）之后，小鼠表現(xiàn)為H 型血管增多和骨量增加［6］，而鐵蓄積狀態(tài)則會(huì)導(dǎo)致骨密度下降，同時(shí)骨內(nèi)H 型血管的形成也受到顯著抑制［12］。這些結(jié)果提示低氧信號(hào)通路在“血管—成骨耦聯(lián)”過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.2 通過(guò)Notch 信號(hào)通路參與血管新生與骨形成耦聯(lián) Notch信號(hào)通路是一條在進(jìn)化中高度保守的、依賴細(xì)胞間直接接觸的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。目前，在哺乳動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)4種Notch受體（Notch1、2、3、4）和5種Notch 配體（Dll1、3、4 以及Jagged1、2）。當(dāng)Notch 受體與配體結(jié)合后，其胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域脫落并進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，調(diào)控血管新生等過(guò)程［13］。

在大部分組織中，如小鼠腎臟、胚胎和腫瘤組織，Notch信號(hào)通路能夠通過(guò)限制內(nèi)皮細(xì)胞出芽和增殖，負(fù)性調(diào)節(jié)血管新生［14］。然而，最近研究發(fā)現(xiàn)，在骨骼系統(tǒng)中，血管內(nèi)皮細(xì)胞中的Notch 信號(hào)通路能夠正性調(diào)節(jié)血管新生與骨形成［5，15-16］。在內(nèi)皮細(xì)胞特異性敲除Notch 信號(hào)的轉(zhuǎn)基因小鼠中，可以觀察到脛骨組織內(nèi)H型血管含量降低，柱狀結(jié)構(gòu)紊亂，血管內(nèi)皮細(xì)胞的絲狀偽足連續(xù)性中斷；小鼠的股骨長(zhǎng)度縮短，干骺端結(jié)構(gòu)破壞，松質(zhì)骨體積減少；轉(zhuǎn)基因小鼠的生長(zhǎng)板區(qū)域發(fā)生畸形，軟骨細(xì)胞區(qū)擴(kuò)大，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞分化的SOX9 表達(dá)降低，并且肥大軟骨細(xì)胞產(chǎn)生的VEGF 顯著減少。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，上述這些骨骼缺陷與內(nèi)皮細(xì)胞分泌的Noggin 蛋白減少有關(guān)。在Notch 信號(hào)失活的轉(zhuǎn)基因小鼠中補(bǔ)充外源性重組Noggin 蛋白，能夠恢復(fù)干骺端的組織結(jié)構(gòu)和骨祖細(xì)胞的數(shù)目，促進(jìn)骨形成，同時(shí)恢復(fù)血管的完整性［5］。在此基礎(chǔ)上，F(xiàn)U 等［15］發(fā)現(xiàn)，鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZEB1 在H 型血管中高度表達(dá)，其與CBP/p300 結(jié)合形成復(fù)合物，能夠提高Dll4 和Notch1 基因啟動(dòng)子區(qū)的組蛋白乙酰化水平，從而激活Notch 信號(hào)通路，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，如Noggin、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGFβs）、骨形成蛋白（BMPs）等，進(jìn)而促進(jìn)骨形成。還有研究表明，非編碼RNA 可通過(guò)調(diào)控Notch 信號(hào)通路影響骨骼的血管新生與骨形成。YANG等［17］發(fā)現(xiàn)，miR-497～195在H型內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)，并分別激活內(nèi)皮細(xì)胞中Notch 和HIF-1 信號(hào)通路，正性調(diào)節(jié)血管新生與骨形成。上述這些結(jié)果提示，Notch信號(hào)通路及其上游信號(hào)分子在調(diào)控H型血管新生與骨形成的耦聯(lián)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

