無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測對血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦的檢測效能

王奕霞 彭海山 李怡 楊潔霞 侯亞萍 郭芳芳 歐陽浩新 王東梅

(廣東省婦幼保健院 醫(yī)學(xué)遺傳中心，廣東 廣州 511442)

我國每年新增約90萬例出生缺陷兒，染色體異常是導(dǎo)致出生缺陷的最常見因素，最常見的染色體異常主要包括21-三體、18-三體、13-三體和性染色體異常，每年新增的缺陷兒已經(jīng)成為影響我國人口素質(zhì)及群體健康水平的公共衛(wèi)生問題[1,2]。在無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測(noninvasive prenatal testing，NIPT)進(jìn)入臨床應(yīng)用之前，預(yù)防出生缺陷主要靠血清學(xué)篩查和介入性產(chǎn)前診斷等，但血清學(xué)的漏診率(20%～40%)和假陽性(5%)很高[3]，而介入性產(chǎn)前診斷雖是金標(biāo)準(zhǔn)但又具有很大的風(fēng)險(xiǎn)(如宮內(nèi)感染、流產(chǎn)等)，且有部分患者存在一定的禁忌證(發(fā)熱、先兆流產(chǎn)、出血傾向以及感染未愈)而不適用。無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測是抽取孕婦外周血檢測游離胎兒DNA的技術(shù)，其特點(diǎn)具有快速，無創(chuàng)傷性，安全性高，不會對胎兒和孕婦造成任何風(fēng)險(xiǎn)，且經(jīng)國內(nèi)外研究證實(shí)具有很高的靈敏度和特異度，可高達(dá)99%[4，5]，因此NIPT作為產(chǎn)前篩查的手段受到了廣大孕婦的青睞，特別是對于血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)的孕婦來說是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，可以有效地降低介入性產(chǎn)前診斷帶來的風(fēng)險(xiǎn)，并提高產(chǎn)前篩查的效能。本研究通過選取12 342例血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)的病例，采用高通量基因測序技術(shù)分析孕婦外周血胎兒游離DNA，對NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷，并對所有納入病例進(jìn)行妊娠結(jié)局隨訪，探討無創(chuàng)產(chǎn)前基因篩查對于血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦的臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 基本資料 選取了12 342例于2015年1月至2019年12月就診于廣東省婦幼保健院，血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)的單胎孕婦(孕12～38周，年齡15～47歲)，自愿接受NIPT檢測。所有孕婦符合孕期不合并惡性腫瘤、一年內(nèi)沒有異體輸血、移植手術(shù)和細(xì)胞治療、夫婦均沒明確的染色體異常。檢測前把適應(yīng)證、局限性及可能存在的風(fēng)險(xiǎn)告知孕婦，孕婦充分知情同意后簽署知情同意書。NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦進(jìn)一步行產(chǎn)前診斷，并對所有納入研究范圍的孕婦進(jìn)行隨訪，本研究符合倫理標(biāo)準(zhǔn)并通過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 檢測方法

1.2.1 早中期血清學(xué)篩查 采用PerkinElmer公司DELFLA-1235型全自動(dòng)時(shí)間熒光分辨儀及檢測試劑盒對孕婦外周血進(jìn)行檢測：①孕早期(9～13+6周)采用血清學(xué)標(biāo)志物(PAPPA+游離β-HCG+NT)評估風(fēng)險(xiǎn)；②孕中期(15～20+6周)采用血清學(xué)標(biāo)志物(AFP+游離β-Hcg+uE3)評估風(fēng)險(xiǎn)。根據(jù)血清學(xué)篩查結(jié)果，并結(jié)合孕婦體重、年齡、孕周等因素通過唐氏綜合征風(fēng)險(xiǎn)評估軟件“LifeCycle4.0”評估風(fēng)險(xiǎn)。21-三體的臨界風(fēng)險(xiǎn)值介于1/1000～1/250，18-三體臨界風(fēng)險(xiǎn)值介于 1/1000～1/350。

1.2.2 無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測流程 采集孕婦外周血于EDTA抗凝管或游離核酸采樣管，前者4℃保存，8h內(nèi)分離血漿，后者放置室溫，3天內(nèi)分離血漿。①分離后的血漿用tianLong核酸提取儀和磁珠法游離核酸DNA提取試劑盒提取DNA；② Biomek4000全自動(dòng)化工作站和博奧晶芯測序試劑盒構(gòu)建文庫、文庫定量等操作，具體操作嚴(yán)格按照儀器和試劑盒說明書進(jìn)行；③將待測文庫混合后在Proton 高通量測序平臺檢測；④測序后，通過序列的比對、拼接等生物信息學(xué)處理，對不同染色體水平進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，識別胎兒染色體是否有異常，并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)公式得出胎兒患染色體非整倍體或拷貝數(shù)變異的風(fēng)險(xiǎn)。

