吐溫80 對麥稈中提取的纖維素同步糖化發(fā)酵制乙醇的影響

胡銀平,王瑞雪,李冰潁,曹攏財(cái),崔茂金

（河南科技學(xué)院化學(xué)化工學(xué)院,河南新鄉(xiāng)453003）

能源是當(dāng)今人類社會和經(jīng)濟(jì)持續(xù)發(fā)展的物質(zhì)基礎(chǔ),當(dāng)今社會利用的主要能源是不可再生的化石能源（煤、石油和天然氣）.隨著當(dāng)今社會經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展,日益增長的能源需求與日益枯竭的不可再生能源的矛盾日益突出,同時(shí)化石能源的開發(fā)和利用造成的環(huán)境破壞與環(huán)境污染等問題逐漸突出,預(yù)計(jì)到2030 年,全世界二氧化碳的排放量將是1990 年的兩倍多[1],因此可再生能源的開發(fā)和利用成為人們關(guān)注的焦點(diǎn).含量豐富、來源廣泛、廉價(jià)易得、可再生的生物質(zhì)資源是化石能源的替代品之一[2-3].農(nóng)業(yè)生物質(zhì)資源如麥稈、稻稈、玉米秸稈等主要由纖維素、半纖維素和木質(zhì)素組成,可以通過預(yù)處理、糖化和發(fā)酵轉(zhuǎn)化為清潔能源乙醇、氫氣、生物柴油等[4-5].

將農(nóng)業(yè)生物質(zhì)通過糖化發(fā)酵轉(zhuǎn)化為乙醇是實(shí)現(xiàn)農(nóng)業(yè)廢棄物再利用的一種重要方法.糖化發(fā)酵的反應(yīng)速度主要取決于酶解反應(yīng)速度,而纖維素酶的鈍化是瓶頸,減少纖維素酶的失活和提高纖維素酶的穩(wěn)定性是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一.農(nóng)業(yè)生物質(zhì)中木質(zhì)素的存在是影響其糖化發(fā)酵效率的關(guān)鍵因素之一.木質(zhì)素對纖維素酶解副作用主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：（1）阻礙纖維素吸附纖維素酶；（2）通過疏水相互作用、靜電引力和氫鍵相互作用不可逆地吸附纖維素酶[6-7].為了降低木質(zhì)素對纖維素酶解的副作用,可以在酶解時(shí)添加非離子表面活性劑,由于非離子表面活性劑的疏水部分可以通過疏水的相互作用和底物中殘留的木質(zhì)素結(jié)合,從而阻止木質(zhì)素對纖維素酶的吸附[8-10].糖化發(fā)酵時(shí)添加非離子表面活性劑能阻止木質(zhì)素對纖維素酶的無效吸附,從而提高糖化發(fā)酵的速度和得率,減少價(jià)格昂貴纖維素酶用量.非離子表面活性劑如吐溫系列是多種酶的激活劑,對酶活性的保護(hù)和增效具有特殊的作用.非離子表面活性劑能是酶在木質(zhì)纖維素表面的吸附從90%降低到80%,并且能提高纖維素酶的穩(wěn)定性[11].

研究將非離子表面活劑吐溫80 添加到麥稈中提取纖維素,并通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)研究了酵母接種量、酶質(zhì)量濃度、非離子表面活性劑濃度和發(fā)酵時(shí)間對同步糖化發(fā)酵影響.該研究將為農(nóng)業(yè)生物質(zhì)的高效利用提供理論參考.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

原料：麥稈于2019 年5 月收集于河南省新鄉(xiāng)市郊區(qū),自然晾干、粉碎、過50 目篩后于105 ℃下干燥至恒質(zhì)量,備用.

試劑：吐溫80 購于山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；纖維素酶購于西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；安琪耐高溫釀酒高活性干酵母購于安琪酵母股份有限公司.其他試劑均為分析純.

儀器設(shè)備：FY-SXT-02 索氏提取器,杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；JY-6A 恒溫?cái)嚢栌驮″?常州金壇良友儀器有限公司；FA1004 型分析天平,天津天有利科技有限公司；101 型電熱鼓風(fēng)干燥箱,鞏義市英峪予華儀器T；FZ102 型植物粉碎機(jī),天津市泰斯特儀器有限公司；WFJ7200 型可見分光光度計(jì),上海雙旭電子有限公司；SHA-C 型水浴恒溫振蕩器,鞏義市英峪予華儀器廠；DF-101S 型數(shù)顯集熱式磁力攪拌器,鞏義市英峪予華儀器廠.