2.3 通過(guò)PDGF-BB 參與血管新生與骨形成耦聯(lián)PDGF-BB 屬于PDGF 家族，其能夠與內(nèi)皮祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞表面的PDGFRβ結(jié)合，啟動(dòng)PI3K-AKT信號(hào)通路，調(diào)節(jié)其增殖、分化和遷移過(guò)程，從而調(diào)控血管新生與骨形成［18-19］。最近，XIE 等［9］發(fā)現(xiàn)，在骨形成和重建過(guò)程中，破骨前體細(xì)胞分泌的PDGF-BB能夠誘導(dǎo)H 型血管形成，進(jìn)而促進(jìn)骨形成。GAO等［20］發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在骨形成過(guò)程中可以分化成為抗酒石酸磷酸酶陽(yáng)性的單核細(xì)胞，并分泌PDGFBB，誘導(dǎo)骨膜來(lái)源細(xì)胞（PDC）表達(dá)周蛋白，同時(shí)募集PDC 至骨膜表面，促進(jìn)皮質(zhì)骨形成和H 型血管新生。PENG 等［21］研究表明，糖皮質(zhì)激素能夠抑制破骨前體細(xì)胞中NF-κB 信號(hào)通路，減少PDGF-BB 表達(dá)與分泌，導(dǎo)致H 型血管減少，造成骨形成速率降低、骨量減少。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)，荷葉堿通過(guò)抑制MAPK 和NF-κB 信號(hào)通路，阻斷單核的破骨前體細(xì)胞融合為多核的成熟破骨細(xì)胞，從而維持破骨前體細(xì)胞的數(shù)目，并促進(jìn)其分泌PDGF-BB，最終增強(qiáng)H型血管新生與骨形成［22］。這些結(jié)果表明，破骨前體細(xì)胞分泌的PDGF-BB 是調(diào)控H 型血管新生與骨形成的重要信號(hào)分子。

2.4 通過(guò)SLIT3 參與血管新生與骨形成耦聯(lián)SLIT3 是SLIT 蛋白家族的成員之一，其最初發(fā)現(xiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，是一種在進(jìn)化上高度保守的分泌型糖蛋白，通過(guò)與靶細(xì)胞表面的跨膜受體ROBO（Roundabout）蛋白家族結(jié)合，調(diào)節(jié)神經(jīng)元前體細(xì)胞的遷移和神經(jīng)軸突的定向生長(zhǎng)［23］。除此之外，SLIT3蛋白也在其他組織中表達(dá)，并參與調(diào)節(jié)血管新生等過(guò)程［24］。

近年研究表明，SLIT3 在“血管—成骨耦聯(lián)”過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。XU 等［4］發(fā)現(xiàn)，在骨骼系統(tǒng)內(nèi)，成骨細(xì)胞來(lái)源的SLIT3 通過(guò)與H 型血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的ROBO1 受體結(jié)合，誘導(dǎo)H 型血管新生，進(jìn)而促進(jìn)骨形成。隨后通過(guò)建立骨折和絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的動(dòng)物模型，進(jìn)一步證實(shí)SLIT3 是調(diào)節(jié)H 型血管新生與骨形成的關(guān)鍵因子，并有望作為促進(jìn)骨折愈合、治療骨質(zhì)疏松的新靶點(diǎn)。

2.5 通過(guò)CXCL9 參與血管新生與骨形成耦聯(lián)CXCL9 是趨化因子CXC 家族的一員，通常與其受體CXCR3 結(jié)合，激活下游信號(hào)通路并發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。最近，HUANG 等［25］發(fā)現(xiàn)，在骨形成和重建過(guò)程中，成骨細(xì)胞可以持續(xù)性分泌CXCL9，后者能夠與VEGF相互結(jié)合，并阻止VEGF識(shí)別內(nèi)皮細(xì)胞表面的受體，最終抑制H型血管新生與骨形成。