2.3 染色體核型分析和隨訪 NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)的孕婦，充分告知孕婦各種方法的局限性，可能存在的風(fēng)險(xiǎn)，經(jīng)孕婦知情同意后，抽取羊水或臍血進(jìn)行染色體核型分析或者染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)檢測。對所有納入標(biāo)準(zhǔn)的孕婦進(jìn)行電話隨訪或者病例查詢，高風(fēng)險(xiǎn)孕婦隨訪至有妊娠結(jié)局出現(xiàn)，低風(fēng)險(xiǎn)孕婦則隨訪至新生兒出生后，隨訪率100%。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有計(jì)數(shù)資料用頻數(shù)和頻率表示。無創(chuàng)結(jié)果和核型或 CMA 結(jié)果比較則通過陽性預(yù)測值(positive predictive value，PPV)、靈敏度、特異度、假陽性率進(jìn)行評估。PPV=真陽性病例數(shù)/(真陽性病例+假陽性病例)；靈敏度=真陽性病例數(shù)/(真陽性病例數(shù)+假陰性病例數(shù))；特異度=真陰性病例數(shù)/(真陰性病例數(shù)+假陽性病例數(shù))；假陽性率=假陽性病例數(shù)/(假陽性病例+真陰性病例)。

3 結(jié)果

3.1 不同年齡組的分布情況 本研究血清學(xué)臨界風(fēng)險(xiǎn)病例共12 342例，經(jīng)孕婦知情同意，自行選擇進(jìn)行NIPT檢測，檢測成功率100%。NIPT提示高風(fēng)險(xiǎn)共74例，陽性率為0.60%(74/12 342)。其中<35歲組檢出56例，檢出率0.56%(56/10 043)；≥35歲組檢出18例，檢出率0.78%(18/2299),具體分布情況見表1。

表1 不同年齡組的分布情況

3.2 NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦核型結(jié)果分析 74例NIPT高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，經(jīng)知情同意，簽署知情同意書，均進(jìn)行介入性產(chǎn)前診斷，其中21-三體高風(fēng)險(xiǎn)28例，確診20例，陽性預(yù)測值為71.43%；18-三體高風(fēng)險(xiǎn)3例，確診1例，陽性預(yù)測值為 33.33%；13-三體高風(fēng)險(xiǎn)10例，確診4例，陽性預(yù)測值40.00%。性染色體異常22例，確診5例，陽性預(yù)測22.73%。缺失/重復(fù)共11例，確診4例，陽性預(yù)測值36.36%。高風(fēng)險(xiǎn)結(jié)果以21-三體高風(fēng)險(xiǎn)占較大，占37.84%(28/74)，NIPT檢測結(jié)果低風(fēng)險(xiǎn)孕婦通過電話或者病例查詢隨訪至新生兒出生，均未發(fā)現(xiàn)陽性結(jié)果。NIPT對血清學(xué)臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦的檢測效能見表2。

表2 NIPT對血清學(xué)臨界風(fēng)險(xiǎn)的檢測效能

4 討論

隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展醫(yī)療教育水平的提高,人們對于預(yù)防出生缺陷，優(yōu)生優(yōu)育的意識也越來越強(qiáng)。常見的21-三體、18-三體、13-三體染色體非整倍體是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的重要原因之一[1]。而目前臨床上缺乏有效治療手段，需要及時(shí)通過產(chǎn)前篩查和產(chǎn)前診斷的檢測，避免缺陷兒的出生。

隨著技術(shù)的發(fā)展革新,基于胎兒游離DNA的高通量測序技術(shù)因其是一種無創(chuàng)、快捷、安全有效的篩查方法而倍受孕婦關(guān)注。經(jīng)過近十年的數(shù)據(jù)積累，國際上對NIPT檢測 21-三體、18-三體及 13-三體綜合征的準(zhǔn)確性和特異性在臨床應(yīng)用中的價(jià)值已獲得高度認(rèn)可[6，7]。傳統(tǒng)血清學(xué)篩查的準(zhǔn)確率只有60%～70%[8]，極易錯(cuò)篩漏篩。介入性產(chǎn)前診斷雖準(zhǔn)確度高，但國內(nèi)外文獻(xiàn)顯示，行有創(chuàng)產(chǎn)前診斷的孕婦約2%被確診胎兒染色體異常，可因羊水穿刺或絨毛取樣造成的胎兒相關(guān)并發(fā)癥卻高達(dá)0.5%～1.0%[9]，因此會引起部分孕婦的抵觸心理，對于有流產(chǎn)、傳染病和感染風(fēng)險(xiǎn)等孕婦也不適用有創(chuàng)產(chǎn)前診斷。此外，隨著二孩政策的開放，孕婦數(shù)量增加，侵入性產(chǎn)前診斷技術(shù)因檢測時(shí)間長，技術(shù)要求高，檢測通量低，已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床的需求，因此NIPT的問世，彌補(bǔ)了目前臨床篩查的部分缺陷，為孕婦提供了多一個(gè)選擇。