1.2 麥稈中纖維素的提取

麥稈中纖維素的提取方法按照文獻(xiàn)[12]方法提取.

1.3 同步糖化發(fā)酵

稱取1 g 干燥的麥稈于三角瓶中,加入一定量的吐溫80,在36 ℃水浴恒溫振蕩器放置30 min.然后分別加入濃度0.1 mol/L、pH 值為4.8 的檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖溶液配制的不同濃度的纖維素酶和5 mL 不同接種量的葡萄糖活化的酵母（固液比為1∶50）,將三角瓶放入36 ℃水浴恒溫振蕩器中同步糖化發(fā)酵不同時(shí)間,振蕩速度為100 r/min,發(fā)酵結(jié)束后測乙醇含量.每組試驗(yàn)重復(fù)三次取平均值.乙醇含量的測定采用重鉻酸鉀法[13]進(jìn)行.

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶質(zhì)量濃度影響 酶質(zhì)量濃度是影響同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的一個(gè)重要因素.在發(fā)酵溫度36 ℃、吐溫80 質(zhì)量濃度1 g/L、發(fā)酵時(shí)間3 d 和酵母接種量為0.1%下研究了酶質(zhì)量濃度對麥稈中提取纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,如圖1 所示.

從圖1 可以看出,隨著酶質(zhì)量濃度的增大,乙醇的含量先增加,當(dāng)酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.8 g/L 時(shí)再繼續(xù)增加,乙醇含量增加趨于平緩.這是由于酶質(zhì)量濃度較小時(shí),產(chǎn)乙醇的效率較低；酶質(zhì)量濃度較大時(shí),由于酶的價(jià)格較高,生產(chǎn)成本相應(yīng)增大,所以選擇酶質(zhì)量濃度為0.8 g/L 進(jìn)行的單因素試驗(yàn).

2.1.2 吐溫80 質(zhì)量濃度影響 在發(fā)酵溫度36 ℃、酶質(zhì)量濃度0.8 g/L、發(fā)酵時(shí)間3 d 和酵母接種量為0.1%下研究了吐溫80 質(zhì)量濃度對麥稈中提取纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,如圖2 所示.

圖2 Tween 80 質(zhì)量濃度對乙醇含量影響Fig. 2 Effect of Tween 80 mass concentration on ethanol content

從圖2 可以看出,隨著吐溫80 質(zhì)量濃度的增大,乙醇的含量先增加,當(dāng)吐溫80 質(zhì)量濃度為0.5 g/L時(shí)再繼續(xù)增大,乙醇含量增加趨于平緩,這是由于非離子表面活性劑濃度較小時(shí),不能有效地阻止木質(zhì)素對纖維素酶的無效吸附從而使得產(chǎn)乙醇的效率較低.非離子表面活性劑濃度較大時(shí),過量的非離子表面活性劑對阻止木質(zhì)素吸附纖維素酶沒有作用,反而增加了生產(chǎn)成本,所以選擇吐溫80 質(zhì)量濃度為0.5 g/L進(jìn)行單因素試驗(yàn).

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間影響 在發(fā)酵溫度36 ℃、酶質(zhì)量濃度0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度0.5 g/L 和酵母接種量為0.1%下研究了發(fā)酵時(shí)間對麥稈中提取纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,如圖3 所示.

圖3 發(fā)酵時(shí)間對乙醇含量影響Fig. 3 Effect of fermentation time on ethanol content

從圖3 可以看出,隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,乙醇的含量先增加,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為96 h 時(shí)再繼續(xù)延長,乙醇含量增加趨于平緩.這是由于發(fā)酵時(shí)間較短時(shí),酵母不能完全利用糖化后的糖進(jìn)行發(fā)酵從而使得產(chǎn)乙醇的效率較低；發(fā)酵時(shí)間較長時(shí), 酵母已經(jīng)完全利用糖化產(chǎn)生的糖產(chǎn)乙醇從而使得產(chǎn)乙醇的效率不在提高,而發(fā)酵時(shí)能源消耗會使生產(chǎn)成本較高,所以選擇發(fā)酵時(shí)間為96 h 進(jìn)行單因素試驗(yàn).

2.1.4 酵母接種量影響 在發(fā)酵溫度36 ℃、酶質(zhì)量濃度0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度0.5 g/L 和發(fā)酵時(shí)間為96 h 下研究了酵母接種量對麥稈中提取纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇的影響,如圖4 所示.