3 多種骨骼疾病發(fā)生及治療中H型血管的作用機(jī)制

H 型血管在“血管-成骨耦聯(lián)”中的重要作用日益引發(fā)臨床醫(yī)學(xué)工作者的關(guān)注。近年研究發(fā)現(xiàn)，H型血管在骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎等多種骨骼疾病中表現(xiàn)出異常的形態(tài)特點(diǎn)，并參與上述骨骼疾病的發(fā)生發(fā)展。此外，H 型血管調(diào)控骨形成的相關(guān)信號(hào)分子及通路也為骨骼疾病的治療提供了新的干預(yù)靶點(diǎn)。目前，針對(duì)H 型血管的靶向藥物已經(jīng)在多種動(dòng)物模型中獲得了積極的治療效果，對(duì)于將來(lái)的臨床應(yīng)用有一定的借鑒意義。

3.1 骨質(zhì)疏松癥發(fā)生及治療中H 型血管的作用機(jī)制 骨質(zhì)疏松癥是人類(lèi)最常見(jiàn)的骨骼疾病，其主要特點(diǎn)是骨密度降低、骨微結(jié)構(gòu)改變，同時(shí)骨骼脆性增強(qiáng)，使患者發(fā)生脆性骨折的風(fēng)險(xiǎn)升高。老齡和雌激素水平降低是骨質(zhì)疏松癥的主要危險(xiǎn)因素。研究發(fā)現(xiàn)，老齡小鼠和去卵巢小鼠在發(fā)生骨質(zhì)疏松的同時(shí)，骨內(nèi)H 型血管內(nèi)皮細(xì)胞、骨祖細(xì)胞和成骨細(xì)胞數(shù)目均顯著減少［6，9］。同時(shí)，多項(xiàng)研究表明人類(lèi)骨骼中也存在H 型血管，并且H 型血管的含量與骨密度具有正相關(guān)性。因此，H 型血管可以作為人類(lèi)衰老和骨質(zhì)丟失的生物標(biāo)志物［7］。不僅如此，H 型血管的發(fā)現(xiàn)也為治療骨質(zhì)疏松提供了新的靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)，在老齡和去卵巢小鼠中補(bǔ)充DFM 能夠提高骨內(nèi)H型血管的含量，促進(jìn)脛骨和股骨的骨量增加，骨祖細(xì)胞的數(shù)目增多［6］。此外，在骨質(zhì)疏松小鼠中補(bǔ)充一些小分子藥物，如肉葉蕓香堿和荷葉堿，能夠促進(jìn)破骨前體細(xì)胞表達(dá)PDGF-BB，從而誘導(dǎo)H 型血管新生，促進(jìn)新骨形成［22］。另外，一些非編碼RNA 的生物制劑，如aptamer-agomiR-195 和microRNA-136-3p Agomir，也能夠顯著緩解骨質(zhì)疏松小鼠內(nèi)H 型血管的減少與骨丟失［17］。

3.2 骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生及治療中H 型血管的作用機(jī)制 骨關(guān)節(jié)炎是常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病，其病理特點(diǎn)主要包括進(jìn)行性軟骨退變、軟骨下骨硬化、軟骨下骨血管侵犯等。研究發(fā)現(xiàn)，在骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生過(guò)程中，軟骨下骨中的H 型血管含量增多，后者能夠促進(jìn)軟骨下骨形成及重塑。此外，軟骨細(xì)胞對(duì)軟骨下H 型血管的正反饋調(diào)節(jié)進(jìn)一步促進(jìn)了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展。研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素靶蛋白復(fù)合體1（mTORC1）在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的過(guò)度激活會(huì)促進(jìn)其分泌VEGF，從而誘導(dǎo)軟骨下骨中H 型血管的形成，而新生血管又會(huì)刺激軟骨細(xì)胞表達(dá)VEGF，進(jìn)一步導(dǎo)致軟骨下骨中H 型血管形成，最終引起軟骨下骨形成。因此，抑制軟骨細(xì)胞中mTORC1的活性能夠降低軟骨下H型血管的含量，緩解骨關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展［8］。另外，一些小分子藥物，如常山酮和青蒿琥酯，也能夠抑制軟骨下H型血管形成，減輕關(guān)節(jié)軟骨退變和軟骨下骨硬化。