本研究中，12 342例血清學(xué)臨界風(fēng)險(xiǎn)病例中，年齡<35歲共10 043例，占了81.37%，26例確診為胎兒染色體異常。在NIPT問世之前，血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦需做有創(chuàng)性產(chǎn)前診斷明確是否染色體異常，而本組人群中只有26例為染色體異常者，因此無創(chuàng)基因檢測的出現(xiàn)大大降低了穿刺率。另外一組年齡≥35歲以上共2299例，占了18.63%，8例確診為胎兒染色體異常,若按我國母嬰保健法規(guī)定，凡是年齡≥35歲的產(chǎn)婦都建議進(jìn)行產(chǎn)前診斷，2299例孕婦都需要選擇羊水或臍血穿刺，出現(xiàn)過度診斷的現(xiàn)象。同時(shí)因介入性產(chǎn)前診斷的創(chuàng)傷性，有可能會發(fā)生早產(chǎn)，宮內(nèi)感染，流產(chǎn)等風(fēng)險(xiǎn)，致使部分孕婦產(chǎn)生恐懼心理，不愿檢測，以致沒能及時(shí)診斷，導(dǎo)致異常胎兒的出生，給家庭和社會帶來巨大負(fù)擔(dān)。有學(xué)者研究顯示血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)是選擇無創(chuàng)產(chǎn)前篩查最常見的指證[4, 10],而該群體往往是染色體異常最容易漏診的人群[11]。故無創(chuàng)產(chǎn)前基因檢測技術(shù)作為二線的篩查方法，能更準(zhǔn)確地檢測出染色體非整倍體，為血清學(xué)臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦提供了一個(gè)很好的選擇，可以減少有創(chuàng)產(chǎn)前診斷數(shù)量，緩解了她們因可能要面臨介入性產(chǎn)前診斷而產(chǎn)生的心理壓力。

隨著NIPT在臨床中的發(fā)展應(yīng)用，NIPT的檢測譜也在增加，但主要用于檢測21-三體、18-三體、13-三體綜合征。本研究中NIPT檢測結(jié)果提示高風(fēng)險(xiǎn)74例，常見染色體非整倍體(21-三體、18-三體、13-三體綜合征)占了55.41%(41/74)，復(fù)合PPV為60.98%。NIPT診斷21-三體、18-三體、13-三體綜合征的靈敏度均為100%，陽性預(yù)測值分別為 71.43%、33.33%、40.00%。彭海山等[10]研究顯示，21-、18-、13-三體綜合征的靈敏度為 100%、91.67%、100.00%，陽性預(yù)測則為88.06%、78.57%、33.33%；羅麗雙等[11]報(bào)道了5756例孕婦NIPT的21-三體、13-三體、18-三體綜合征及性染色體異常的陽性預(yù)測分別為 86%、40%、25%。本研究與國內(nèi)一些研究者對NIPT在常見染色體非整倍體的診斷效能評價(jià)比較，結(jié)果相近。18-三體、13-三體陽性預(yù)測較低，可能與本研究樣本例數(shù)少有關(guān)，但其靈敏度均可達(dá)100%，特異度分別為99.94%、99.98%、99.95%。由此可知，NIPT 對 21-三體、18-三體、13-三體綜合征在不同人群中都能很好的篩檢出，可成為血清學(xué)臨界風(fēng)險(xiǎn)人群孕檢的一線篩查手段。另外本研究還分析了NIPT對性染色體異常篩查的靈敏度為100%，特異度為 99.86%，PPV為 22.73%；對染色體缺失/重復(fù)篩查的靈敏度為100%，特異度為99.94%，PPV為36.36%。NIPT可一定程度上檢測性染色體異常和染色體缺失/重復(fù)，在非目標(biāo)篩查疾病中也有一定的應(yīng)用價(jià)值。

雖然NIPT的準(zhǔn)確性高，但也存在假陽性和假陰性的局限。本研究中NIPT高風(fēng)險(xiǎn)者中有40例染色體核型分析未見異常，其合計(jì)假陽性率為0.32%，因此NIPT僅可作為高精確度的篩查方法，在臨床工作中應(yīng)做好NIPT檢測前和檢測后的咨詢工作。當(dāng)NIPT提示相關(guān)染色體異常時(shí)，后續(xù)需要結(jié)合B超排查胎兒畸形風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)一步行介入性產(chǎn)前診斷，通過染色體核型和CMA確診。

綜上所述，NIPT的臨床應(yīng)用對于血清學(xué)篩查臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦具有很好的檢測效能，降低血清學(xué)臨界風(fēng)險(xiǎn)孕婦的穿刺率，降低出生缺陷的發(fā)生。NIPT是血清學(xué)產(chǎn)前檢測技術(shù)的必要補(bǔ)充手段，在臨床工作還要做好NIPT檢測前后的咨詢工作。今后，對于如何提高非目標(biāo)染色體預(yù)測的準(zhǔn)確度，是我們的研究重點(diǎn)。