圖4 酵母接種量對乙醇含量影響Fig. 4 Effect of yeast amount on ethanol content

從圖4 可以看出,隨著酵母接種量的增加,乙醇的含量先增加后減少,當(dāng)酵母接種量為0.1%時(shí),乙醇的含量最大.這是由于酵母接種量較少時(shí),酵母不能有效地利用糖化后的糖進(jìn)行發(fā)酵從而使得產(chǎn)乙醇的效率較低；酵母接種量較多時(shí),過量的酵母不但不能提高產(chǎn)乙醇的效率增大生產(chǎn)成本,而且可能會對糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇產(chǎn)生抑制作用.

2.2 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,為了進(jìn)一步研究麥稈中提取的纖維素最佳同步糖化發(fā)酵工藝條件,選擇了酵母接種量（A）、酶質(zhì)量濃度（B）、吐溫80 質(zhì)量濃度（C）和發(fā)酵時(shí)間（D）四個(gè)因素,每個(gè)因素下選擇了三個(gè)水平,設(shè)計(jì)了四因素三水平正交試驗(yàn),正交試驗(yàn)的設(shè)計(jì)及結(jié)果如表1 所示.

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Tab. 1 Orthogonal experiment design and results

從表1 可以看出,當(dāng)同步糖化發(fā)酵方案為A1B3C3D3（酵母接種量為0.1%、酶質(zhì)量濃度為0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度1 g/L 和發(fā)酵時(shí)間為4 d）時(shí)乙醇質(zhì)量濃度含量最高,為27.35 g/L.從表1 中的極差分析可以看出,四個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)椋好纲|(zhì)量濃度（B）＞吐溫80 質(zhì)量濃度（C）＞發(fā)酵時(shí)間（D）＞酵母接種量（A）,吐溫80 對麥稈中提取的纖維素最佳同步糖化發(fā)酵方案為A1B3C3D2（酵母接種量為0.1%、酶質(zhì)量濃度為0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度1 g/L 和發(fā)酵時(shí)間為3 d）,此時(shí)乙醇質(zhì)量濃度為27.99 g/L.表1 中乙醇含量最大值比通過極差得出的最佳條件下的乙醇含量略低,這是由于這兩個(gè)條件除了發(fā)酵時(shí)間不同外,其他三個(gè)條件完全相同,發(fā)酵時(shí)間越長,發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇增加不大,同時(shí)乙醇容易揮發(fā),乙醇含量下降.最佳條件下加非離子表面活性劑吐溫80 比未加吐溫80 乙醇含量提高了5.22%,說明非離子表面活性劑吐溫80 對麥稈中提取的纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇有促進(jìn)作用.

對表1 中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,分析結(jié)果見表2.

表2 正交試驗(yàn)方差分析Tab. 2 Variance analysis of orthogonal experiment

從表2 中的方差分析可以看出,四個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的顯著性順序?yàn)槊纲|(zhì)量濃度（B）、吐溫80質(zhì)量濃度（C）、發(fā)酵時(shí)間（D）、酵母接種量（A）,這與表1 中的極差分析結(jié)果得出的主次順序是一致的.酶質(zhì)量濃度（B）的F＞F0.05,說明其對試驗(yàn)結(jié)果影響極顯著；其他三個(gè)因素的F＜F0.1,說明其他三個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果影響均不顯著.

3 結(jié)論

通過單因素試驗(yàn)和四因素三水平的正交試驗(yàn)優(yōu)化了麥稈中提取的纖維素同步糖化發(fā)酵的條件.得出如下結(jié)論：（1）單因素試驗(yàn)研究結(jié)果表明乙醇含量隨著酶質(zhì)量濃度、吐溫80 質(zhì)量和發(fā)酵時(shí)間的增加先增大后逐漸趨于平緩,而隨著酵母接種量的增加先增大后減小.（2）正交試驗(yàn)研究結(jié)果表明四個(gè)因素對試驗(yàn)結(jié)果影響的主次順序?yàn)槊纲|(zhì)量濃度、吐溫80 質(zhì)量濃度、發(fā)酵時(shí)間、酵母接種量.吐溫80 對麥稈中提取的纖維素最佳同步糖化發(fā)酵條件為酵母接種量0.1%、酶質(zhì)量濃度0.8 g/L、吐溫80 質(zhì)量濃度1 g/L和發(fā)酵時(shí)間3 d,此時(shí)乙醇含量為27.99 g/L.最佳條件下添加非離子表面活性劑吐溫80 使乙醇含量提高了5.22%,說明非離子表面活性劑吐溫80 對麥稈中提取的纖維素同步糖化發(fā)酵產(chǎn)乙醇有促進(jìn)作用.