3.3 肌腱端病發(fā)生及治療中H 型血管作用機(jī)制肌腱端，又稱為起止點(diǎn)，是肌腱、韌帶或筋膜附著于骨骼的部位。肌腱端病的主要病理特點(diǎn)是纖維軟骨退變、骨壞死和過(guò)度的血管新生。WANG 等采用3種肌腱端病動(dòng)物模型開(kāi)展研究，發(fā)現(xiàn)TGF-β 的過(guò)度激活是引起異常骨形成和血管新生的重要因素。高濃度的活性TGF-β 能夠募集間充質(zhì)干細(xì)胞，并引起H 型血管新生、纖維軟骨鈣化和骨骼重塑。此外，在小鼠模型中，通過(guò)注射TGF-β 的中和抗體來(lái)抑制TGF-β 的活性，能夠減輕過(guò)度的血管形成并恢復(fù)異常的骨骼重塑。

3.4 異位骨化癥發(fā)生及治療中H 型血管的作用機(jī)制 異位骨化癥是指在骨骼系統(tǒng)以外形成新生骨。研究發(fā)現(xiàn)，在異位骨化癥的發(fā)生過(guò)程中，新生骨中H型血管含量增加，后者進(jìn)一步引起新骨形成。TGFβ 的過(guò)度激活能夠募集間充質(zhì)干細(xì)胞，并引起H 型血管過(guò)度新生。此外，在異位骨化癥的小鼠模型中，通過(guò)注射TGF-β 的中和抗體來(lái)抑制TGF-β 的活性，能夠延緩異位骨化癥的進(jìn)展。另外，在異位骨化癥小鼠模型的間充質(zhì)干細(xì)胞中特異性敲除TGF-β 受體，同樣能夠抑制異位骨化癥的進(jìn)展。

3.5 骨缺損修復(fù)中H 型血管的作用機(jī)制 H 型血管與骨缺損的修復(fù)過(guò)程密切相關(guān)。形態(tài)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在大鼠脛骨骨缺損修復(fù)的中晚期，H 型血管選擇性地分布于生長(zhǎng)區(qū)域的骨小梁周?chē)?，促進(jìn)新骨形成與骨重建。另外，通過(guò)使用促進(jìn)H 型血管形成的小分子藥物，可顯著改善動(dòng)物的骨缺損修復(fù)過(guò)程，如在骨折小鼠中應(yīng)用麥冬皂甙D 或重組SLIT3 蛋白，均能夠顯著提高小鼠骨折部位的H 型血管含量，加速骨折愈合［4］。此外，采用一些生物材料，如Ca-P-Mg支架和含有生物活性分子的超臨界CO2泡沫復(fù)合支架，誘導(dǎo)大鼠顱骨骨缺損部位的H型血管形成，結(jié)果促進(jìn)了顱骨的修復(fù)與再生。

綜上所述，H 型血管是一種特殊的骨組織毛細(xì)血管亞型，能夠與成骨細(xì)胞、破骨前體細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和骨祖細(xì)胞建立復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，使得血管新生與骨形成在骨骼發(fā)育及修復(fù)重建過(guò)程中實(shí)現(xiàn)相互耦聯(lián)；其調(diào)控機(jī)制涉及HIF-1 信號(hào)通路、Notch 信號(hào)通路、PDGF-BB、SLIT3 和CXCL9 等多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路。此外，H 型血管與骨質(zhì)疏松癥、骨關(guān)節(jié)炎等骨骼疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其相應(yīng)表現(xiàn)和作用機(jī)制已經(jīng)得到初步闡明，針對(duì)H 型血管的靶向藥物也在上述疾病的動(dòng)物模型中獲得了積極的治療效果。未來(lái)，對(duì)H 型血管的深入研究將進(jìn)一步加深對(duì)“血管—成骨耦聯(lián)”分子機(jī)制的理解，并有望為骨骼疾病的診治提供新的思路。